Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi della mutagenesi mirata CRISPR/Cas9 nelle mosche della sabbia: raccolta, iniezione, allevamento e identificazione degli insetti, nonché selezione di mutazioni di interesse.
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Articolo metodologico
Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microiniezione embrionale per CRISPR/Cas9 Mutagenesi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le mosche di sabbia sono i vettori naturali per le specie di Leishmania, i parassiti protozoici che producono un ampio spettro di sintomi che vanno dalle lesioni cutanee alla patologia viscerale. Decifrare la natura delle interazioni vettore/parassita è di primaria importanza per una migliore comprensione della trasmissione della Leishmania ai loro ospiti. Tra i parametri che controllano la competenza del vettore della mosca della sabbia (cioè la loro capacità di trasportare e trasmettere agenti patogeni), i parametri intrinseci a questi insetti hanno dimostrato di svolgere un ruolo chiave. La risposta immunitaria degli insetti, ad esempio, influisce sulla competenza vettoriale della mosca della sabbia in Leishmania. Lo studio di tali parametri è stato limitato dalla mancanza di metodi di modifica dell'espressione genica adattati per l'uso in questi organismi non modello. La downregolazione genica da parte di un piccolo RNA interferente (siRNA) è possibile, ma oltre ad essere tecnicamente impegnativa, il silenziamento porta solo a una perdita parziale della funzione, che non può essere trasmessa di generazione in generazione. La mutagenesi mirata della tecnologia CRISPR/Cas9 è stata recentemente adattata alla mosca di sabbia Phlebotomus papatasi. Questa tecnica porta alla generazione di mutazioni trasmissibili in un luogo appositamente scelto, permettendo di studiare i geni di interesse. Il sistema CRISPR/Cas9 si basa sull'induzione di rotture mirate di DNA a doppio filamento, successivamente riparate da NHEJ (Non-Homologous End Joining) o da Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consiste in una semplice chiusura dell'interruzione e spesso porta a piccoli eventi di inserimento / eliminazione. Al contrario, l'HDR utilizza la presenza di una molecola di DNA donatore che condivide l'omologia con il DNA bersaglio come modello per la riparazione. Qui, presentiamo un metodo di microiniezione embrionale mosca di sabbia per la mutagenesi mirata da PARTE di CRISPR / Cas9 utilizzando NHEJ, che è l'unica tecnica di modifica del genoma adattata ai vettori di mosca della sabbia fino ad oggi.
Introduzione
Le malattie trasmesse da vettori sono una delle principali minacce per la salute pubblica in costante evoluzione. Centinaia di specie vettoriali diffuse in famiglie filogeniche molto distinte (ad esempio, zanzare, zecche, pulci) sono responsabili della trasmissione di un numero enorme di agenti patogeni microbici, causando più di 700.000 morti umane all'anno, secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità. Tra gli insetti vettoriali, le mosche di sabbia flebotomina (Diptera, Psychodidae) costituiscono un vasto gruppo, con 80 specie vettoriali comprovate che mostrano tratti fenotipici distinti e capacità vettoriali presenti in diverse regioni geografiche. Sono vettori per i parassiti protozoi del genere Leishmania, causando circa 1,3 milioni di nuovi casi di leishmanie e tra i 20.000 e i 30.000 morti all'anno. Gli esiti clinici delle leishmanie sono diversi, con sintomi che vanno dalle lesioni cutanee autolimitanti alla diffusione viscerale che è fatale in assenza di trattamento.
Le mosche di sabbia sono insetti strettamente terrestri. Il loro ciclo di vita, relativamente lungo rispetto ad altri Ditteri, dura fino a tre mesi, a seconda di diversi parametri come temperatura, umidità e nutrizione. Consiste in uno stadio embrionale (da 6 a 11 giorni), quattro stadi larvali (della durata totale di 23-25 giorni) e uno stadio pupale (da 9 a 10 giorni) seguito da metamorfosi e poi età adulta. Le mosche di sabbia richiedono un ambiente umido e caldo per l'allevamento. Sia i maschi che le femmine si nutrono di zuccheri, ottenuti in natura dai nettari di fiori. Solo le femmine sono emoderivatrici, in quanto richiedono proteine ottenute dalla farina di sangue per la produzione di uova1.
