Cristallografia neutronica Raccolta ed elaborazione dei dati per la modellazione degli atomi di idrogeno nelle strutture proteiche

Gabriela C. Schröder; Flora Meilleur

doi:10.3791/61903

Method Article

Cristallografia neutronica Raccolta ed elaborazione dei dati per la modellazione degli atomi di idrogeno nelle strutture proteiche

DOI:

10.3791/61903

⸱

December 1st, 2020

Gabriela C. Schröder¹^,² , Flora Meilleur¹^,²

¹Department of Molecular and Structural Biochemistry, North Carolina State University, ²Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cristallografia delle proteine neutroniche è una tecnica strutturale che consente la localizzazione di atomi di idrogeno, fornendo così importanti dettagli meccanicistici della funzione proteica. Presentiamo qui il flusso di lavoro per il montaggio di un cristallo proteico, la raccolta dei dati di diffrazione neutronica, il perfezionamento della struttura e l'analisi delle mappe di densità della lunghezza dello scattering neutronico.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cristallografia a neutroni è una tecnica strutturale che consente di determinare le posizioni degli atomi di idrogeno all'interno di macromolecole biologiche, fornendo informazioni meccanicamente importanti sugli stati di protonazione e idratazione senza indurre danni da radiazioni. La diffrazione a raggi X, al contrario, fornisce solo informazioni limitate sulla posizione degli atomi di luce e il fascio di raggi X induce rapidamente danni da radiazioni di cofattori fotosensibili e centri metallici. Qui è presentato il flusso di lavoro impiegato per le beamline IMAGINE e MaNDi presso l'Oak Ridge National Laboratory (ORNL) per ottenere una struttura di diffrazione neutronica una volta che un cristallo proteico di dimensioni adeguate (> 0,1 ^mm3) è stato coltivato. Dimostriamo il montaggio di cristalli proteici idrogenati in capillari di quarzo per la raccolta di dati di diffrazione neutronica. Viene inoltre presentato il processo di scambio di vapore dei cristalli montati con tampone contenente _D2O per garantire la sostituzione degli atomi di idrogeno nei siti scambiabili con il deuterio. L'incorporazione del deuterio riduce lo sfondo derivante dalla dispersione incoerente degli atomi di idrogeno e impedisce la cancellazione della densità causata dalla loro lunghezza di diffusione coerente negativa. Le strategie di allineamento dei campioni e di raccolta dei dati sulla temperatura ambiente sono illustrate utilizzando la raccolta di dati quasi-Laue presso IMAGINE presso il reattore isotopico ad alto flusso (HFIR). Inoltre, il montaggio di cristalli e il congelamento rapido in azoto liquido per la raccolta di crio-dati per intrappolare intermedi di reazione labile sono dimostrati presso lo strumento MaNDi time-of-flight presso la Spallation Neutron Source (SNS). Verrà inoltre affrontata la preparazione dei file di dati di coordinate e diffrazione del modello e la visualizzazione delle mappe di densità della lunghezza di diffusione dei neutroni (SLD). Infine verrà discusso il raffinamento della struttura contro i soli dati dei neutroni o contro i dati congiunti a raggi X/neutroni per ottenere una struttura a tutti gli atomi della proteina di interesse. Il processo di determinazione di una struttura neutronica sarà dimostrato utilizzando cristalli della polisaccaride litica monoossigenasi Neurospora crassa LPMO9D, una metalloproteina contenente rame coinvolta nella degradazione dei polisaccaridi recalcitranti tramite scissione ossidativa del legame glicosidico.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cristallografia macromolecolare a neutroni è una tecnica che fornisce una finestra unica sulla struttura e sulla chimica sottostante delle proteine. Concettualmente simile alla diffrazione a raggi X, la diffrazione neutronica fornisce dettagli atomistici della struttura macromolecolare, tuttavia, l'interazione dei neutroni con i nuclei consente la localizzazione degli atomi di luce, spesso difficili da rilevare con la diffrazione a raggi ^X1. Durante la diffrazione dei raggi X, i raggi X si diffondono dalla nube di elettroni, rendendo gli atomi di luce come l'idrogeno (H) scarsamente visibili nelle mappe di densità elettronica che non hanno una risoluzione vicina a quella sub-Ångström2. Al contrario, l'intensità di scattering dei neutroni dipende da interazioni complesse con il nucleo, con isotopi dello stesso elemento che mostrano lunghezze di scattering diverse. Pertanto, gli atomi leggeri e i loro isotopi, come l'idrogeno (^1H) e il deuterio (^2H o D), hanno una visibilità paragonabile agli atomi di carbonio, azoto e ossigeno nella mappa della densità di lunghezza di diffusione dei neutroni (SLD). Inoltre, poiché la grandezza dello scattering neutronico è indipendente dal numero di elettroni, la dispersione dagli elementi leggeri non è oscurata da elementi pesanti quando sono in prossimità l'uno dell'altro, come si osserva nello scattering a raggi X. La maggiore visibilità di H e del suo isotopo D quando si impiega la diffrazione neutronica fornisce preziose informazioni sullo stato di protonazione di residui, cofattori e ligandi cataliticamente importanti e aiuta l'orientamento delle molecole d'acqua, rivelando importanti informazioni sui meccanismi catalitici e sulla chimica delle ^proteine3. La diffrazione neutronica offre anche il vantaggio di essere una tecnica non distruttiva, particolarmente adatta a campioni biologici sensibili alla ionizzazione come proteine con centri metallici o cofattori redox fotosensibili2. L'obiettivo principale di questo articolo è fornire una panoramica del flusso di lavoro per ottenere una struttura cristallina della proteina neutronica di alta qualità. Rimandiamo il lettore interessato a Podjarny et ^al.4, ^Blakeley5, Blakeley et ^al.6 e O'Dell et ^al.3 per un'eccellente panoramica della diffrazione delle proteine neutroniche e Ashkar et ^al.7 per ulteriori applicazioni dello scattering neutronico.

I neutroni sono generati principalmente durante le reazioni nucleari impiegando uno dei due processi: fissione nucleare alle sorgenti del reattore o spallazione a fonti basate su ^{acceleratori8}. Le sorgenti di reattori forniscono un fascio di neutroni continuo impiegando la fissione nucleare dell'isotopo ^235U mentre le sorgenti di neutroni di spallazione producono un fascio di neutroni pulsati bombardando un bersaglio, ad esempio un metallo liquido come il mercurio, con ^protoni9. L'Oak Ridge National Laboratory (ORNL) di Oak Ridge, Tennessee, ospita sia una sorgente di neutroni allo stato stazionario presso l'High Flux Isotope Reactor (HFIR) che una sorgente pulsata a 60 Hz presso la Spallation Neutron Source (SNS). La beamline IMAGINE, situata presso l'HFIR, è un diffrattometro a neutroni ottimizzato per macromolecole biologiche (Figura supplementare 1)¹⁰. IMAGINE impiega un rivelatore di piastre di immagine neutronica per misurare i dati quasi-Laue utilizzando una passa di banda stretta nell'intervallo di 2,8 – 4,5 Å da cristalli singoli con bordi di cella unitari < 150 Å. Il Macromolecular Neutron Diffractometer (MaNDi), situato presso l'SNS, è un diffrattometro a neutroni Laue a tempo di volo (TOF) dotato di un daf (sferical detector array frame) (Figura supplementare 2)¹¹. MaNDi misura i dati provenienti da singoli cristalli con bordi di celle unitarie nell'intervallo 10 – 300 Å impiegando una larghezza di banda sintonizzabile a 2 Å-lunghezza d'onda compresa tra 2,0 e 6,0 ^Å12.

Il processo di generazione dei neutroni è ad alta intensità energetica, con conseguenti flussi di fascio di neutroni relativamente deboli quando confrontati con i flussi di fasci di raggi X a sorgenti di ^{sincrotrone13}. Per garantire un rapporto segnale-rumore sufficiente durante la raccolta dei dati, è necessario coltivare cristalli di dimensioni e qualità ^adeguate14. Tipicamente, i cristalli con volumi > 0,1 ^mm3 sono necessari per raccogliere dati con statistiche ^adeguate15. Oltre ai flussi più bassi, devono essere prese in considerazione le proprietà intrinseche dell'interazione tra neutroni e nuclei ^campione16. La lunghezza di diffusione dei neutroni differisce per gli isotopi dello stesso elemento, una proprietà che può essere sfruttata vantaggiosamente nello scattering neutronico ad angolo piccolo (SANS) per mascherare o evidenziare le regioni di un campione – un processo noto come corrispondenza di ^contrasto17. Negli esperimenti di diffrazione, la lunghezza di scattering neutronica coerente negativa di H (-3.741 fm per ^1H) può portare alla cancellazione delle caratteristiche della mappa della densità di scattering neutronico poiché le lunghezze di scattering neutronico coerenti di altri atomi biologicamente rilevanti, tra cui carbonio (6.6511 fm per ^12C), azoto (9.37 fm per ^14N), ossigeno (5.803 fm per ^16O), fosforo (5.13 fm per ^31P) e zolfo (2.804 fm per ^32S), sono positivi (Tabella 1)^12,14. Inoltre, la grande lunghezza di scattering incoerente di H (25.274 fm), aumenta lo sfondo durante la raccolta dei dati, ostacolando la qualità del set di dati e compromettendo la risoluzione dei ^dati7. Per aggirare queste limitazioni introdotte da H è necessario, per la diffrazione neutronica, scambiare H con il suo isotopo deuterio, ^2H(D), che ha una lunghezza di scattering neutronica coerente positiva (6.671 fm) e una lunghezza di scattering incoerente significativamente inferiore (4.04 fm)¹⁹. Ciò può essere ottenuto mediante perdeuterazione, un processo in cui la proteina è espressa da organismi cresciuti in mezzi completamente deuterati che garantiscono la completa incorporazione di D nei siti ^H20. È anche possibile deuterare parzialmente la proteina sostituendo H con D esclusivamente nei siti scambiabili (gruppi titolabili) mentre i siti legati al carbonio non scambiabili rimangono ^idrogenati21. Ciò può essere ottenuto mediante la crescita di cristalli proteici idrogenati in liquore madre ^deuterato22. Più comunemente, tuttavia, lo scambio H/D di proteine idrogenate viene eseguito mediante scambio di vapore in seguito alla crescita di cristalli opportunamente grandi in un buffer a base di _H2O23. In questi casi, i cristalli sono montati in un capillare di quarzo e bilanciati a vapore con un liquore madre a base di _D20.

