Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi della mutagenesi mirata CRISPR/Cas9 nelle mosche della sabbia: raccolta, iniezione, allevamento e identificazione degli insetti, nonché selezione di mutazioni di interesse.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microiniezione embrionale per CRISPR/Cas9 Mutagenesi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le mosche di sabbia sono i vettori naturali per le specie di Leishmania, i parassiti protozoici che producono un ampio spettro di sintomi che vanno dalle lesioni cutanee alla patologia viscerale. Decifrare la natura delle interazioni vettore/parassita è di primaria importanza per una migliore comprensione della trasmissione della Leishmania ai loro ospiti. Tra i parametri che controllano la competenza del vettore della mosca della sabbia (cioè la loro capacità di trasportare e trasmettere agenti patogeni), i parametri intrinseci a questi insetti hanno dimostrato di svolgere un ruolo chiave. La risposta immunitaria degli insetti, ad esempio, influisce sulla competenza vettoriale della mosca della sabbia in Leishmania. Lo studio di tali parametri è stato limitato dalla mancanza di metodi di modifica dell'espressione genica adattati per l'uso in questi organismi non modello. La downregolazione genica da parte di un piccolo RNA interferente (siRNA) è possibile, ma oltre ad essere tecnicamente impegnativa, il silenziamento porta solo a una perdita parziale della funzione, che non può essere trasmessa di generazione in generazione. La mutagenesi mirata della tecnologia CRISPR/Cas9 è stata recentemente adattata alla mosca di sabbia Phlebotomus papatasi. Questa tecnica porta alla generazione di mutazioni trasmissibili in un luogo appositamente scelto, permettendo di studiare i geni di interesse. Il sistema CRISPR/Cas9 si basa sull'induzione di rotture mirate di DNA a doppio filamento, successivamente riparate da NHEJ (Non-Homologous End Joining) o da Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consiste in una semplice chiusura dell'interruzione e spesso porta a piccoli eventi di inserimento / eliminazione. Al contrario, l'HDR utilizza la presenza di una molecola di DNA donatore che condivide l'omologia con il DNA bersaglio come modello per la riparazione. Qui, presentiamo un metodo di microiniezione embrionale mosca di sabbia per la mutagenesi mirata da PARTE di CRISPR / Cas9 utilizzando NHEJ, che è l'unica tecnica di modifica del genoma adattata ai vettori di mosca della sabbia fino ad oggi.
Introduzione
Le malattie trasmesse da vettori sono una delle principali minacce per la salute pubblica in costante evoluzione. Centinaia di specie vettoriali diffuse in famiglie filogeniche molto distinte (ad esempio, zanzare, zecche, pulci) sono responsabili della trasmissione di un numero enorme di agenti patogeni microbici, causando più di 700.000 morti umane all'anno, secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità. Tra gli insetti vettoriali, le mosche di sabbia flebotomina (Diptera, Psychodidae) costituiscono un vasto gruppo, con 80 specie vettoriali comprovate che mostrano tratti fenotipici distinti e capacità vettoriali presenti in diverse regioni geografiche. Sono vettori ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
L'uso dei topi come fonte di sangue per l'alimentazione delle chiazza di sabbia è stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti nazionali di salute (NIH). Il protocollo è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del NIAID, NIH (numero di protocollo LPD 68E). Gli invertebrati non sono coperti dalle linee guida NIH.
1. Preparazione dell'ago(figura 1)
- Tirare aghi e smussare come descritto in Meuti e Harrell19. In breve, tirare gli aghi su un estrattore di mic....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il protocollo di microiniezione CRISPR/Cas9 qui descritto per generare mutanti di mosca di sabbia è stato stabilito in una precedente pubblicazione4. Questo approccio produsse una mutagenesi altamente efficiente, poiché 11 individui su 540 sopravvissero alla procedura, di cui 9 mutanti. Quando si progettano guide per la mutazione CRISPR/Cas9, un primo passo critico consiste nel sequenziare la regione intorno all'area da prendere di mira. Il modello per il sequenziamento dovrebbe essere dal ceppo c.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Presentiamo qui un metodo di microiniezione embrionale recentemente sviluppato per la mutagenesi mirata di CRISPR/Cas9 in mosche di sabbia Phlebotomus papatasi. La microiniezione embrionale per la modificazione genetica degli insetti è stata sviluppata in Drosophila a metà degli anni'80 21 ed è ora regolarmente utilizzata in un'ampia varietà di insetti. Altri metodi per la consegna di materiali di modificazione genetica sono stati sviluppati per l'uso negli insetti, come ReMOT
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Vanessa Meldener-Harrell per la lettura critica del manoscritto.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Carta da filtro nera 4,25 cm PK100 | VWR | 28342-012 | Tagliare in rettangoli di circa 46 X 22 mm. Questi vengono posizionati tra il vetrino e il vetrino coprioggetti e fungono da strato di base umido per gli embrioni durante l'iniezione. |
| Vetrini coprioggetti | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Microscopio da dissezione | Qualsiasi marca | Per l'allineamento degli embrioni Vetrini | |
| Fisher Scientific | 12-550-A3 | Strato di base della configurazione per microiniezione Figura 2A | |
| Gabbia per insetti | su misura o diverse opzioni commerciali | gabbia in policarbonato per adulti che tengono e si accoppiano Avvocato, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton e Petr Volf. “ Colonizzazione in laboratorio e allevamento di massa di flebotomi (Diptera, Psychodidae)." Parassita 24. Consultato il 6 agosto 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Cibo larvale | realizzato | su misura un mix di cibo di coniglio e feci di coniglio Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton e Petr Volf. " Colonizzazione in laboratorio e allevamento di massa di flebotomi (Diptera, Psychodidae)." Parassita 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Utilizzato per riempire gli aghi per microiniezione |
| Aspiratore orale | John W. Hock Company | Modello 612 | aspiratore orale con filtro HEPA |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microscopio per microiniezione | |
| Ovipots | Nalge company | Gli ovipot sono realizzati con vasi di plolypropilene da 125 ml o 500 ml modificati praticando fori di 2,5 cm sul fondo e riempiti con 1 cm di gesso di Parigi. Avvocato, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton e Petr Volf. “ Colonizzazione in laboratorio e allevamento di massa di flebotomi (Diptera, Psychodidae)." Parassita 24. Consultato il 6 agosto 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Pennello 6-0 | Qualsiasi azienda di forniture artistiche | n/a | Utilizzato per allineare gli embrioni |
| Acido propionico | Sigma-Aldrich | 402907 | agente antimicotico |
| Capillari di vetro standard | Precision Instruments | 1B100-3 | Utilizzato per realizzare aghi per microiniezione |
| Controller Trio-MPC100 e manipolatore MP845 | Controller per microiniezione Sutter Instruments | e Micromanipolatore |
Riferimenti
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42(2017).
- Pelletier, I., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