Un obiettivo importante della ricerca è identificare la natura delle interazioni vettore / parassita che portano allo sviluppo di infezioni trasmissibili. Come per altri insetti vettoriali, i parametri intrinseci alle mosche di sabbia hanno dimostrato di influire sulla loro competenza vettoriale, che è definita come la loro capacità di trasportare e trasmettere agenti patogeni ai loro ospiti. Ad esempio, l'espressione delle galectine da parte delle cellule di phlebotomus papatasi sand fly midgut, agendo come recettori che riconoscono i componenti della superficie parassitaria, può influenzare direttamente la loro competenza vettoriale per la Leishmania major2,3. La via di risposta immunitaria degli insetti, ImmunoDeficiency (IMD), è anche cruciale per la competenza del vettore di mosca della mosca della sabbia Phlebotomus papatasi per Leishmania major4. Un ruolo critico per le vie di risposta immunitaria degli insetti vettoriali nel controllo della loro trasmissione di agenti patogeni infettivi è stato segnalato in modo simile nelle zanzare Aedes aegypti 5,6,7, nella mosca tse-tse Glossina morsitans8e nelle zanzare Gambiae Anopheles 9,10.
Gli studi sulle interazioni mosca di sabbia /Leishmania sono stati limitati dalla mancanza di metodi di modifica dell'espressione genica adattati per l'uso in questi insetti. Solo la downregolazione genica da parte di piccoli RNA interferenti (siRNA) erastata eseguita 11,12,13,14 fino a poco tempo fa. La tecnica, limitata dalla mortalità associata alla microiniezione delle femmine adulte, porta solo a una parziale perdita di funzione, che non può essere trasmessa di generazione in generazione.
La tecnologia CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato la ricerca genomica funzionale in organismi non modello come le mosche della sabbia. Modificato dal sistema immunitario adattivo nei procarioti per la difesa contro i batteriofagi15,16, il sistema CRISPR Cas9 è stato rapidamente adattato come strumento di modifica del genoma per organismi eucarioti superiori, compresi gli insetti. Il principio dell'editing mirato del genoma CRISPR/Cas9 si basa sulla complementarietà di un singolo RNA guida (sgRNA) a uno specifico locus genomico. La nucleasi Cas9 si lega allo sgRNA e crea una rottura del DNA a doppio filamento (dsDNA) nel DNA genomico in cui lo sgRNA si associa alla sua sequenza complementare. Il complesso Cas9-sgRNA è guidato alla sequenza bersaglio da 17 a 20 basi complementari nello sgRNA al locus scelto, la rottura dsDNA può quindi essere riparata da due percorsi indipendenti: giunzione finale non omologa (NHEJ) o riparazione diretta dall'omologia (HDR)17. La riparazione NHEJ comporta una semplice chiusura dell'interruzione, ma spesso porta a piccoli eventi di inserimento / eliminazione. La riparazione del DNA attraverso l'HDR utilizza una molecola di DNA donatore che condivide l'omologia con il DNA bersaglio come modello per la riparazione. Gli insetti possiedono entrambi i macchinari.
La tecnologia CRISPR/Cas9 può generare mutazioni in un luogo scelto, attraverso la via di riparazione NHEJ; o per strategie di editing del genoma più complesse, come knock-in o giornalisti di espressioni, attraverso il percorso HDR con un modello di donatore appropriato. Nelle mosche di sabbia, gli alleli mutanti nulli del fattore di risposta immunitaria Relish sono stati generati attraverso CRISPR mediato da NHEJ in Phlebotomus papatasi4. Gli embrioni di mosca della sabbia sono stati iniettati anche in un altro studio con un mix CRISPR / Cas9 che prende di mira il gene che codifica giallo. Tuttavia, nessun adulto portatore della mutazione è statoprodotto 18. Descriviamo qui un metodo dettagliato di mutagenesi mirata della mosca della sabbia da CRISPR/Cas9 mediata da NHEJ, con particolare attenzione alla microiniezione embrionale, una fase critica del protocollo.