I flussi di neutroni limitati alle sorgenti di neutroni si traducono in tempi di raccolta dei dati più lunghi, che vanno da giorni a diverse ^settimane24. All'ORNL, sia IMAGINE che MaNDi impiegano una banda passante a lunghezza d'onda stretta nell'intervallo 2-6 Å per ottimizzare la raccolta dei ^dati25. I dati possono essere raccolti a temperatura ambiente o a criotemperatura. La raccolta di crio-dati può potenzialmente migliorare la qualità dei dati e apre la possibilità di intrappolare gli intermedi catalitici. Dopo la raccolta dei dati di diffrazione neutronica, un set di dati a raggi X viene in genere raccolto sullo stesso cristallo alla stessa temperatura o su un cristallo coltivato in condizioni ^identiche26. La raccolta dei dati alla stessa temperatura consente di eseguire il perfezionamento della struttura sia sui dati a raggi X che su quelli neutronici, prevenendo potenziali artefatti indotti dalla temperatura, come cambiamenti nella visibilità e nella posizione delle acque o l'occupazione di residui con conformazioni ^{alternative27}. Il perfezionamento dei dati dei neutroni a raggi X congiunti aumenta il rapporto dati-parametri e offre il vantaggio di consentire di perfezionare le coordinate della spina dorsale proteica rispetto ai dati a raggi X, mentre i dati di diffrazione neutronica vengono utilizzati per perfezionare la posizione degli atomi H/^D28. Ciò è particolarmente utile quando si utilizzano campioni parzialmente deuterati, in cui è presente la cancellazione della densità dovuta ad atomi di H in siti non scambiabili sulla proteina. Sebbene il numero di strutture a raggi X superi di gran lunga il numero di strutture neutroniche depositate nella Protein Data Bank (PDB), i pacchetti software inizialmente progettati per il perfezionamento dei dati a raggi X sono stati ampliati per includere anche i dati sui neutroni3,29,30. Dopo la raccolta dei dati, i modelli possono essere perfezionati utilizzando pacchetti di perfezionamento come phenix.refine, CNSsolve (nCNS) o SHELXL28,31,32,33. Durante il processo di raffinamento, le mappe di densità di diffusione dei neutroni possono essere visualizzate per il montaggio manuale utilizzando ^COOT34. Seguendo la soluzione della struttura, le coordinate e i file di dati di diffrazione di neutroni e/o raggi X possono essere sottoposti al PDB, che convaliderà e depositerà il modello, rendendolo disponibile per l'accesso pubblico18,29,30.

L'analisi strutturale delle proteine è un approccio sfaccettato in cui vengono utilizzate numerose tecniche per sondarne la funzione e il ^meccanismo35. La cristallografia a proteine neutroniche fornisce preziose informazioni chimiche per espandere e integrare i risultati di ulteriori studi come la diffrazione a raggi X, la spettroscopia, la risonanza magnetica nucleare (NMR) o la diffrazione elettronica a microcristalli (microED)³⁶. La diffrazione delle proteine neutroniche è posizionata in modo univoco per fornire informazioni sui meccanismi enzimatici, poiché gli atomi di H sono fondamentali per la loro chimica. L'assenza di danni da radiazioni indotti dai neutroni ne fanno una sonda eccezionalmente adatta allo studio delle ^{metalloproteine37}. Presentiamo qui un esempio rappresentativo del processo di diffrazione delle proteine neutroniche dalla preparazione del campione alla raccolta, al perfezionamento e all'analisi dei dati (Figura 1). Cristalli di dimensioni sufficienti per esperimenti di diffrazione neutronica sono stati coltivati della metalloproteina Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D è una metalloproteina contenente rame coinvolta nella degradazione della cellulosa recalcitrante mediante inserimento di atomi di ossigeno al legame glicosidico38,39. Il sito attivo di NcLPMO9D contiene un centro di rame mononucleare all'interno di un caratteristico "parentesi istidinico" composto dall'istidina N-terminale e da una seconda istidina conservata (Figura supplementare 3)⁴⁰. L'N-terminale degli LPMO fungini è metilato, ma la modifica post-transitoria non si verifica durante l'espressione ricombinante nel lievito. Nello stato di riposo NcLPMO9D, il centro di rame è presente in uno stato di ossidazione ^Cu2+ e viene attivato mediante riduzione di un singolo elettrone a ^Cu1+, consentendo all'ossigeno molecolare di legarsi e di essere attivato riducendosi rapidamente a una specie di ^{superossido41,42}. La reazione complessiva di NcLPMO9D richiede un'ulteriore aggiunta di un elettrone e due protoni per formare il prodotto polisaccaride ^{idrossilato43}. L'identità delle specie di ossigeno attivato responsabili dell'estrazione dell'atomo di idrogeno (HAA) dal substrato polisaccaride non è stata identificata e sono attualmente in corso studi strutturali e ^{computazionali intensivi44,45}. Data la chimica redox nel sito attivo di NcLPMO9D, la mitigazione dei danni da radiazioni è particolarmente pertinente. Illustriamo qui la raccolta di dati di temperatura ambiente e criotemperatura su cristalli NcLPMO9D per determinare la struttura NcLPMO9D nello stato di riposo e nella forma ridotta attivata, ^{rispettivamente46}. L'accento sarà posto sul montaggio di cristalli proteici, sulla configurazione dello strumento beamline per la raccolta dei dati, sulla preparazione dei dati e dei file di coordinate e sulle fasi di perfezionamento necessarie per modellare una struttura neutronica all-atom.

Protocol

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1. Valutazione delle dimensioni del cristallo

Misurare la dimensione dei cristalli utilizzando un microscopio dotato di luce normale e polarizzata. Selezionare cristalli con un volume minimo di ~0,1 ^mm3 (Figura supplementare 4).
Etichettare i pozzetti con cristalli sufficientemente grandi e notare le condizioni di cristallizzazione utilizzate per generare questi cristalli.

2. Preparazione del tampone di cristallizzazione deuterato

Sciogliere i componenti del buffer di cristallizzazione in _D2O per generare un buffer di cristallizzazione deuterato.
Regolare il pH del tampone calcolando il pD della soluzione utilizzando la seguente equazione:
(1)
dove _pHmeas è il pH misurato con un elettrodo di vetro standard. Il pH originale del tampone di cristallizzazione NcLPMO9D era 6.0, quindi useremo un _pHmeas di 5.6 per il tampone di cristallizzazione deuterato a pD 6.0.
Immergere l'elettrodo del pHmetro in _D2O per dieci minuti prima dell'uso (Figura supplementare 5).
Regolare il _pHmeas a 5,6 utilizzando il NaOD di base o il DCl acido.

3. Raccolta dei cristalli

Posizionare vetrini rotondi siliconati da 22 mm accanto al vassoio di cristallizzazione da cui verranno raccolti i cristalli. Utilizzare un vetrino pulito per cristallo (Figura 2A).
Aprire la scatola sandwich sigillata contenente i cristalli proteici nella lastra di vetro siliconato a 9 pozzetti di grande volume.
Rimuovere 10-20 μL dalla soluzione del serbatoio di cristallizzazione con una micropipetta e posizionare la soluzione sul vetrino (Figura 2B).
Raccogliere il cristallo utilizzando un microloop di dimensioni appropriate e posizionare il cristallo nella goccia di soluzione del serbatoio sul vetrino per rimuovere i detriti che vengono spesso raccolti insieme al cristallo (Figura 2C e Figura 2D).
NOTA: Sarà necessario lavorare rapidamente poiché le goccioline di piccolo volume potrebbero evaporare. I cristalli raccolti sono anche a rischio di essiccazione se esposti all'atmosfera. Potrebbe essere necessario aggiungere una soluzione di riserva alla goccia proteica per evitare che i cristalli si secchino in piccoli volumi di goccia di cristallizzazione.

4. Montaggio in cristallo

NOTA: i protocolli di montaggio capillare variano in base alle preferenze degli sperimentatori. Per evitare danni ai cristalli, i capillari che devono essere accorciati devono essere segnati con una pietra da taglio o carta vetrata per garantire una rottura regolare.

Riempire un'estremità di un capillare di quarzo di 2 mm di diametro 50 mm di lunghezza con tampone di serbatoio per azione capillare o pipettando direttamente ~ 10 μL di tampone del serbatoio nel capillare (Figura 3A).
NOTA: Gli utenti sono incoraggiati a fare uso di tubi capillari al quarzo perché, oltre alla sua resistenza meccanica, è essenziale limitare l'assorbimento del fascio di neutroni e i contributi di fondo inferiori dal capillare. I capillari di vetro introducono uno sfondo elevato e assorbono neutroni, compromettendo la qualità dei dati.
Posizionare delicatamente il cristallo nel tampone del serbatoio nel capillare di quarzo utilizzando il circuito di montaggio (Figura 3B e Figura 3C).
Picchiettare delicatamente il tubo per spostare il buffer del serbatoio e il cristallo immerso in esso lungo il capillare (Figura 3D).
Posizionare il cristallo non più vicino di 13,5 mm e non più di 27,5 mm da un'estremità del capillare; questa sarà l'estremità di montaggio (Figura supplementare 6).
Aspirare la soluzione tampone attorno al cristallo utilizzando una punta di pipetta lunga e sottile, lasciando il cristallo leggermente bagnato. Non toccare il cristallo (Figura supplementare 7A).
Asciugare le pareti dei capillari con uno stoppino di carta sottile (Figura supplementare 7B).
Pipetta 20-50 μL di soluzione tampone deuterata all'estremità del capillare opposto all'estremità di montaggio (Figura 4A).
Sciogliere la cera d'api con una "bacchetta" termica e inserire delicatamente il capillare in questa cera d'api fusa. Ripetere l'operazione fino a formare una guarnizione ermetica (Figura 4B e Figura 4C).
Pipettare una piccolissima quantità di tampone deuterato, circa 5 μL nell'estremità di montaggio del capillare per fungere da "dissipatore di calore" per la cera d'api calda. Immergere questa estremità in cera d'api fusa per generare una tenuta ermetica come descritto in precedenza per formare un capillare sigillato su entrambe le estremità (Figura 4D).
Ispezionare il cristallo montato utilizzando un microscopio dopo il montaggio per garantire l'ermeticità (Figura 4E).
Fissare con cura i cristalli montati con salviette Kim in un contenitore come un tubo Falcon da 15 ml o Petri Dish e conservarli orizzontalmente alla temperatura alla quale i cristalli sono stati coltivati (Figura 4F).

5. Scambio di vapore

Sostituire il tampone deuterato con un tampone fresco due giorni dopo il montaggio del cristallo.
Sciogliere il sigillo di cera più lontano dal cristallo con un anello di riscaldamento e utilizzare una pipetta e stoppini di carta per rimuovere il tampone.
Riempire il capillare con 20-50 μL di soluzione tampone deuterata e sigillare con cera.
Ripetere la sostituzione del tampone deuterato altre due volte a intervalli di quattro giorni per assicurarsi che lo scambio di vapore del tampone deuterato sia completo e consentire lo scambio di vapore per almeno due settimane.

6. Diffrazione delle proteine neutroniche

NOTA: I lettori interessati alle specifiche della linea di fascio IMAGINE sono invitati a consultare Meilleur et al. 2013, Meilleur et al. 201810,47.

