In questo studio, presentiamo un protocollo per la differenziazione delle cellule staminali neurali e progenitrici (NPC) indotte esclusivamente dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua (DC) in un sistema microfluidico.
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Articolo metodologico
Differenziazione delle cellule precursori neurali indotte dal campo elettrico nei dispositivi microfluidici
In questo articolo
Sommario
Abstract
I campi elettrici fisiologici (EF) svolgono un ruolo vitale nella migrazione cellulare, nella differenziazione, nella divisione e nella morte. Questo articolo descrive un sistema di coltura cellulare microfluidico che è stato utilizzato per uno studio di differenziazione cellulare a lungo termine usando la microscopia. Il sistema microfluidico è costituito dai seguenti componenti principali: un chip elettrotattico otticamente trasparente, un riscaldatore ITO (Indium-Tin-Oxide) trasparente, una pompa di riempimento dei supporti di coltura, un alimentatore elettrico, un amplificatore di potenza ad alta frequenza, un multiplexer EF, uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile e un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di una fotocamera digitale. Il sistema microfluidico è utile per semplificare l'impostazione sperimentale complessiva e, a sua volta, il reagente e il consumo del campione. Questo lavoro comporta la differenziazione delle cellule staminali neurali e progenitrici (NPC) indotte dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua (DC). Nel mezzo di manutenzione delle cellule staminali, i PNG del topo (mNPC) si differenziarono in neuroni, astrociti e oligodendrociti dopo la stimolazione dell'impulso DC. I risultati suggeriscono che un semplice trattamento a impulsi CC potrebbe controllare il destino degli mNPC e potrebbe essere utilizzato per sviluppare strategie terapeutiche per i disturbi del sistema nervoso. Il sistema può essere utilizzato per la coltura cellulare in più canali, per la stimolazione EF a lungo termine, per l'osservazione morfologica cellulare e per l'acquisizione automatica di immagini time-lapse. Questo sistema microfluidico non solo riduce i tempi sperimentali richiesti, ma aumenta anche l'accuratezza del controllo sul microambiente.
Introduzione
Le cellule precursori neurali (NPC, note anche come cellule staminali neurali e progenitrici) possono essere un candidato promettente per la strategia terapeutica neurodegenerativa1. I PNG indifferenziati hanno capacità di auto-rinnovo, multipotenza e capacità proliferativa2,3. Uno studio precedente ha riferito che la matrice extracellulare e i mediatori molecolari regolano la differenziazione dell'NPC. Il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) promuovono la proliferazione dei NPC, mantenendo così lo stato indifferenziato
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Protocollo
1. Progettazione e fabbricazione del chip MOE
- Disegnare modelli per singoli strati di metacrilato di polimetile (PMMA) e il nastro a doppia parte utilizzando un software appropriato (Figura 1A, Tabella dei materiali). Tagliare sia i fogli PMMA che il nastro a doppia mano con uno scriber per macchine laser CO2 (Figura 1B).
- Accendere lo scriber laser CO2 e collegarlo a un personal computer. Aprire il file del modello progettato utilizzando il software.
- Posizionare i fogli PMMA (275 mm x 400 mm) o il nastro a doppia mano (210 mm x 297 mm) sulla ....
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Risultati
La configurazione dettagliata del chip MOE è illustrata nella figura 1. Il chip microfluidico fornisce un approccio vantaggioso per ridurre le dimensioni di configurazione sperimentale, il volume del campione e il volume del reagente. Il chip MOE è stato progettato per eseguire tre esperimenti di stimolazione EF indipendenti e diverse condizioni di immunosocienza simultaneamente in un unico studio (Figura 3). Inoltre, il chip MOE.......