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Protocollo
L'uso dei topi come fonte di sangue per l'alimentazione delle chiazza di sabbia è stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti nazionali di salute (NIH). Il protocollo è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del NIAID, NIH (numero di protocollo LPD 68E). Gli invertebrati non sono coperti dalle linee guida NIH.
1. Preparazione dell'ago(figura 1)
- Tirare aghi e smussare come descritto in Meuti e Harrell19. In breve, tirare gli aghi su un estrattore di micropipette di vetro a doppio stadio, utilizzando capillari di vetro borosilicato.
- Affilare gli aghi smussando bagnati sul smussatore di micropipette, utilizzando una pietra extra fine.
2. Raccolta e micromanipolazione degli embrioni(figura 2)
- Cinque giorni prima del giorno dell'iniezione, il sangue alimenta le femmine di mosca e la mosca come viene eseguita regolarmente per il mantenimento della colonia. Per i dettagli sulle procedure di allevamento delle colonie di mosche di sabbia e sul materiale richiesto, fare riferimento a Avvocato etal.
- Un giorno dopo l'alimentazione del sangue, cattura le femmine nutrite con sangue da gruppi di 100-150 in vasi di gesso con una porta laterale. Mantieni le femmine nutrendole con una soluzione di zucchero (30% di saccarosio - abbastanza volume per immergere un piccolo batuffolo di cotone) che è usuale per il mantenimento della colonia.
- Al giorno 2-3 dopo l'alimentazione del sangue, NON inumidire i vasi di gesso. Mantenere le femmine su un substrato asciutto impedirà la deposizione prematura delle uova, poiché le femmine preferiscono deporre le uova in un ambiente umido.
- Il giorno 5 dopo l'alimentazione del sangue, eseguire la raccolta dell'embrione, la micromanipolazione e la microiniezione. Introdurre una carta filtrante umida nella camera di deposizione delle uova. Gli embrioni appena deposti non hanno un corone completamente sviluppato e appaiono bianchi. Utilizzare carta da filtro nera durante la procedura per facilitare la visualizzazione degli embrioni bianchi.
- Trasferire un piccolo gruppo di femmine dal vaso di gesso alla camera di deposizione delle uova attraverso le porte laterali utilizzando un aspiratore di bocca. La presenza di un substrato umido (la carta filtrante) induce le femmine a ovoposit.
- Dopo 30-60 minuti, recuperare con cura la carta filtrante con embrioni appena posati dalla camera. Conservare la carta filtrante e gli embrioni in una piastra di Petri per un massimo di 3 ore. Durante questo periodo, valutare regolarmente il livello di umidità della carta da filtro per assicurarsi che rimanga umida. Durante questo periodo, ripetere i passaggi da 2.4 a 2.6 con nuovi gruppi di femmine e raccogliere il maggior numero possibile di embrioni.
- Preparare le diapositive al microscopio per l'iniezione: raccogliere manualmente le uova una per una con un pennello molto fine e trasferirle con cura su un altro pezzo di carta filtrante nera umida posta su uno scivolo al microscopio sormontato da un copripazzo di vetro.
- Aggiungere acqua alla carta filtrante, abbastanza da mantenere gli embrioni umidi ma non facendoli galleggiare lontano dal coverslip o essere succhiati sotto il coverslip. Allinea gli embrioni contro il copriscivolo. Il coverslip funge da backstop impedendo alle uova di rotolare via durante l'iniezione.
3. Iniezioni di embrioni (Figura 3)
- Inizia le iniezioni da 2,5 a 3 ore dopo l'inizio della raccolta delle uova. Eseguire iniezioni a temperatura ambiente e umidità ambiente di laboratorio.
- Assicurarsi che gli embrioni allineati abbiano abbastanza acqua in modo che siano mantenuti umidi.