Raccolta dei dati sulla temperatura ambiente presso la beamline IMAGINE di HFIR
1. Montaggio del campione
  1. Fissare il cristallo montato capillarmente sul goniometro con stucco.
  2. Montare il goniometro sul bastoncino campione e centrare il cristallo nel raggio utilizzando la stazione di allineamento off-line.
  3. Fissare il bastoncino del campione sullo stadio del campione dello strumento (Figura supplementare 1B).
  4. Assicurarsi che la gabbia sperimentale sia libera e aprire l'otturatore della beamline per la raccolta dei dati dei neutroni.
2. Raccolta dei dati
  1. Aprire il programma di acquisizione dati sul computer di controllo beamline e fare clic sulla scheda Impostazioni per impostare la strategia di raccolta dati. In Parametri esperimento digitare il nome dell'esempio accanto a Nome esempio e immettere il numero della proposta accanto a Proposta. In Denominazione immagine selezionare Modello cartella e impostare la destinazione per i dati acquisiti da salvare, quindi selezionare Prefisso immagine e digitare il nome del fotogramma pertinente (Figura supplementare 8).
  2. Aprire la GUI ottica e fare clic su 2.78 per _λmin e 4.78 per _λmax per impostare l'intervallo quasi-Laue per la raccolta dei dati (Figura supplementare 9).
  3. Passare alla scheda Raccogli e in Parametri di scansione successivi inserire il tempo di esposizione in secondi in Esposizione, il numero di fotogrammi in N fotogrammi e gli angoli per la raccolta dei dati in Δ φ/Fotogramma. Assegnare un nome al fotogramma da raccogliere in Prefisso immagine e avviare la raccolta dati facendo clic sul pulsante Avvia scansione (Figura supplementare 10).
  4. I neutroni diffratti saranno rilevati dall'Image Plate Detector. Al termine di ogni esposizione, verrà letta la targhetta dell'immagine e visualizzato il pattern sulla GUI di acquisizione dati (Figura supplementare 11).
  5. I frame sono indicizzati, integrati, normalizzati in lunghezza d'onda e ridimensionati utilizzando Lauegen, ^Lscale50 e Scala dallo scienziato beamline responsabile, che fornirà all'utente il file di riflessione unito dopo la raccolta dei dati (Figura supplementare 12).
    NOTA: La raccolta dei dati sia a IMAGINE che a MaNDi sarà eseguita in modalità quasi-Laue, utilizzando la metodologia e il software sviluppati per la raccolta dei dati di diffrazione di Laue come sviluppato da Helliwell et ^al.48 e Nieh et ^al.49.
  6. Raccogliere un set di dati a raggi X corrispondente sullo stesso cristallo alla stessa temperatura dopo la raccolta dei dati di diffrazione neutronica (Figura supplementare 13).
    NOTA: Un cristallo cresciuto dalla stessa goccia o nelle stesse condizioni di cristallizzazione può anche essere utilizzato per raccogliere dati di diffrazione a raggi X per il raffinamento congiunto neutroni/raggi X.
Raccolta di dati criologici presso la beamline MaNDi presso l'SNS
NOTA: I lettori interessati alle specifiche della linea del fascio sono incoraggiati a consultare Coates et al. (2015), Meilleur et al. 201810,11.
1. Montaggio del campione
  1. Preparare la soluzione di ammollo di ascorbato deuterato per la riduzione dei cristalli e del crioprotettore deuterato. Posizionare 20 μL di gocce di ciascuna di queste soluzioni in pozzetti di caduta seduti in una piastra di cristallizzazione.
    NOTA: La soluzione crioprotettiva è di solito il crioprotettore che si è dimostrato efficace per la raccolta di dati di diffrazione a raggi X a criotempera preparati in _D2O. Questo crioprotettore può essere ulteriormente ottimizzato (ad es. concentrazione) per la raccolta di dati sui neutroni, se necessario.
  2. Selezionare i loop per il montaggio del campione e fissarli a una criobase magnetica seguendo le linee guida MaNDi (Figura supplementare 14).
  3. Riempire una schiuma cryo-Dewar con azoto liquido. Posizionare un manicotto di crioprotezione metallica all'interno dell'azoto liquido per raffreddare (Figura supplementare 15A).
  4. Rimuovere i tappi di cera da entrambe le estremità del capillare e toccare il capillare per spostare il tappo tampone in modo che il cristallo montato sia immerso nel tampone. Lavare il cristallo nella goccia di soluzione del serbatoio da 20 μL nel pozzetto della goccia seduta (Figura supplementare 15B e Figura supplementare 15C).
    NOTA: Questo passaggio non è necessario se lo scambio H/D è stato eseguito mediante equilibratura delle gocce di cristallizzazione contro tampone deuterato o mediante immersione diretta del cristallo in tampone deuterato.
  5. Immergere il cristallo nella soluzione di ammollo dell'ascorbato per due ore. Montare il cristallo in un microloop collegato a una criobase magnetica. Immergere il cristallo montato nel crioprotettore per 10 secondi e immergere il cristallo e il criomontaggio nell'azoto liquido per congelarlo (Figura supplementare 15D).
  6. Una volta congelato il cristallo, utilizzare pin pin pin pre-raffreddato e montare il cristallo sullo stadio di campionamento MaNDi dotato di un crio-flusso. Aprire delicatamente il pin crio pin e assicurarsi che il cristallo rimanga nel crio-flusso (Figura supplementare 2C).
2. Raccolta dei dati
  1. Aprire il software di raccolta dati in cui le informazioni dell'esperimento saranno state popolate automaticamente.
  2. Fare clic sul centro del cristallo per centrarlo con il goniometro controllato dal computer (Figura supplementare 16).
  3. In Tabella, impostare la strategia di raccolta dei dati inserendo gli angoli per la raccolta dei dati sotto "phi" e l'esposizione totale del fascio di neutroni per fotogramma in Valore (Figura supplementare 17).
  4. Fare clic su Invia per avviare la raccolta dei dati.
  5. Man mano che i dati vengono raccolti, il neutrone diffratto sarà visibile (Figura supplementare 17). I punti di diffrazione diventeranno più chiari all'aumentare del tempo di esposizione, migliorando il rapporto segnale-rumore (Figura 5).
  6. I fotogrammi saranno indicizzati, integrati, normalizzati a lunghezza d'onda e ridimensionati utilizzando Mantid e Lauenorm dallo scienziato beamline responsabile, che fornirà all'utente il file di intensità unito dopo la raccolta dei ^dati51.

