Molte caratteristiche dell'eusocialità degli insetti si basano sulla comunicazione all'interno della colonia e sulla divisione del lavoro. La manipolazione genetica dei geni regolatori chiave negli embrioni di formiche tramite microiniezione e mutagenesi mediata da CRISPR fornisce informazioni sulla natura del comportamento altruistico negli insetti eusociali.
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Articolo metodologico
Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos
In questo articolo
Sommario
Abstract
I tratti unici degli insetti eusociali, come il comportamento sociale e la divisione riproduttiva del lavoro, sono controllati dal loro sistema genetico. Per affrontare il modo in cui i geni regolano i tratti sociali, abbiamo sviluppato formiche mutanti attraverso la consegna del complesso CRISPR in giovani embrioni durante la loro fase sinciziale. Qui, forniamo un protocollo di mutagenesi mediata da CRISPR in Harpegnathos saltator, una specie di formica ponerine che mostra una sorprendente plasticità fenotipica. Le formiche H. saltator sono facilmente allevate in un ambiente di laboratorio. Gli embrioni vengono raccolti per microiniezione con proteine Cas9 e piccoli RNA guida sintetizzati in vitro (sgRNA) utilizzando aghi di quarzo fatti in casa. Gli embrioni post-iniezione vengono allevati al di fuori della colonia. Dopo l'emergere della prima larva, tutti gli embrioni e le larve vengono trasportati in una cassetta nido con alcuni operatori infermieristici per un ulteriore sviluppo. Questo protocollo è adatto per indurre la mutagenesi per l'analisi della fisiologia specifica della casta e del comportamento sociale nelle formiche, ma può anche essere applicato a uno spettro più ampio di imenotteri e altri insetti.
Introduzione
L'evoluzione dell'eusocialità negli insetti, in particolare quelli degli ordini Hymenoptera e Blattodea (ex Isoptera), ha portato a tratti comportamentali unici e spesso sofisticati che si manifestano sia a livello individuale che a livello di colonia. La divisione riproduttiva del lavoro, un tratto che caratterizza i gruppi più avanzati di insetti sociali, coinvolge spesso sistemi di caste composti da diversi gruppi comportamentali e spesso morfologicamente distinti. Tale diversità comportamentale e morfologica tra le caste è controllata non solo dal loro sistema genetico, ma anche spesso dall'ambiente 1,2,3,4, rendendo gli insetti eusociali soggetti attraenti per la ricerca genetica ed epigenetica.
La capacità di manipolare il sistema genetico degli insetti eusociali si è dimostrata impegnativa poiché molte specie non si accoppiano e si riproducono in laboratorio. La maggior parte degli insetti eusociali ha anche pochissimi individui riproduttivi in una colonia, limitando il numero di prole che possono essere prodotti e, di conseguenza, limitando la dimensione del campione per la manipolazione genetica5. Inoltre, molti insetti eusociali hanno tempi di generazione lunghi rispetto agli insetti comunemente usati per gli studi genetici (come Drosophila), aggiungendo alla difficoltà di stabilire linee genetiche5. Alcune specie eusociali, tuttavia, possono generare una grande percentuale di individui riproduttivamente attivi in una colonia, il che allevia le sfide e offre opportunità per stabilire linee mutanti o transgeniche.
Nel caso della specie di formica ponerine, Harpegnathos saltator, tutte le operaie possono diventare riproduttive attive alla morte di una regina o all'isolamento sociale. Questi lavoratori sono indicati come "gamergates" e possono essere utilizzati per generare nuove colonie6. Inoltre, ci può essere più di un gamergate presente in una colonia, aumentando così la produzione di prole 5,7,8. Finora, linee mutanti e/o transgeniche sono state sviluppate nell'ape mellifera europea, Apis mellifera, e nelle specie di formiche, H. saltator, Ooceraea biroi e Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Le analisi genetiche nelle api e nelle formiche sociali hanno aperto la strada a una migliore comprensione dell'eusocialità, fornendo una serie di opportunità per studiare i geni e il loro impatto sul comportamento degli insetti eusociali e sulla fisiologia specifica della casta.