NOTA: È fondamentale che gli embrioni siano mantenuti umidi durante le iniezioni. Se non sono umidi durante il processo di iniezione, le iniezioni diventano difficili perché l'ago ha difficoltà a perforare l'embrione. La corretta quantità di acqua è il punto in cui gli embrioni hanno un menisco d'acqua intorno a loro, ma il coverslip non galleggia sopra l'acqua causando la spinta degli embrioni sotto il coverslip. È fondamentale monitorare la quantità di acqua intorno agli embrioni durante le iniezioni. Aggiungere acqua se necessario per mantenere gli embrioni umidi. - Aggiungere l'acqua con cura bagnando un pennello con acqua e trasferendo l'acqua sul retro della carta filtrante. L'aggiunta di acqua in questo modo consente di aggiungere acqua in modo lento e controllato in modo che venga aggiunto quanto basta per mantenere gli embrioni umidi. Troppa acqua può far galleggiare gli embrioni fuori allineamento, rendendo difficile iniettare gli embrioni.
- Miscela di iniezione di carico posteriore nell'ago di microiniezione. Aggiungere circa 0,5 a 1 μL di miscela di iniezione nell'ago utilizzando un riempitivo ad ago borosilicato disegnato a mano, è anche possibile utilizzare punte di pipetta di caricamento in gel. La miscela di iniezione è composta da uno o più RNA guida (80 ng/μL ciascuno) progettati per colpire uno specifico locus mescolato con la proteina Cas9 ricombinante commerciale (300 ng/μL).
- A partire dalla pressione di iniezione a 30 psi, premere il grilletto di iniezione per espellere l'aria dalla punta dell'ago. Ciò costringerà la miscela di iniezione alla punta dell'ago permettendo al mix di iniezione di fluire. A questo punto, aumentare lentamente la pressione di tenuta / costante fino a quando il materiale di iniezione inizia a fluire, quindi di nuovo fuori dalla tenuta / pressione costante in modo che sia appena sotto il punto della miscela di iniezione che scorre dall'ago. L'impostazione recintata dovrebbe fornire abbastanza materiale di iniezione in modo che si possa vedere una piccola quantità di materiale per entrare nell'embrione.
NOTA: L'iniezione di embrioni di mosca di sabbia sotto olio di alocarbonio simile ad altri protocolli utilizzati per drosofilia e zanzare è stata inizialmente testata, tuttavia la percentuale di sopravvivenza per queste iniezioni era molto bassa. La sopravvivenza è stata migliorata passando alle iniezioni su carta filtrante umida come descritto sopra. - Inserire l'ago nel lato dell'embrione. Utilizzare il copripasta dietro l'embrione come backstop che aiierà l'ago a perforare l'embrione. Fornire una piccola quantità di miscela di iniezione nell'embrione prima di rimuovere delicatamente l'ago.
- Immediatamente dopo la rimozione dell'ago, premere l'iniettore per rimuovere qualsiasi materiale riempito di nuovo dalla punta dell'ago. Questo aiuterà a prevenire l'intasamento dell'ago.
- Procedi verso l'embrione successivo. Tra ogni iniezione, assicurarsi che la carta filtrante sia umida e che l'ago non sia intasato.
- Una volta che tutti gli embrioni sono stati iniettati, contare il numero di embrioni iniettati per mantenere un conteggio in esecuzione.
- Rimuovere il coverslip aggiungendo acqua alla carta filtrante in modo che il coverslip galleggi. A questo punto, utilizzare una sonda (bastoncino applicatore di legno con perno di insetto incollato alla punta) per tenere la carta filtrante in posizione mentre un dito viene utilizzato per allontanare il coperchio dagli embrioni iniettati.
- Togliere l'acqua in eccesso dalla carta filtrante una volta rimossa la copertina.
4. Allevamento post-iniezione (G0)(figura 4)
- Trasferire la carta filtrante con gli embrioni sopra diversi strati di carta filtrante umida posta in una piastra di Petri per mantenere l'umidità. Tieni qui gli embrioni durante il tempo necessario per iniettare altri embrioni. Gli embrioni possono essere trattenuti per un massimo di 3 ore come questo. Dopo l'iniezione diventano lentamente marroni.