7. Affinamento della struttura

Affinamento dei dati congiunti a raggi X e neutroni
1. Preparazione della struttura
  1. Perfezionare i dati a raggi X per ottenere una struttura proteica utilizzando il pacchetto software phenix.refine e Coot per la costruzione manuale per ottenere una struttura completa.
  2. Aprire CCP4 e selezionare il programma Converti in/modifica/estendi MTZ per abbinare i flag di dati privi di R dei dati neutronici a quelli dei dati a raggi X. Selezionare questa opzione per importare il file di riflessione in formato MTZ . Sotto In upload il file MTZ neutron ottenuto e caricare il file mtz a raggi X sotto Import FreeR MTZ (Figura supplementare 18). Assegnare un nome al nuovo file MTZ in Out e fare clic su Esegui.
  3. Aprire il pacchetto software Phenix e fare clic su ReadySet in Strumenti di perfezionamento. Accanto al file PDB caricare il file di coordinate PDB raffinato rispetto ai dati a raggi X. Selezionare Aggiungi idrogeno al modello se assente e selezionare H/D nei siti intercambiabili, H altrove dal menu a discesa. Selezionare Aggiungi deuterio alle molecole di solvente e lasciare le opzioni rimanenti sui valori predefiniti (Figura supplementare 19A).
    NOTA: se si utilizza una proteina perdeuterata, selezionare l'opzione Aggiungi idrogeno al modello se assente e selezionare H/D in siti scambiabili, D altrove.
2. Affinamento della struttura
  1. Aprire il programma phenix.refine nella scheda Raffinamento per impostare il perfezionamento utilizzando sia i dati a raggi X che i dati dei neutroni. Nella scheda Configura in File di input immettere il file PDB dalla struttura a raggi X che è stata elaborata con ReadySet e il file di restrizione CIF necessario per tutti i ligandi pertinenti. Carica il file MTZ dai dati dei neutroni con i flag Rfree assegnati usando CCP4 e assegnalo come "Dati neutroni" e "Neutron R-free" sotto l'intestazione Tipo di dati. Carica il file MTZ dai dati a raggi X e assegnalo come "Dati a raggi X" e "Senza raggi X R" sotto l'intestazione Tipo di dati. Il gruppo Spazio e le etichette Dati verranno popolati automaticamente una volta caricati i dati (Figura supplementare 19B).
    NOTA: quando si esegue il perfezionamento e si immettono le informazioni sul cristallo, utilizzare la cella unitaria determinata dai dati a raggi X.
  2. Nella scheda Configura nelle impostazioni di perfezionamento mantenere la strategia di perfezionamento standard. Aumentare il numero di cicli a cinque (Figura supplementare 20)
  3. Selezionare Tutti i parametri, fare clic su Avanzate e selezionare Idrogeno.... Modificare il modello di raffinamento dell'idrogeno in individuale e disattivare l'adp Force riding (Figura supplementare 20).
  4. Selezionare Tutti i parametri e aprire l'opzione Cerca parametri . Cercare la parola nucleare e selezionare Usa le distanze nucleari per X-H/D (Figura supplementare 20).
  5. Selezionare Esegui per avviare il perfezionamento.
3. Edificio modello
  1. Dopo il perfezionamento in Phenix, fare clic su Apri in Coot nella scheda Risultati per visualizzare la densità elettronica dei raggi X e le mappe SLD dei neutroni. Fare clic sulla scheda Display Manager e in Mappe fare clic su Elimina mappa accanto alle mappe _neutron per rimuovere le mappe neutroniche (Figura supplementare 21). Fare clic su File > Apri MTZ, mmCIF fcf o phs.... Selezionare i file di perfezionamento correnti e aprire il file con estensione mtz. Per entrambe le opzioni Ampiezze e Fasi selezionare i dati 2FOFC WT_no_fill_neutron dal menu a discesa. Ripeti questa operazione e apri i dati _FOFC WT_neutron. Aprire Display Manager e passare a Scroll per le mappe 2FOFCWT a neutroni e raggi X, quindi scorrere per ridurre l'rmsd delle mappe _2FOFCWT a 1.00 (Figura supplementare 21). Attivare Scroll per le mappe _FOFCWT a neutroni e raggi X e scorrere per ridurre l'rmsd delle mappe _FOFCWT a 3.00.
  2. Eseguire un'ispezione visiva dei residui per determinare se il modello si adatta ai dati. Determinare l'orientamento corretto e l'occupazione H/D di tutti i siti intercambiabili analizzando i picchi della mappa della densità delle differenze. Ciò include i gruppi ossidrilici di serine, treonine e tirosine; l'azoto di istidina, glutammina, asparagina e lisina; il sulfidrile della cisteina; i gruppi carbossilici di aspartato e glutammato; gruppi ammidici dorsali; ligandi; cofattori ed eventuali residui potenzialmente funzionalizzati (Figura 6).
  3. Riorientare le molecole d'acqua in base alla densità dei neutroni e alle interazioni del legame idrogeno ruotandole utilizzando la funzione Rotate Translate Zone/Chain/Molecule (Figura supplementare 22A e Figura supplementare 22B). Regolate le posizioni dei siti intercambiabili H/D dei residui proteici utilizzando lo strumento Modifica angoli Chi e la funzione Ruota zona/catena/molecola (Figura supplementare 22C e Figura supplementare 22D).
Raffinamento della struttura – raffinamento dei soli dati dei neutroni
1. Preparazione della struttura
  1. Aprire Phenix e selezionare "Molecular Replacement" e selezionare "Phaser-MR (full featured)" per derivare la fase delle intensità scalate fornite dallo scienziato dello strumento mediante sostituzione molecolare per generare un file di coordinate di partenza in formato pdb. Inserisci la struttura pdb iniziale nella scheda "Input e opzioni generali " e completa le opzioni Ensemble, Contenuti ASU e Procedura di ricerca .
  2. Aprire Strumenti modello e selezionare Strumenti PDB. Inserire il file pdb come file di input. Passare alla scheda Opzioni e in Rimuovi selezione atomi selezionare i nomi del solvente, dei ligandi, dei cofattori e dei metalli. Questo rimuove tutte le molecole d'acqua, i cofattori, i ligandi e gli ioni metallici per generare un modello minimo. Inoltre, selezionate Rimuovi conformatori alternativi dal modello (Figura supplementare 23).
  3. Selezionare Perfezionamento in Phenix e aprire ReadySet. Immettere il file di coordinate pdb modificato accanto al file PDB. Selezionare Aggiungi idrogeno al modello se assente e selezionare H/D nei siti scambiabili, H altrove dal menu a discesa delle opzioni di raffinamento dei neutroni (Figura supplementare 23).
2. Affinamento della struttura
  1. Aprire il programma phenix.refine nella scheda Raffinamento in Phenix. Nella scheda Configura immettere il file PDB che è stato elaborato con ReadySet nella casella File di input . Nella casella File di input caricare il file MTZ dai dati dei neutroni e assegnarlo come dati a raggi X e R-free a raggi X sotto la colonna Tipo di dati anche se si tratta di dati neutroni. La configurazione di perfezionamento impostata nella fase successiva verrà utilizzata per trattare il file di riflessione come dati di neutroni. Il gruppo Spazio e le etichette Dati verranno popolati automaticamente una volta caricati i dati (Figura supplementare 24A).
  2. Nella scheda Configura nelle impostazioni di perfezionamento mantenere la strategia di perfezionamento standard. Aumentare il numero di cicli a cinque. In Altre opzioni selezionare neutrone dal menu a discesa Tabella di dispersione . Deselezionare l'opzione Aggiorna acque (Figura supplementare 24B).
  3. Selezionare Tutti i parametri>Advanced>Hydrogens. Nella nuova finestra selezionare Individuale dal menu a discesa Modello di raffinamento dell'idrogeno e disattivare l'adp Force riding (Figura supplementare 20).
  4. Selezionare Tutti i parametri > Parametri di ricerca... opzione. Cercare la parola nucleare e selezionare Usa le distanze nucleari per X-H/D (Figura supplementare 20).
  5. Selezionare Esegui per avviare il perfezionamento.
    NOTA: Dopo il perfezionamento iniziale, sarà necessario ispezionare visivamente le mappe SLD di neutroni ed eseguire la costruzione manuale del modello in Coot. Potrebbe essere necessario inserire ligandi/cofattori presenti nel modello. I perfezionamenti successivi richiederanno il file di restrizioni CIF necessario per tutti i ligandi pertinenti e questi devono essere caricati nella scheda Configura di phenix.refine.
3. Edificio modello
  1. Dopo il perfezionamento in Phenix, fare clic su Apri in Coot nella scheda Risultati per visualizzare le mappe e la struttura del SLD di neutroni. Fare clic sulla scheda Display Manager e in Mappe fare clic su Elimina mappa per eliminare entrambe le mappe 2FOFCWT e _FOFCWT (Figura supplementare 25). Fare clic su File > Apri MTZ, mmCIF fcf o phs.... Selezionare la cartella di perfezionamento corrente e selezionare il file .mtz. Per entrambe le ampiezze e le fasi, selezionare i dati 2FOFC WT_no_fill dal menu a discesa. Ripeti facendo clic su File > Apri MTZ, mmCIF fcf o phs... e seleziona i dati _FOFCWT dal menu a discesa sia per l'opzione Ampiezze che per Fasi. Aprire Display Manager e passare a Scroll per la mappa _2FOFC WT_no_fill quindi scorrere per ridurre l'rmsd dei dati _2FOFC WT_no_fill a 1.00 (Figura supplementare 25). Attiva o disattiva Scroll per la mappa _FOFCWT e scorri per ridurre l'rmsd dei dati _FOFCWT a 3.00.
  2. Eseguire un'ispezione visiva della struttura proteica per determinare se il modello si adatta alla mappa SLD dei neutroni.
  3. Come descritto al punto 7.1.3.2, determinare l'orientamento corretto e l'occupazione H/D dei residui e dei gruppi con siti intercambiabili H/D. Regolate le posizioni dei residui utilizzando lo strumento Ruota traslazione e Modifica angoli Chi (Figura 6). Se necessario, è possibile utilizzare Real Space Refine Zone . Correggere manualmente gli atomi D che esplodono dal residuo utilizzando l'editor di testo per inserire le coordinate atomiche corrette
    NOTA: La zona di raffinazione dello spazio reale non è ottimizzata per le mappe SLD di neutroni nella folaga e può provocare lunghezze di legame irregolari per gli atomi legati a D, chiamati residui esplosivi (Figura supplementare 26). È preferibile modificare manualmente le coordinate atomiche necessarie ed evitare l'uso di Real Space Refine Zone.
  4. Inserire e riorientare le molecole d'acqua in base alla densità dei neutroni. Per aggiungere acque in Coot selezionare l'icona Posiziona atomo al puntatore e selezionare per inserire una molecola d'acqua (Figura supplementare 27A). La folaga inserirà un atomo O in questa posizione per impostazione predefinita.
  5. Per aggiungere atomi D agli atomi O delle acque inserite nella folaga usare Phenix. Aprire il menu Perfezionamento e fare clic su ReadySet. Accanto a Opzioni di raffinamento dei neutroni selezionare solo l'opzione Aggiungi deuterio alle molecole di solvente. Deselezionare Aggiungi idrogeno al modello se assente (Figura supplementare 27B e Figura supplementare 27C).
    NOTA: la costruzione del modello che utilizza dati solo neutroni differisce dalla costruzione del modello di una struttura congiunta raggi X/neutroni perché non ci sono dati a raggi X che contribuiscano al perfezionamento delle coordinate della spina dorsale e degli atomi più pesanti. In un raffinamento congiunto, la mappa della densità elettronica viene inizialmente utilizzata per determinare la spina dorsale proteica e le coordinate della catena laterale. Questo modello viene successivamente utilizzato in un affinamento congiunto di dati a raggi X/neutroni in cui l'orientamento e l'occupazione degli atomi H/D sono derivati dalla mappa SLD dei neutroni. In un raffinamento di soli neutroni, l'intera struttura è derivata dall'analisi delle mappe SLD dei neutroni, che richiedono la costruzione delle molecole d'acqua, della spina dorsale, delle catene laterali e dei ligandi oltre agli atomi H / D (Figura 6). Il rapporto dati-parametri è basso nei perfezionamenti rispetto ai soli dati sui neutroni e si dovrebbe prestare attenzione a non sovrapporre i dati.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I dati di diffrazione neutronica sui cristalli di una polisaccaride monoossigenasi litica di Neurospora crassa (NcLPMO9D) sono stati raccolti su IMAGINE presso l'HFIR a temperatura ambiente e su MaNDi presso l'SNS in condizioni crio-errate secondo il protocollo sopra descritto. Sono stati utilizzati cristalli della proteina idrogenata coltivata in tampone a base di _H2O con volume superiore a 0,1 ^mm3 (esempi illustrativi di cristalli di grandi dimensioni sono mostrati nella Figura supplementare 4 e nelle figure successive). I cristalli sono stati montati in capillari di quarzo e lo scambio di vapore con il tampone basato su _D2O è stato eseguito per tre settimane prima della raccolta dei dati (Figura 4).

La raccolta dei dati sulla temperatura ambiente è stata eseguita sulla beamline IMAGINE (Figura 1). Un test del fascio bianco di quattro ore ha portato a una diffrazione ad alta risoluzione suggerendo che il cristallo era di dimensioni e qualità adeguate per un set di dati completo da raccogliere. Oltre a fornire informazioni preliminari sulla qualità di diffrazione del cristallo, l'esposizione iniziale del passaggio di banda larga può essere utilizzata per indicizzare il modello di diffrazione e determinare la matrice di orientamento del cristallo. Dato il gruppo spaziale _P21 del cristallo, è stata implementata una strategia di raccolta dati di 18 fotogrammi con un tempo di raccolta di 20 ore per fotogramma. Come con la raccolta dei dati di diffrazione a raggi X, i gruppi di spazio a simmetria più elevata richiedono meno fotogrammi (cioè meno copertura angolare) per raccogliere un set di dati completo. I dati sono stati raccolti in modalità quasi-Laue utilizzando un intervallo di lunghezze d'onda di 2,8 – 4,0 Å. Dopo la raccolta dei dati, i dati sono stati indicizzati, integrati scalati e uniti per fornire un file SLD di neutroni in formato MTZ ad una risoluzione di 2,14 Å. I dati sono stati valutati di qualità sufficiente seguendo linee guida simili per l'analisi dei dati a raggi X, sebbene una completezza dell'80 % e un _CC1/2 di almeno 0,3 siano stati considerati accettabili poiché la diffrazione delle proteine neutroniche è una tecnica limitata dal flusso.