Qui, forniamo un protocollo per la modificazione genetica tramite il sistema CRISPR / Cas9 in H. saltator. In particolare, questa tecnica è stata utilizzata per generare una mutazione germinale in orco, il gene che codifica il co-recettore obbligato di tutti i recettori odoranti (OR)10. I geni OR sono stati notevolmente espansi negli insetti eusociali imenotteri16 e orco svolge un ruolo essenziale nell'olfatto degli insetti; in sua assenza, le sale operatorie non si assemblano o non funzionano normalmente. Le mutazioni del gene orco interrompono quindi la sensazione olfattiva, lo sviluppo neurale e i comportamenti sociali associati 9,10.
In questo protocollo, le proteine Cas9 e i piccoli RNA guida (sgRNA) vengono introdotti negli embrioni di formica utilizzando la microiniezione allo scopo di indurre la mutagenesi di un gene bersaglio. Qui, descriveremo la procedura di microiniezione in dettaglio insieme alle indicazioni riguardanti la cura delle colonie e degli embrioni iniettati. Questi metodi sono appropriati per indurre la mutagenesi in una varietà di geni diversi nelle formiche H. saltator e possono essere applicati a uno spettro più ampio di insetti imenotteri.
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Protocollo
1. Manutenzione regolare delle colonie di salatori di Harpegnathos
- Mantenere colonie selvatiche di H. saltator in scatole di plastica trasparente in una sala di allevamento delle formiche a 22-25 °C e un fotoperiodo di 12 ore di luce: 12 ore di buio (12L:12D) programma di illuminazione.
- Utilizzare piccole scatole (9,5 x 9,5 cm2) per allevare singoli lavoratori o piccole colonie. Utilizzare scatole medie (19 x 13,5 cm 2) o scatole grandi (27 x 19 cm2) per allevare colonie più grandi (Figura 1).
- Per creare cassette nido, utilizzare l'intonaco per realizzare pavimenti per le scatole. Mentre l'intonaco bagnato si sta asciugando nelle scatole medie e grandi, premere un blocco di schiuma nell'intonaco a pochi centimetri di profondità e a pochi centimetri dal retro della scatola per designare una regione di nido inferiore. Una volta che l'intonaco si è asciugato, coprire la regione del nido designata con un pezzo di vetro quadrato.
NOTA: Nelle scatole piccole, non è necessario designare una regione di nido inferiore. Se le formiche trascurano di utilizzare la regione del nido inferiore designata, può essere utile coprire il vetro con un pezzo quadrato di cellophane rosso. Ciò dà l'impressione di uno spazio sotterraneo buio simile ai nidi che H. saltator usa in natura e può incoraggiarli a spostare la loro covata nella regione designata.
- Dai da mangiare alle colonie con grilli vivi due volte a settimana.
NOTA: Le colonie dovrebbero essere nutrite abbastanza da consumare tutti i grilli prima della loro prossima poppata. Dai da mangiare a qualsiasi formica isolata e colonia di formiche mutanti con grilli pre-punti dai lavoratori di una colonia regolare 2-3 volte alla settimana. - Applicare regolarmente acqua sul pavimento della cassetta nido in gesso usando una bottiglia di lavaggio.
NOTA: L'intonaco deve essere abbastanza umido da non sembrare polveroso al tatto, ma dovrebbe essere abbastanza asciutto da far assorbire tutta l'acqua aggiunta dall'intonaco. È importante che i nidi non vengano annaffiati eccessivamente. In media, le cassette nido avranno bisogno di una piccola quantità di acqua aggiunta una volta alla settimana. - Ogni volta che si verifica l'alimentazione, rimuovere la spazzatura e gli individui morti. Congelare tutti i rifiuti e le formiche morte durante la notte a -30 ° C prima di smaltire questi materiali come spazzatura normale.