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Discussione
Durante la fabbricazione del chip MOE, gli adattatori sono attaccati allo Strato 1 del chip MOE con colla cianoacrilato ad azione rapida. La colla viene applicata su 4 angoli degli adattatori e quindi la pressione viene applicata uniformemente sugli adattatori. L'eccesso di quantità di colla deve essere evitato per garantire la completa polimerizzazione della colla. Inoltre, l'assemblaggio del chip MOE completato viene incubato in una camera a vuoto. Questo passaggio aiuta a rimuovere le bolle tra lo strato PMMA, il nast.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il professor Tang K. Tang, Istituto di Scienze Biomediche, Academia Sinica, per la sua assistenza nella fornitura di cellule staminali neurali del topo e progenitrici (mNPC). Gli autori ringraziano anche il professor Tang K. Tang e la signora Ying-Shan Lee, per la loro preziosa discussione sulla differenziazione degli MNPC.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Substrati in PMMA da 1 mm (strati 1-3) | BHT | K2R20 | Polimetilmetacrilato (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| tubo di plastica da 15 mL | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Tubo a fondo conico con tappo, assemblato, presterilizzato |
| Siringa da 3 mL | TERUMO | DVR-3413 | Siringhe orali da 3 mL, senza ago |
| PMMA da 3 mm di grado ottico (Strato 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY Foglio PMMA | Rubinetto a 3 vie in PMMA di grado ottico |
| NIPRO | NCN-3L | Rubinetto sterile monouso a 3 vie | |
| Siringa da 5 ml | TERUMO | DVR-3410 | Siringhe orali da 5 mL, senza ago |
| Adattatore | Dong Zhong Co., Ltd. | Adattatore PMMA personalizzato | |
| Agarosio | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarosio, bassa temperatura di gelificazione |
| Amplificatore | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | Amplificatore ad alta tensione |
| Software AutoCAD Autodesk | Versione educativa | Disegno | |
| Supplemento B-27 | Gibco | 12587-010 | Integratore B-27 (50x), meno vitamina A |
| Fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Chiamato anche FGF umano ricombinante-basico |
| Tappo di gomma nera | TERUMO | DVR-3413 | Da 3 mL siringhe orali, senza ago |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Reagente bloccante |
| Centrifuga | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuga |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Acquistato da http://www.lttcorp.com/index.htm |
| connettore a cono | IDEX Health & Science | F-120X | Pezzo unico a tenuta di dita 10-32 conico, per 1/16" OD naturale |
| adattatore Cone-Luer | IDEX Salute & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Luer da femmina a femmina, |
| PEEK Microscopio a fluorescenza confocale | Leica Microsystems | TCS SP5 | Manuale utente Leica TCS SP5, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Fotocamera digitale | OLYMPUS | E-330 | Acquisizione automatica di immagini time-lapse |
| Oscilloscopio digitale | Tektronix | TDS2024 | Misura i segnali di tensione o corrente nel tempo in un circuito o componente elettronico per visualizzare ampiezza e frequenza. |
| Nastro biadesivo | 3M | PET 8018 | Acquistato da http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco' s Eagle modificato' s medium/Miscela di nutrienti di prosciutto F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, polvere, HEPES |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, polvere, senza calcio, senza magnesio |
| Multiplexer EF | Asiatic Sky Co., Ltd. | Personalizzato | Monitora e controlla la corrente elettrica nei singoli canali |
| Fattore di crescita epidermico (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Chiamato anche EGF umano ricombinante |
| Colla cianoacrilica ad azione rapida | 3M | 7004T | Adesivo istantaneo di forza (liquido) |
| Connettore a fondo piatto | IDEX Health & Science | P-206 | Dado maschio senza flangia Delrin, 1/4-28 fondo piatto, per 1/16" OD blu |
| Generatore di funzioni | Agilent Technologies | 33120A | Sintetizzato a 15 MHz ad alte prestazioni generatore di funzioni con capacità di forma d'onda arbitraria incorporata |
| IgG H& L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Capra anti-topo IgG H& L (Alexa Fluor 488) capra preadsorbita |
| anti-coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Anticorpo secondario policlonale di capra contro le IgG di coniglio - H& L (Alexa Fluor 555), preadsorbito |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Colorazione nucleare |
| Software ImageJ | National Institutes of Health | 1.48v | Analizza le immagini fluorescenti |
| Indio... stagno– vetro ossido (ITO) | Merck | 300739 | Per riscaldatore ITO |
| Microscopio a contrasto di fase invertito | OLYMPUS | CKX41 | Per l'osservazione della morfologia cellulare |
| Termocoppia di tipo K | Tecpel | TPK-02A | Temperatura termocoppie |
| adattatore Luer | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adattatore femmina Luer a 1/4-28 maschio |
| polipropilene Luer lock siringa | TERUMO | DVR-3413 | Per ponti di sale agar |
| Topo anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrociti marcatore |
| Oligodendrocita pennarello O4 R | & Sistemi D | MAB1326 | Marcatore di oligodendrociti |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agente |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Vita di base | BL2651 | Soluzione di lavaggio |
| Poli-L-lisina (PLL) | SIGMA | P4707 | Soluzione di rivestimento |
| Occhiali di copertura di precisione spessore n. 1,5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Tavolino motorizzato X-Y-Z programmabile | Tanlian Inc | Personalizzato | Acquistato da http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proporzionale... integrale– regolatore derivativo (PID) | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Regolatore di temperatura |
| Tubo in PTFE | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Diametro esterno 1/16 pollici | Tubo in PTFE traslucido bianco |
| Coniglio anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Marcatore neurone |
| Pompa a siringa | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 pompa a siringa singola programmabile |
| TFD4 detergente | FRANKLAB | TFD4 | Detergente per vetri |
| di copertura Bonder termico | Kuan-MIN Tech Co. | Personalizzato Acquistato da http://kmtco.com.tw/ | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Soluzione permeabilizzata |
| Pulitore ad ultrasuoni | LEO | LEO-300S | Pulitore ad ultrasuoni per sterilizzatori |
| Camera a vuoto | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Forno di essiccazione |
| sottovuoto Tappo a tenuta di dita bianco | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 a fondo piatto, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
Riferimenti
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orient....
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