Dopo la raccolta dei dati di diffrazione neutronica a temperatura ambiente, lo stesso cristallo è stato utilizzato per raccogliere un set di dati di diffrazione a raggi X a temperatura ambiente con risoluzione 1,90 Å (Figura supplementare 13). I dati a raggi X sono stati utilizzati per determinare le posizioni degli atomi "più pesanti" tra cui C, N, O e S. La struttura raffinata rispetto ai soli dati a raggi X è stata quindi utilizzata come modello di partenza per eseguire un raffinamento congiunto rispetto ai dati a raggi X e neutroni. Phenix ReadySet è stato utilizzato per aggiungere atomi H in siti non scambiabili, atomi H e D in siti scambiabili e atomi D alle molecole d del modello a raggi X di partenza. A seguito di questa preparazione del modello, sono stati eseguiti perfezionamenti iterativi su entrambi i set di dati (Figura supplementare 19 e Figura supplementare 20). La costruzione di modelli interattivi è stata eseguita a Coot ispezionando visivamente le mappe di densità per orientare di conseguenza le catene laterali e le molecole d'acqua (Figura supplementare 22). I dati dei neutroni sono stati utilizzati principalmente per determinare gli stati di protonazione e gli orientamenti delle molecole d'acqua. Il confronto della mappa della densità elettronica di residui come serina e triptofano e la corrispondente mappa SLD neutronica illustrano le informazioni che possono essere ottenute sugli stati di protonazione nei siti scambiabili H/ D dalla diffrazione delle proteine neutroniche (Figura 7). Una sovrapposizione di mappe SLD di elettroni e neutroni per molecole d'acqua indica anche che mentre le interazioni dei legami idrogeno possono essere dedotte dai dati a raggi X, i neutroni forniscono informazioni chiare sull'orientamento di questi legami idrogeno (Figura 8). Le mappe di omettire neutroni SLD _FO-FC sono state generate per determinare gli stati di protonazione e l'orientamento H / D delle catene laterali. Sono illustrate le mappe SLD neutroniche ottenute per i residui di tirosina e treonina, in cui le mappe neutroniche _{Fo-FC indicano} chiaramente picchi positivi che indicano la presenza di H/D (Figura 9). I dati di diffrazione neutronica raccolti hanno anche fornito preziose informazioni su più stati di protonazione, come il gruppo -_ND3⁺ di Lys (Figura 10). Le statistiche di perfezionamento (_Rwork e _Rfree) sono state attentamente monitorate durante l'ottimizzazione del modello per evitare l'over-fitting. Le statistiche finali hanno fornito un _Rwork a raggi X del 12,77% e un _Rfree del 18,21%, e un _Rwork neutronico del 14,48% e un _Rfree del 21,41% con 389 molecole d'acqua presenti (Figura supplementare 28).

I dati di criotemperatura sono stati raccolti su NcLPMO9D a seguito di un tampone di ascorbato per ridurre il sito attivo del rame da ^CuII a ^CuI sulla beamline MaNDi (Figura supplementare 2 e Figura supplementare 15)⁴⁵. I dati sono stati raccolti utilizzando la modalità TOF Laue a seguito di un test di diffrazione neutronica utilizzando un'esposizione di 4 ore per verificare la qualità della diffrazione. Dato il gruppo spaziale del cristallo, è stata ideata una strategia di raccolta dati di 18 fotogrammi con una dose di raccolta di 80 Coulomb per fotogramma. I dati sono stati raccolti in modalità TOF-Laue ad un intervallo di lunghezze d'onda di 2,0 – 4,0 Å. Dopo la raccolta dei dati, i dati sono stati indicizzati, integrati, ridimensionati e uniti per fornire un file di riflessione in formato MTZ ad una risoluzione di 2,40 ^Å51,52.

Dopo la raccolta dei dati, il set di dati di diffrazione di neutroni NcLPMO9D a criotemperatura di 2,40 Å è stato utilizzato per il perfezionamento dei dati solo neutroni. I dati dei neutroni sono stati messi in fase mediante sostituzione molecolare utilizzando PDB 5TKH come modello di partenza. Phenix ReadySet è stato utilizzato per aggiungere atomi H in siti non scambiabili e atomi H / D con occupazioni parziali in siti scambiabili. Le molecole d'acqua sono state rimosse dal modello di partenza con gli strumenti PDB (Figura supplementare 23). La preparazione del modello è stata seguita dal perfezionamento con phenix.refine utilizzando la tabella di scattering neutronico (Figura supplementare 24). La costruzione di modelli interattivi è stata eseguita a Coot, con molecole d'acqua aggiunte utilizzando i picchi positivi della mappa _FO-Fc e posizionate in base alle potenziali interazioni del legame idrogeno (Figura 11A e Figura 11B). Quando si analizzano le mappe SLD di neutroni, le molecole d'acqua sono chiaramente visibili se sono altamente ordinate, tuttavia la loro densità può essere sferica o ellissoidale se non sono ben ordinate (Figura 11C-E). Le mappe SLD neutroniche sono state utilizzate per fornire preziose informazioni sull'orientamento dei residui come l'asparagina, in cui la differenziazione tra i gruppi carbonile e amminico può essere difficile quando si utilizzano solo i dati di diffrazione a raggi X (Figura 12A e Figura 12B). I picchi nelle mappe di omissione SLD dei neutroni _FO-FC sono stati anche molto istruttivi nel determinare gli stati di protonazione dei residui di istidina nella posizione N _δ o N _ε (Figura 12C e Figura 12D). Lo stato di protonazione dei residui con più siti scambiabili H/D può anche essere determinato utilizzando mappe SLD di neutroni. Ciò è stato chiaramente illustrato con una mappa di omissione SLD neutronica _FO-FC di arginina, che è nota per avere una carica positiva (Figura 12E e Figura 12F). Come in precedenza, l'over-fitting è stato impedito monitorando _Rwork e _Rfree. Le statistiche finali hanno dato un _Rwork del 22,58% e un _Rfree del 30,84% (Figura supplementare 29). Dato che la diffrazione delle proteine neutroniche è una tecnica limitata al flusso in cui si deve tener conto della lunghezza di scattering negativa e del grande fattore di scattering incoerente di H, ci si può aspettare che un raffinamento dei soli dati di neutroni avrebbe statistiche più scarse di un raffinamento congiunto di raggi X/neutroni con meno molecole d'acqua visibili (Figura supplementare 28 e Figura supplementare 29).

Quando si analizzano le mappe SLD dei neutroni, diventerà evidente che la cancellazione della densità a causa della lunghezza di scattering neutronica negativa di H si verificherà per le proteine idrogenate che sono state sottoposte a scambio di vapore con tampone di cristallizzazione contenente _D2O. Per questo motivo, le mappe SLD di neutroni in cui gli atomi H non scambiabili sono attaccati al carbonio appaiono incomplete rispetto alla loro controparte della mappa di densità elettronica (Figura 13A). L'effetto della cancellazione è spesso più evidente a risoluzioni più scarse, rendendo imperativo ottenere cristalli proteici di alta qualità. È quindi preferibile eseguire un affinamento congiunto di un campione con dati sia a raggi X che a neutroni in cui i dati a raggi X possono essere utilizzati per determinare la posizione della spina dorsale proteica (Figura 13B). Inoltre, gli atomi di zolfo nella cisteina e nella metionina possono essere scarsamente visibili, richiedendo dati a raggi X per il posizionamento esatto degli atomi (Figura 13C e Figura 13D). I metalli con lunghezze di scattering neutronica deboli possono anche essere difficili da modellare nelle mappe SLD di neutroni, come è evidente nelle nostre mappe LPMO9D. La raccolta di un set di dati a raggi X a basso dosaggio (privo di danni da radiazioni) sullo stesso cristallo è quindi utile, poiché consente il posizionamento dell'atomo di metallo utilizzando mappe di densità elettronica (Figura 13E e Figura 13F).