- Una volta che tutti gli embrioni sono stati iniettati, trasferirli manualmente su vasi di gesso di piccole dimensioni precedentemente inumiditi. Non mettere troppi embrioni in ogni vaso e mantenere la distanza tra di loro, per evitare possibili contaminazioni fungine tra gli individui. Coprire i vasi con uno schermo e conservarli come sarebbe in genere fatto per le uova di colonia di mosca di sabbia, mantenute in incubatrici con umidità del 70% e 26 °C, durante il loro intero sviluppo.
- Il primo giorno dopo l'iniezione, rimuovere tutti gli embrioni danneggiati e morti con un pennello. Aggiungere 100 μL di acido propionico allo 0,5%, goccia a goccia, sui vasi di gesso contenenti gli embrioni iniettati per limitare la contaminazione fungina. Il rilascio di citoplasma da embrioni danneggiati durante il processo di iniezione è particolarmente favorevole alla crescita fungina.
- Controllare i vasi di gesso ogni giorno e rimuovere eventuali embrioni cattivi o morti. Se è presente il fungo, rimuovere tutti gli embrioni infetti e aggiungere alcune gocce di acido propionico 0,5%.
- Le larve si schiudono tra il giorno 8 e il 12 dopo l'iniezione. Due volte al giorno, trasferire le larve appena emerse su nuovi vasi di gesso, in gruppi di massimo 5-10. Aggiungi una piccola quantità di cibo e controlla il cibo 2-3 volte a settimana.
- Monitora attentamente la quantità di cibo larvale, poiché aumenta notevolmente il rischio di contaminazione fungina. Le larve di mosca della sabbia sopravvivono meglio in gruppi, tuttavia possono essere cannibali se non c'è abbastanza cibo.
- Quando le larve si impupano, separale per sesso per mantenere le femmine come vergini. Se ci sono molti sopravvissuti, scarta i maschi e mantieni solo le femmine.
NOTA: Sia i maschi che le femmine possono trasportare e trasmettere mutazioni. Tuttavia, poiché le femmine devono essere tenute vergini prima di essere incrociate, è più facile usare solo le femmine iniettate G0 per evitare di dover separare gli insetti wt dal sesso. I maschi G0 possono essere tenuti come riserva se il numero di sopravvissuti adulti è basso e in questo caso saranno accoppiati con femmine vergini wt ordinate.
5. Selezione e screening degli alleli mutanti(figura 5)
- Attraversa di massa le femmine G0 con i maschi wt in una gabbia. Nutrirli del tutto, come sarebbe stato fatto per il normale mantenimento della colonia.
- Un giorno dopo l'alimentazione del sangue, trasferire ogni femmina G0 con 2-3 wt maschi in singoli tubi di gesso usando un aspiratore bocca. Nutrire le mosche con lo zucchero su un piccolo batuffolo di cotone cambiato ogni giorno e utilizzare una siringa d'acqua per garantire che l'umidità dell'intonaco sia adatta per la deposizione delle uova.
- Dopo che le femmine del G0 hanno deposto le uova (corrispondenti al G1),raccolgono i loro corpi in tubi Eppendorf individuali annotati per il genotipizzazione successivo. Mantenere gli embrioni come di solito fatto per le colonie wt.
- Estrarre il DNA dalle femmine G0 con il metodo di scelta.
- Schermare il DNA per la presenza di mutazioni, ad esempio progettando un test PCR utilizzando primer che circondano la regione dei tagli CRISPR previsti.
- Conservare solo gli embrioni G1 deposti dalle femmine G0 mostrando prove di trasformazione. Quando questi embrioni G1 si sviluppano in pupe, separali per sesso e mantieni solo le femmine. Attraversare le femmine G1 dalla stessa femmina G0 ai maschi wt, nutrirle di sangue, quindi trasferirle in piccoli gruppi di 2-3 femmine e 4-5 maschi in contenitori di piccole dimensioni.