figure-results-1
Figura 1: Diagramma di flusso del flusso di lavoro della cristallografia delle proteine neutroniche. Produzione di proteine. Per ottenere una struttura neutronica, la proteina viene prima espressa. L'espressione batterica in mezzi a base di _{H2O o D2O} viene tipicamente utilizzata per produrre un'alta resa di proteine ricombinanti idrogenate o perdeuterate, rispettivamente. La proteina viene purificata in un tampone a base di _H2O e quindi cristallizzata in un tampone di cristallizzazione a base di _{H2O o D2O} per far crescere i cristalli fino a una dimensione minima di 0,1 ^mm3. Preparazione del campione: Prima della raccolta dei dati di diffrazione neutronica, i cristalli cresciuti con _H2O subiscono lo scambio H / D per scambiare gli atomi H titolabili della proteina con lo scambio D. H / D può essere fatto immergendo direttamente i cristalli nel tampone di cristallizzazione deuterato, bilanciando la goccia di cristallizzazione con un serbatoio a base di _D2O o montando i cristalli in capillari di quarzo per lo scambio di vapore con tampone di cristallizzazione deuterato. Raccolta dati neutroni: Dopo lo scambio H/D, i potenziali cristalli vengono sottoposti a screening per determinare la qualità della diffrazione. I cristalli con una risoluzione minima di 2,5 Å sono considerati adatti per la raccolta di un set di dati completo. I cristalli sono montati in capillari di quarzo per la raccolta dei dati a temperatura ambiente o congelati in un crio-loop per la raccolta dei dati a temperatura criogenica. Un set di dati a raggi X viene raccolto sullo stesso cristallo (o su un identico) alla stessa temperatura. Edificio modello: Il raffinamento viene eseguito utilizzando phenix.refine sia contro i dati di neutroni che di raggi X o solo contro i dati di neutroni. La costruzione manuale del modello della struttura proteica viene eseguita in Coot utilizzando le mappe SLD di neutroni. Struttura completa: Dopo il completamento della struttura proteica, il modello di coordinate viene convalidato e depositato nella Protein Data Bank. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Raccolta di cristalli proteici. (A) I cristalli sono maneggiati al microscopio. (B) La scatola sandwich sigillata contenente la lastra di vetro siliconato è aperta. Il buffer del serbatoio viene pipettato su vetrini siliconati. (C) Un cristallo viene raccolto con un microloop. (D) Il cristallo viene posto in una goccia di liquore madre per lavare via eventuali detriti che vengono spesso raccolti insieme al cristallo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Trasferimento del cristallo al quarzo capillare. (A) L'estremità di un capillare di quarzo è riempita con tampone di riserva. (B) Il cristallo viene trasferito nel capillare di quarzo e (C) immerso nel tampone del serbatoio. (D) Il cristallo viene trasportato capillarmente utilizzando il tampone del serbatoio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Sigillatura del capillare al quarzo. (A) Il tampone deuterato viene aggiunto all'estremità del capillare per formare una "spina". (B) La cera viene fusa con una "bacchetta". (C) Il capillare viene posto nella cera fusa per sigillare. (D) I tappi di cera sono formati su entrambe le estremità per sigillare il capillare. (E) Il cristallo dopo il montaggio. (F) Il capillare sigillato viene posto in una capsula di Petri e tenuto in posizione con stucco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Aumento del rapporto segnale-rumore del modello di diffrazione neutronica. Man mano che la raccolta dei dati procede, i punti diffratti diventano più intensi. (NOTA: le immagini di diffrazione dal vivo presentate qui sono a scopo illustrativo e sono state prese da diversi cristalli.) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Costruzione di modelli interattivi utilizzando dati di neutroni in Coot. (A) Un picco di densità SLD neutrone _FO-FC positivo (verde) che indica la serina deve essere riorientato modificando gli angoli chi. La mappa SLD del neutrone 2FO-FC viene visualizzata in viola e la mappa della densità elettronica 2FO-FC viene visualizzata in blu. (B) Serina posizionata correttamente. (C) Picchi di densità SLD neutroni _FO-FC positivi e negativi (rispettivamente verde e rosso) che indicano che il triptofano deve essere ruotato/traslato per corrispondere al picco di densità di differenza. (D) Triptofano correttamente orientato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Informazioni aggiuntive dalle mappe SLD di neutroni. (A) La mappa della densità elettronica 2FO-FC (blu) mostra le posizioni degli atomi "più pesanti" nella serina. (B) La mappa SLD del neutrone _2FO-FC (viola) mostra chiaramente la posizione dell'atomo D "più leggero" nella serina. (C) La mappa della densità elettronica _2FO-FC (blu) mostra le posizioni degli atomi "più pesanti" nel triptofano. (D) La mappa SLD del neutrone _2FO-FC (viola) mostra chiaramente la posizione dell'atomo D "più leggero" nel triptofano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Posizionamento delle molecole d'acqua. (A) La forma sferica di una mappa di densità elettronica _2FO-FC (blu) per l'acqua. (B) La mappa SLD del neutrone _2FO-FC (viola) fornisce informazioni sull'orientamento dell'acqua e sull'interazione del legame idrogeno. (C) Sovrapposizione di mappe SLD di elettroni e neutroni dell'acqua. La mappa SLD del neutrone 2FO-FC viene visualizzata in viola e la mappa della densità elettronica 2FO-FC viene visualizzata in blu. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Mappe FO-FComit di neutroni SLD FO-FC. (A) La mappa SLD di neutroni _FO-FC (verde) fornisce informazioni chiare sull'orientamento H/D dei residui di tirosina. La mappa SLD del neutrone 2FO-FC viene visualizzata in viola e la mappa della densità elettronica 2FO-FC viene visualizzata in blu. (B) Residuo di tirosina con corretto orientamento H/D. (C) La mappa SLD dei neutroni _FO-FC (verde) fornisce informazioni chiare sull'orientamento H/D dei residui di treonina. D) Residuo di treonina con orientamento H/D corretto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 10: Stati di protonazione multipli visualizzati con mappe SLD di neutroni. (A) La mappa della densità elettronica _2FO-FC (blu) fornisce solo la posizione dell'atomo N del gruppo lisina ε-ammonio. (B-E) La mappa di omissione SLD del neutrone _FO-FC (verde) mostra chiaramente il gruppo -_NH3 caricato positivamente. La mappa SLD del neutrone 2FO-FC viene visualizzata in viola e la mappa della densità elettronica 2FO-FC viene visualizzata in blu. (F) Sovrapposizione di densità elettronica e mappe SLD neutroniche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 11: Comparsa di molecole d'acqua nelle mappe SLD di neutroni. (A) Le molecole d'acqua sono posizionate secondo le mappe SLD dei neutroni _FO-FC (verde) e i potenziali legami idrogeno. La mappa SLD del neutrone 2FO-FC viene visualizzata in viola. (B) Molecola d'acqua posizionata correttamente. (C-E) Le varie forme di SLD neutronico mappano le molecole d'acqua a seconda dei fattori B e delle interazioni del legame idrogeno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 12: Informazioni sull'orientamento degli amminoacidi e sulla protonazione fornite dalle mappe SLD dei neutroni. (A) I picchi della mappa _FO-FC SLD di neutroni (verde) indicano l'orientamento errato di un residuo di asparagina. La mappa SLD del neutrone 2FO-FC viene visualizzata in viola e la mappa della densità elettronica 2FO-FC viene visualizzata in blu. (B) 2FO-FC mappa SLD neutronica (viola) del corretto orientamento asparaginico. (C) Il picco della mappa neutronica SLD _FO-FC (verde) indica una singola protonazione dell'istidina a N _ε. (D) Mappa SLD di neutroni _2FO-FC (viola) dell'istidina N _{ε-protonazione}. (E) Neutron SLD _FO-FC omettere i picchi della mappa (verde) confermano la carica positiva dell'arginina. (F) Mappa SLD neutronica _2FO-FC (viola) di arginina caricata positivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 13: Mappe SLD di neutroni discontinui. (A) Mappa SLD neutronica _2FO-FC (viola) di una proteina idrogenata a vapore H/D scambiata. L'acido glutammico mostra la cancellazione della mappa SLD neutronica a causa della lunghezza di scattering negativa degli atomi H non scambiabili. (B) Una mappa della densità elettronica _2FO-FC sovrapposta (blu) mostra chiaramente la densità dell'acido glutammico. (C) L'atomo di zolfo nella metionina è scarsamente visibile nelle mappe SLD di neutroni _2FO-FC (viola). (D) Una mappa della densità elettronica sovrapposta mostra chiaramente la densità della metionina. (E) Gli atomi di metallo, qui rame, sono scarsamente visibili nelle mappe SLD _2FO-FC di neutroni (viola). (F) Una mappa della densità elettronica _2FO-FC sovrapposta (blu) mostra chiaramente la densità dell'atomo di rame coordinato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Isotopo	Lunghezza di dispersione coerente (fm)	Lunghezza di dispersione incoerente (fm)
1H	-3.741	25.274
2H	6.671	4.04
12C	6.6511	0
14N	9.37	2
16O	5.803	0
23Na	3.63	3.59
24Mg	5.66	0
31P	5.13	0.2
32S	2.804	0
35Cl	11.65	6.1
39mila	3.74	1.4
40Ca	4.8	0
55MN	-3.73	1.79
56Fe	9.94	0
63Cu	6.43	0.22
64Zn	5.22	0

Tabella 1: Lunghezze di scattering neutronico e valori di scattering incoerenti. Adattato da Sears, ¹⁹⁹²¹⁶.

Figura supplementare 1: Lo strumento IMAGINE presso il reattore isotopico ad alto flusso. (A) Lo strumento IMAGINE nella sala guida dei neutroni freddi. (B) Campione montato in un capillare di quarzo attaccato con stucco al goniometro. Il campione e la tabella del rivelatore si chiudono per posizionare il cristallo e la piastra cilindrica dell'immagine nel fascio di neutroni. Modificato con il permesso dell'Unione Internazionale di ^{Cristallografia53}. Immagini fornite con il permesso di Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 2: Lo strumento MaNDi alla sorgente di neutroni di spallazione. (A) L'array di rilevatori di telecamere MaNDi Anger. Riprodotto con il permesso dell'Unione Internazionale di ^{Cristallografia11}. (B) Stadio di campionamento mobile MaNDi. (C) Campione montato in capillare di quarzo montato sul goniometro del MaNDi per la raccolta dei dati sulla temperatura ambiente. Immagini fornite con il permesso di Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 3: Struttura della polisaccaride monoossigenasi litica NcLPMO9D. Il sito rame-attivo ncLPMO9D si trova su una superficie piana di legame polisaccaride. Il rame è coordinato da due residui di istidina in un classico "tutore istidina" e da un residuo di tirosina assiale. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 4: Cristallo con volume sufficiente nel vassoio di cristallizzazione a goccia seduta. (A) I grandi cristalli vengono coltivati in gocce sedute disposte in lastre di vetro siliconato a 9 pozzetti. (B e C) I cristalli sono misurati per identificare quelli con volume > 0,1 ^mm3. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura 5 supplementare: pHmetro impostato per letture tampone deuterate. L'elettrodo di pH è imbevuto di _D2O prima dell'uso. NaOD e DCl vengono utilizzati per regolare il pH dei tamponi deuterati. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura 6 supplementare: Linee guida per il montaggio dei campioni MaNDi. Dimensioni massime del capillare al quarzo e posizione del campione per la raccolta dei dati sulla temperatura ambiente.
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Figura supplementare 7: Rimozione del buffer in eccesso. (A) Il tampone in eccesso viene aspirato dal capillare di quarzo con punte microcapillari. (B) Il tampone rimanente viene rimosso con uno stoppino di carta sottile per asciugare completamente il capillare. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 8: La GUI di acquisizione dati. Finestra di input dei "Parametri dell'esperimento" per la raccolta dei dati. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 9: La GUI ottica. Selezione dell'intervallo quasi-Laue per la raccolta dei dati e il monitoraggio della velocità di conteggio dei neutroni. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 10: Raccolta dati nella GUI di acquisizione dati. Il tempo di esposizione, il numero di fotogrammi e gli angoli per la raccolta dei dati sono specificati nella scheda "Raccogli". La raccolta dei dati viene quindi avviata utilizzando "Avvia scansione". Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 11: Neutroni diffratti rilevati e visualizzati. Alla fine del tempo di esposizione, il rilevatore di piastre di immagine sensibile ai neutroni viene letto e il modello di diffrazione viene visualizzato nella GUI di acquisizione dati. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 12: Elaborazione dei dati dopo diffrazione neutronica. I frame vengono indicizzati, integrati, normalizzati in lunghezza d'onda e ridimensionati utilizzando Lauegen, Lscale e Scala per generare un file di riflessione unito dopo la raccolta dei dati. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 13: Raccolta di dati a raggi X. Generatore di raggi X di origine domestica impostato con cristallo montato su capillare al quarzo per la raccolta dei dati sulla temperatura ambiente. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura 14 supplementare: Linee guida di montaggio per la raccolta di crio-dati MaNDi. Dimensioni di CrystalCaps e altezza del pin per la raccolta di crio-dati presso MaNDi.
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Figura supplementare 15: Congelamento flash per la raccolta di dati di diffrazione di crioneuroni. (A) Configurazione per l'ammollo del cristallo, la raccolta con un microloop e il congelamento in azoto liquido utilizzando un contenitore criocompatibile come una schiuma Dewar. Il cristallo montato viene trasferito direttamente sul criogoniometro beamline utilizzando pin pin criorincipate preraffreddate. (B) Il sigillo di cera viene fuso per la rimozione del cristallo. (C) Il cristallo viene lavato fino all'estremità del capillare di quarzo per la raccolta. (D) Il cristallo è immerso sequenzialmente in un tampone di immersione in ascorbato e quindi crioprotettore seguito da congelamento flash in azoto liquido. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 16: Interfaccia di allineamento del campione. L'allineamento dei cristalli nel fascio di neutroni, rappresentato dalla croce blu, avviene mediante centratura punta e clicca. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 17: La GUI CSS per la raccolta dei dati. La strategia di raccolta dei dati, comprese le dosi di esposizione e gli angoli, viene caricata nella GUI CSS. Man mano che la raccolta dei dati procede, i neutroni diffratti rilevati sul rivelatore in tempo reale verranno visualizzati nel pannello superiore. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 18: Corrispondenza dei flag R-free in CCP4. Le bandiere prive di R dei dati neutroniche sono abbinate alle bandiere prive di R dei dati a raggi X raccolti sullo stesso cristallo o su un cristallo identico per il raffinamento congiunto. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 19: Preparazione e perfezionamento della struttura. (A) Lo strumento Phenix ReadySet viene utilizzato per aggiungere la doppia occupazione H / D nei siti intercambiabili. (B) Sia i dati sui neutroni che i dati a raggi X sono utilizzati per un perfezionamento congiunto, mentre il modello di input iniziale è stato perfezionato rispetto al set di dati a raggi X raccolto sullo stesso cristallo o su un cristallo identico. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura 20 supplementare: Configurazione delle impostazioni di perfezionamento. Il modello di raffinamento e le distanze nucleari sono configurati per il perfezionamento congiunto dei dati a raggi X/neutroni. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 21: Selezione dei dati per la costruzione di modelli di folaga. L'output del file MTZ phenix contenente raggi X e dati di neutroni non riempiti viene aperto in Coot per generare mappe SLD di elettroni e neutroni per la costruzione di modelli interattivi. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 22: Costruzione di modelli interattivi in Coot durante un perfezionamento congiunto. (A) Un picco di densità SLD neutrone _FO-FC positivo e negativo (rispettivamente verde e rosso) che indica che l'acqua deve essere riorientata mediante rotazione/traslazione. La mappa SLD del neutrone 2FO-FC viene visualizzata in viola e la mappa della densità elettronica 2FO-FC viene visualizzata in blu. (B) Acqua posizionata correttamente. (C) Un picco positivo della mappa SLD del neutrone _FO-FC (verde) indica che la treonina deve essere ruotata per corrispondere al picco di densità della differenza modificando gli angoli chi. (D) Treonina correttamente orientata. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 23: Preparazione della struttura per il perfezionamento dei dati solo neutroni. Il file di coordinate di partenza viene preparato per il perfezionamento mediante rimozione dell'atomo d'acqua in PDBTools e mediante aggiunta di doppia occupazione H / D in siti intercambiabili. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 24: Perfezionamento dei soli dati dei neutroni. (A) Vengono caricati i dati sui neutroni e il modello di partenza preparato. (B) Le impostazioni per il perfezionamento dei dati sui neutroni utilizzano la tabella di diffusione dei neutroni. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 25: Selezione dei dati per la costruzione di modelli di folaga. I dati dei neutroni non riempiti vengono aperti in Coot per la costruzione di modelli interattivi. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 26: Affinamento dello spazio reale nella folaga per i residui deuterati. (A) Picchi di densità SLD neutronica _FO-FC positivi e negativi (rispettivamente verde e rosso) che indicano che un residuo di arginina deve essere spostato per adattarsi al picco di densità _FO-FC. La mappa SLD del neutrone 2FO-FC viene visualizzata in viola e la mappa della densità elettronica 2FO-FC viene visualizzata in blu. (B) L'utilizzo di Real Space Refine provoca l'"esplosione" degli atomi D a causa della mancanza di librerie di contenimento della geometria della folaga. (C) Gli atomi D non si muovono con il resto degli atomi residui. (D) Le posizioni dell'atomo D possono essere fissate manualmente utilizzando un editor di testo. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 27: Aggiunta di molecole d'acqua. (A) Le molecole d'acqua possono essere aggiunte manualmente ai picchi di densità della mappa SLD neutronica _FO-FC positiva (verde). Le molecole d'acqua inserite saranno inizialmente rappresentate da un atomo di O nella folaga. (B) Phenix ReadySet viene utilizzato per aggiungere atomi D agli atomi O per le molecole d'acqua. (C) La molecola d'acqua deuterata viene aggiunta con successo. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 28: Statistiche di perfezionamento. Statistiche finali di affinamento dei dati a seguito di raffinamento congiunto raggi X/neutroni. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 29: Statistiche di perfezionamento. Statistiche finali di perfezionamento dei dati a seguito di perfezionamento dei soli dati dei neutroni. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Discussion

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La cristallografia a proteine neutroniche è una tecnica altamente sensibile per sondare gli stati di protonazione e l'orientamento delle molecole d'acqua nelle proteine. Queste informazioni fanno luce sui meccanismi catalitici delle proteine poiché i cambiamenti nelle interazioni di protonazione e legame idrogeno sono spesso centrali per la chimica ^enzimatica10. La cristallografia delle proteine neutroniche, sebbene sia una tecnica informativa, ha una serie di fattori che dovrebbero essere presi in considerazione prima di pianificare un esperimento di diffrazione neutronica, vale a dire:

Il requisito di grandi cristalli proteici per la raccolta dei dati.
Le proprietà di scattering dell'idrogeno e di altri elementi, come gli ioni metallici.
Limitazioni nel perfezionamento della struttura e nel software di costruzione del modello quando si lavora con campioni deuterati.

La cristallografia a proteine neutroniche è una tecnica a flusso limitato. A differenza dei set di dati di diffrazione a raggi X, per i set di dati di neutroni sono attesi fattori R più elevati e minore completezza, ridondanza e rapporti segnale-rumore a causa delle limitazioni intrinseche della tecnica (flusso limitato, quasi-Laue, lunghezze d'onda più lunghe). La raccolta dei dati di un singolo frame è in genere di 12 – 18 ore. Il successo di un esperimento dipende in larga misura dalle dimensioni e dalla qualità del campione, con cristalli di 0,1 ^mm3 che spesso sono il requisito ^minimo3. La diffrazione neutronica richiede la produzione di grandi quantità di proteine per impostare gocce di cristallizzazione che vanno da 10 a 800 μL. Il volume minimo per la coltivazione di cristalli sufficientemente grandi può essere stimato utilizzando un calcolatore di volume dati i parametri del cristallo e del campione (https://neutrons.ornl.gov/imagine). La crescita di grandi cristalli è stata prevalentemente realizzata dalla diffusione del ^vapore3. La cristallizzazione a goccia sospesa consente la crescita di cristalli in grandi gocce che vanno da 10-25 μL, mentre le gocce più grandi che vanno fino a ~ 50 μL possono essere impostate utilizzando attrezzature per gocce sedute disponibili ^{in commercio14,54}. Le lastre di vetro siliconate a nove pozzetti possono essere utilizzate per impostare gocce molto grandi, con volumi fino a 800 μL. Queste lastre di vetro sono collocate in "scatole sandwich" disponibili in commercio da Hampton Research. Ulteriori tecniche di cristallizzazione includono la cristallizzazione in batch, in cui il limite della dimensione della goccia è dettato dalla nave. L'impostazione dell'esperimento di cristallizzazione in batch può variare da microlitri a ^millilitri55. La cristallizzazione può essere eseguita anche utilizzando la tecnica della dialisi in cui la proteina viene bilanciata con il precipitante attraverso una membrana di dialisi o per contro-diffusione lungo un gradiente di concentrazione precipitante o attraverso un tappo poroso come l'agarosio56,57. La semina offre un'altra alternativa per ottenere cristalli del volume desiderato. Micro e macrosemina sono stati impiegati con successo per la crescita di grandi cristalli, tra cui grandi cristalli di NcLPMO9D45. Alcune conoscenze del diagramma di fase proteica, compresa l'influenza della temperatura sulla solubilità, aiutano nella crescita di grandi cristalli.

Quando si pianifica un esperimento di diffrazione neutronica, è essenziale ottimizzare la preparazione proteica per massimizzare il rapporto segnale-rumore durante la raccolta dei dati di ^diffrazione7. Per aggirare la cancellazione della densità e l'elevata dispersione incoerente causata dagli atomi H, le mappe SLD dei neutroni possono essere migliorate scambiando gli atomi H con il suo isotopo D, che possiede una lunghezza di scattering coerente positiva e una bassa lunghezza di scattering incoerente. Per fare ciò, viene eseguito lo scambio di vapore del cristallo proteico idrogenato contro il tampone di cristallizzazione deuterato. Ciò garantisce lo scambio H/D delle molecole di solvente e degli atomi di proteina H labile e ^titolabile23. Lo scambio di vapore viene eseguito montando il cristallo idrogenato in un capillare di quarzo con "tappi" tampone di cristallizzazione deuterati a base di _D2O e rappresenta una tecnica efficace e delicata che viene spesso applicata14,23,35. Lo scambio può richiedere diverse settimane e preferibilmente richiede che il buffer deuterato venga cambiato frequentemente per garantire il massimo scambio H / D. Lo scambio H/D può essere eseguito anche immergendo direttamente il cristallo in un buffer deuterato. Per evitare di sottoporre il cristallo sotto stress a causa dell'esposizione a _D2O, il processo di ammollo deve essere eseguito gradualmente aumentando in modo incrementale il rapporto _D2O:_H2O58. Oltre a questo, la cristallizzazione di proteine idrogenate può essere eseguita anche in tampone deuterato per lo scambio H/D in siti H ^labili22,59. Va notato, tuttavia, che il tampone a base di _D2O ha un effetto sulla solubilità delle proteine che richiede un ulteriore aggiustamento delle condizioni note basate su H2O3,59. In alcuni casi è stato anche osservato che i buffer basati su _D2O portano a cristalli più ^piccoli59. Lo scambio completo di atomi H titolabili e legati al carbonio in D può essere ottenuto esprimendo proteine in mezzi deuterati per generare un campione ^{persouterato20}. Le mappe SLD neutroniche risultanti del campione persouterato saranno significativamente migliorate, non mostrando più la cancellazione della densità della controparte del campione idrogenato. Ciò è utile quando si caratterizza H / D legato a siti non scambiabili in una proteina o in un cofattore. Tuttavia, l'espressione della proteina perdeuterata è sia ad alto costo che a bassa ^resa60. L'Oak Ridge National Laboratory (ORNL) Center for Structural Molecular Biology (CSMB) offre una struttura di deuterazione per gli utenti che cercano di generare un campione persouterato (https://www.ornl.gov/facility/csmb). L'espressione perdeuterata viene tipicamente eseguita in un bioreattore sulla scala 1 L che produce ~ 50 mg di proteina ^purificata61.

Dopo la raccolta dei dati di diffrazione neutronica, viene eseguito il perfezionamento e la costruzione di modelli interattivi. Il perfezionamento può essere eseguito utilizzando più suite software tra cui phenix.refine, nCNS o SHELXL28,31,32,33. La suite Phenix è il software più comunemente utilizzato per il perfezionamento dei dati di diffrazione dei neutroni in combinazione con Coot che viene utilizzato per costruire manualmente il modello dalle mappe SLD di ^neutroni34. Sebbene sia Phenix che Coot consentano l'elaborazione dei dati di diffrazione neutronica, potrebbero mancare di alcune caratteristiche necessarie per elaborare le idiosincrasie associate ai dati sui neutroni e ai campioni deuterati. Ad esempio, Coot non contiene l'ottimizzazione geometrica per i residui deuterati, il che può portare a complicazioni durante la costruzione del modello poiché la funzione "Real Space Refine" provoca residui "esplosivi" (Figura supplementare 26)⁶². Questo può essere risolto generando file di ritenuta per tutti i residui deuterati. Tuttavia, questo è un processo intensivo e tali librerie non sono attualmente disponibili pubblicamente. Quando si eseguono perfezionamenti in Phenix, i siti H / D intercambiabili saranno inizialmente impostati su 0,50 occupazione per H e D. Man mano che vengono eseguiti perfezionamenti, l'occupazione di H e D sarà raffinata in base alle mappe SLD di neutroni. Durante la costruzione di modelli interattivi, le mappe _Fo-Fc a densità di differenza sono molto istruttive nella valutazione delle occupazioni H / D. Le mappe possono essere utilizzate per determinare quali siti possiedono un'elevata occupazione D, il che è particolarmente informativo nel sito attivo in cui gli stati di protonazione sono cataliticamente ^rilevanti63. Situazioni ambigue sorgono, tuttavia, quando l'H:D l'occupazione è vicina a 0.70:0.30, il che si traduce in una completa cancellazione del segnale nelle mappe SLD di ^neutroni64. Va anche tenuto conto del fatto che i set di dati di neutroni quasi-Laue hanno spesso una completezza intorno all'80%, che è inferiore al ≥ 98% osservato di routine per i dati di diffrazione a raggi X. Quando si raffinano i dati di diffrazione neutronica in Phenix, le ampiezze osservate mancanti (_Fo) vengono quindi calcolate dal modello per completare l'elenco di riflessione, introducendo così la distorsione del modello. Per tenere conto di questo potenziale pregiudizio, le mappe "no_fill" dovrebbero essere esaminate durante la costruzione di modelli interattivi anziché le mappe "riempite".