NOTA: Tutti gli individui G1 hanno la possibilità di portare una mutazione unica, quindi se il numero di individui sopravvissuti non ètroppo alto, allora è meglio attraversare le femmine G 1 individualmente con i maschi wt. Il caso di diverse femmine che portano una mutazione diversa presente in uno stesso tubo è raro ma può verificarsi. Se tale caso viene osservato dopo il genotipizzazione, le femmine di progenie G2 devono quindi essere accoppiate individualmente ai maschi wt. Questo schema di accoppiamento evita la possibilità di mutazioni multiple nella progenie. - Dopo la deposizione delle uova, raccogli i corpi femminili del G1 e cerca le mutazioni. Conservare solo i tubi in cui almeno una femmina ha mostrato prove di mutazione.
- Per le generazioni successive fare singole coppie in-crosses. Dopo la deposizione delle uova, scherma i genitori per la presenza di mutazione. Ripetere ad ogni generazione fino a quando entrambi i genitori sono omozigoti per la stessa mutazione. Una volta identificati, saranno i fondatori di uno stock mutante omozigote.
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Risultati
Il protocollo di microiniezione CRISPR/Cas9 qui descritto per generare mutanti di mosca di sabbia è stato stabilito in una precedente pubblicazione4. Questo approccio produsse una mutagenesi altamente efficiente, poiché 11 individui su 540 sopravvissero alla procedura, di cui 9 mutanti. Quando si progettano guide per la mutazione CRISPR/Cas9, un primo passo critico consiste nel sequenziare la regione intorno all'area da prendere di mira. Il modello per il sequenziamento dovrebbe essere dal ceppo c...
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Discussione
Presentiamo qui un metodo di microiniezione embrionale recentemente sviluppato per la mutagenesi mirata di CRISPR/Cas9 in mosche di sabbia Phlebotomus papatasi. La microiniezione embrionale per la modificazione genetica degli insetti è stata sviluppata in Drosophila a metà degli anni'80 21 ed è ora regolarmente utilizzata in un'ampia varietà di insetti. Altri metodi per la consegna di materiali di modificazione genetica sono stati sviluppati per l'uso negli insetti, come ReMOT
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Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Vanessa Meldener-Harrell per la lettura critica del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Carta da filtro nera 4,25 cm PK100 | VWR | 28342-012 | Tagliare in rettangoli di circa 46 X 22 mm. Questi vengono posizionati tra il vetrino e il vetrino coprioggetti e fungono da strato di base umido per gli embrioni durante l'iniezione. |
| Vetrini coprioggetti | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Microscopio da dissezione | Qualsiasi marca | Per l'allineamento degli embrioni Vetrini | |
| Fisher Scientific | 12-550-A3 | Strato di base della configurazione per microiniezione Figura 2A | |
| Gabbia per insetti | su misura o diverse opzioni commerciali | gabbia in policarbonato per adulti che tengono e si accoppiano Avvocato, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton e Petr Volf. “ Colonizzazione in laboratorio e allevamento di massa di flebotomi (Diptera, Psychodidae)." Parassita 24. Consultato il 6 agosto 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Cibo larvale | realizzato | su misura un mix di cibo di coniglio e feci di coniglio Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton e Petr Volf. " Colonizzazione in laboratorio e allevamento di massa di flebotomi (Diptera, Psychodidae)." Parassita 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Utilizzato per riempire gli aghi per microiniezione |
| Aspiratore orale | John W. Hock Company | Modello 612 | aspiratore orale con filtro HEPA |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microscopio per microiniezione | |
| Ovipots | Nalge company | Gli ovipot sono realizzati con vasi di plolypropilene da 125 ml o 500 ml modificati praticando fori di 2,5 cm sul fondo e riempiti con 1 cm di gesso di Parigi. Avvocato, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton e Petr Volf. “ Colonizzazione in laboratorio e allevamento di massa di flebotomi (Diptera, Psychodidae)." Parassita 24. Consultato il 6 agosto 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Pennello 6-0 | Qualsiasi azienda di forniture artistiche | n/a | Utilizzato per allineare gli embrioni |
| Acido propionico | Sigma-Aldrich | 402907 | agente antimicotico |
| Capillari di vetro standard | Precision Instruments | 1B100-3 | Utilizzato per realizzare aghi per microiniezione |
| Controller Trio-MPC100 e manipolatore MP845 | Controller per microiniezione Sutter Instruments | e Micromanipolatore |
Riferimenti
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