Gli utenti possono scegliere di eseguire un raffinamento congiunto dei dati a raggi X / neutroni della loro struttura o un raffinamento solo dei dati sui neutroni. La visualizzazione di mappe SLD di neutroni, in particolare a bassa risoluzione, può inizialmente essere sconcertante soprattutto per una proteina idrogenata in cui H è ancora presente in siti non scambiabili nonostante lo scambio di vapore H / D. Ciò si traduce in cancellazioni di mappe di densità neutronica, dando l'impressione di mappe ^{discontinue65,66}. La raccolta di un set di dati a raggi X corrispondente integra vantaggiosamente queste cancellazioni in un perfezionamento congiunto (Figura 13A e Figura 13B). Una strategia di raffinamento congiunto comporta tipicamente il perfezionamento delle coordinate della spina dorsale proteica rispetto ai dati a raggi X, mentre i dati di diffrazione neutronica vengono utilizzati per perfezionare la posizione e l'occupazione degli atomi H/D nei siti ^{scambiabili28}. Poiché l'introduzione dell'occupazione congiunta H/D nei siti scambiabili aumenta il numero di parametri in fase di perfezionamento, un perfezionamento congiunto con i dati a raggi X aumenta anche il rapporto dati-parametri. Un raffinamento congiunto richiede che un set di dati a raggi X corrispondente sia raccolto alla stessa temperatura sullo stesso cristallo o su un cristallo coltivato nelle stesse condizioni. Per i dati di diffrazione neutronica raccolti a temperatura ambiente (300K), il corrispondente set di dati a raggi X deve essere raccolto a temperatura ambiente utilizzando una strategia di raccolta dati a basse dosi per limitare i danni da radiazioni. I campioni perdeuterati, al contrario, forniscono mappe SLD neutroniche migliorate e continue poiché non possiedono la stessa grandezza della cancellazione del segnale H / D. Tuttavia, la lunghezza di scattering neutronico di alcuni elementi, tra cui metalli e zolfo, li rende scarsamente visibili nelle mappe SLD dei neutroni, anche se la proteina è stata perdeuterata (Figura 13C-F)¹⁸. Se un metallo deve essere caratterizzato, è meglio utilizzare la diffrazione a raggi X in un raffinamento congiunto o applicare tecniche spettroscopiche per integrare gli esperimenti di diffrazione. I perfezionamenti dei dati solo neutroni vengono spesso eseguiti quando il set di dati sui neutroni ha un'alta risoluzione o se è stata utilizzata una proteina perdeuterata. Inoltre, il perfezionamento dei dati solo neutroni è particolarmente utile se si sta studiando una proteina altamente sensibile ai danni da radiazioni, poiché una struttura derivata dai raggi X può possedere artefatti indotti da radiazioni. Se si vuole eseguire un perfezionamento solo per i dati relativi ai neutroni, è necessario accertare se il corrispondente set di dati sui neutroni ha una completezza e una risoluzione sufficienti.

ORNL offre due strutture per la raccolta di dati di diffrazione neutronica: la beamline IMAGINE presso l'HFIR e la beamline MaNDi presso l'SNS36,67. Mentre entrambi gli strumenti forniscono mezzi efficaci per la raccolta di un set di dati di diffrazione neutronica che utilizza principi simili, ogni strumento ha specifiche uniche che dovrebbero essere prese in considerazione quando si richiede il tempo del fascio. IMAGINE raccoglie dati quasi-Laue ed è ottimizzato per la raccolta di dati a temperatura ambiente su cristalli con celle unitarie fino a ~ 100 Å. MaNDi può essere utilizzato per la raccolta di dati di temperatura ambiente e crio-temperatura utilizzando la raccolta TOF-Laue su cristalli con celle unitarie fino a ~ 300 Å. Prima di raccogliere un set di dati completo, viene eseguito un test sul cristallo per valutare la qualità del modello di diffrazione ottenuto in cui il cristallo è esposto al fascio di neutroni per un singolo fotogramma. Se il cristallo è di qualità sufficiente, un set di dati completo di diffrazione neutronica verrà raccolto, indicizzato, integrato, ridimensionato e unito in un processo analogo all'elaborazione dei dati a raggi X. IMAGINE utilizza Lauegen e Lscale e MaNDi utilizza il pacchetto Mantid e impiega raccordi a profilo tridimensionale48,50,51,68,69,70. Agli scienziati che diventano utenti in una di queste strutture verrà fornito un set di dati in formato MTZ o HKL per ulteriori analisi.

La diffrazione neutronica è una tecnica non distruttiva e altamente sensibile per sondare lo stato di protonazione e le interazioni di legame idrogeno delle macromolecole biologiche. È particolarmente utile per proteine fotosensibili e metalloproteine. Diverse considerazioni riguardanti la tecnica e l'elaborazione dei dati devono essere prese in considerazione prima di condurre un esperimento, tuttavia il risultato produce risultati che possono fornire preziose informazioni sul meccanismo catalitico della proteina di interesse. La cristallografia delle proteine neutroniche integra studi computazionali, strutturali, biochimici e spettroscopici, rendendola uno strumento prezioso nella cassetta degli attrezzi del biologo delle tecniche utilizzate per caratterizzare le macromolecole biologiche.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esperimenti di espressione, purificazione e cristallizzazione delle proteine sono stati condotti presso il Center for Structural Molecular Biology (CSMB), una struttura utente di ricerca biologica e ambientale del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti presso l'Oak Ridge National Laboratory. I dati di diffrazione neutronica sono stati raccolti presso BL-11B MaNDi presso la Spallation Neutron Source (SNS) presso l'ORNL, sponsorizzata dalla Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. Gli autori ringraziano Brendan Sullivan per l'assistenza nella riduzione dei dati. I dati di diffrazione a raggi X sono stati raccolti presso le strutture del Molecular Education, Technology, and Research Innovation Center (METRIC) della North Carolina State University, supportata dallo Stato della Carolina del Nord. GCS riconosce il sostegno in parte della National Research Foundation (NRF), del Sudafrica e del programma Graduate Opportunities (GO!) presso l'ORNL. FM riconosce il supporto di USDA NIFA Hatch 211001.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Punti di carta assorbente Dimensione #30-#40, lunghezza 60 mm	DiaDent/DiaVet	218-292
Cera capillare	Hampton	HR4-328
CCP4		Versione 7.0.077
Provette da centrifuga coniche (15 mL)	Corning	CLS430790
Provette da centrifuga coniche (50mL)	Corning	CLS430828
Coot		Versione 0.8.9.2
CrystalCap ALS	Hampton	HR4-779
Pinza a punta curva	Mitegen	TW-CTF-1
Soluzione di cloruro di deuterio, 35 % in peso in D2O, ≥ 99 atomo % D	Sigma-Aldrich	543047
Ossido di deuterio 99,9 atomo % D	Sigma-Aldrich	151882
Dual Thickness MicroLoops 1000 &; m	Mitegen	M5-L18SP-1000
FiveEasy Misuratore di pH F20-Std-Kit	Mettler Toledo	30266626
Schiuma Dewars Recipiente standard 800 ml	Spearlab	M-FD-800
Argilla di montaggio a quattro colori	Hampton	HR4-326
HEPES, BioUltra, per biologia molecolare, ≥ 99,5% (T),	Sigma-Aldrich	54457
Diffrattomo a raggi X ad anodo rotante ad alto flusso con rivelatore EIGER 4M	Rigaku, Oxford Cryostream e Dectris	XtaLAB Synergy-R	Diffrattometro a raggi X da fonte domestica
Bacchetta magnetica Dritto	Mitegen	M-R-1013198
Microloader, punta per il riempimento di Femtotips e altri microcapillari in vetro (solo per uso di ricerca), 0,5 – 20 µ L, 100 mm, grigio chiaro, 192 pz. (2 rack e tempi; 96 pz.)	Eppendorf	930001007
Microprovette volume 1,5 mL	Eppendorf	Z606340
Piastre Petri con coperchio trasparente diametro 100 mm	Fischerbrand	FB0875713
Phenix		Versione 1,14-3260
Pinza a spillo 18 mm	Mitegen	M-R-1013196
Pipetta Volume 0,1-2,5 μ L	Eppendorf Research	Z683779
Pipetta Volume 100-1000 μ L	Eppendorf Research	Z683825
Pipetta Volume 10-100 μ L	Eppendorf Research	Z683809
Pipetta Volume 20-200 μ L	Eppendorf Research	Z683817
Poli(glicole etilenico) BioXtra, peso medio mol 3.350, polvere	Sigma-Aldrich	P4338
Capillare al quarzo, diametro interno 1,00 mm, lunghezza 80 mm	per ricerca capillare a parete sottile	Hampton	HR6-146
	Olympus
	Mitegen	GB-B3-R
Rotondo - Tubo in vetro cavo miniaturizzato (VitroTubes) Quarzo fuso trasparente / diametro interno 1,00 mm, lunghezza 100 mm	VitroCom	CV1012	Scatola sandwich capillare a pareti spesse
con coperchio	Hampton	HR3-132
Piastra in vetro siliconata a 9 pozzetti	Hampton	HR3-134
Piastra di cristallizzazione a goccia seduta (24 Big Well)	Mitegen	XQ-P-24S-A
Soluzione di deuterossido di sodio, 40 % in peso in D2O, 99 % atomi D	Sigma-Aldrich	176788
Vetrini di copertura circolare siliconati spessi (22 mm x 0,96 mm)	Hampton	HR3-247
Punte universali per pipette, 0,1 - 10 &; L	VWR	76322-528
Punte universali per pipette, 1 - 100 &; L	VWR	76322-136
Punte universali per pipette, 100 - 1000 &; L	VWR	76322-154
Punte universali per pipette, 20 - 200 &; L	VWR	76322-150
Punte universali per pipette, 1 - 20 &; L	VWR	76322-134
Penna a cera	Hampton	HR4-342

Sistema di stereomicroscopio Basi goniometriche riutilizzabili B3 (stile SSRL/SAM) SZX16

References

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Cristallografia neutronica Raccolta ed elaborazione dei dati per la modellazione degli atomi di idrogeno nelle strutture proteiche

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