- Aggiungere periodicamente un pizzico di segatura essiccata alle colonie; Questo aiuta le larve mentre subiscono la pupa e aiuta i lavoratori a mantenere pulita la cassetta nido.
2. Preparazione di aghi per microiniezione in vetro di quarzo
- Utilizzare un estrattore di micropipette per tirare gli aghi per microiniezione di vetro.
- Selezionare il bicchiere da tirare. Assicurarsi che il vetro utilizzato sia stato conservato in un ambiente pulito e privo di polvere.
NOTA: Qui, per produrre aghi per microiniezione è stato utilizzato vetro al quarzo filamentoso a parete sottile con diametro esterno di 1,0 mm, diametro interno di 0,5 mm e lunghezza di 7,5 cm. Se si inietta un embrione dal corpo molle, possono essere applicabili anche aghi borosilicati, ma gli aghi borosilicati non sono in grado di penetrare il corion duro. - Impostare le impostazioni dei parametri dell'estrattore. Utilizzare un processo in due fasi per tirare gli aghi di microiniezione per gli embrioni di H. saltator : i parametri per la prima fase includono calore di 575, filamento di 3, velocità di 35, ritardo di 145 e trazione di 75; I parametri della seconda fase includono calore di 425, filamento di 0, velocità di 15, ritardo di 128 e una trazione di 200. Dopo la seconda fase, assicurarsi che l'ago risultante abbia una conicità di 2 mm e una punta di 0,5 μm (Figura 2).
NOTA: questo insieme di parametri, insieme ai parametri per altri tipi di aghi, è disponibile nel Manuale operativo17. I manuali per gli estrattori di pipette spesso forniscono i parametri consigliati per una varietà di tecniche. Potrebbero essere necessari alcuni tentativi ed errori per determinare quali parametri generano gli aghi migliori per esigenze specifiche. Un cono corto è ideale per le iniezioni di H. saltator, in quanto può penetrare il corion duro degli embrioni di H. saltator. Se si inietta un embrione morbido, come uno che è stato dechorionato (ad esempio, Drosophila), un cono più lungo di circa 10 mm può dare risultati migliori. I manuali operativi per gli estrattori di pipette di solito forniscono parametri specifici per tirare aghi adatti alle diverse esigenze. È importante indossare guanti durante la manipolazione di filamenti di vetro e l'estrazione degli aghi. Gli oli a mani nude possono trasferirsi al vetro se i guanti non vengono indossati. - Una volta impostati i parametri, utilizzare un estrattore di micropipette per tirare gli aghi per la microiniezione. Assicurarsi che gli aghi siano conservati in un ambiente privo di polvere e pulito fino all'uso.
NOTA: Si consiglia di utilizzare aghi per microiniezione appena tirati. Se si utilizzano aghi pre-tirati, devono essere conservati correttamente in una scatola per evitare danni alle punte degli aghi e potenziali contaminazioni. Gli aghi che sono stati sottoposti a conservazione a lungo termine non sono raccomandati per le iniezioni di embrioni.
3. Preparazione del microiniettore
- Utilizzare un microiniettore per iniettare i materiali desiderati negli embrioni di formica.
- Preparare la miscela di microiniezione di proteine Cas9 e piccoli RNA guida sintetizzati in vitro (sgRNA)10. Tenere la miscela su ghiaccio fino al momento di caricare un ago per microiniezione. Quando non in uso, conservare la miscela di microiniezione a -80 °C.
NOTA: Le concentrazioni variano nelle diverse specie. Un'alta concentrazione può causare un'elevata mortalità, mentre una bassa concentrazione può ridurre l'efficienza. Utilizziamo 0,2 μg/μL di proteine Cas9 e 0,2 μg/μL sgRNA per l'iniezione di embrioni di H. saltator. La progettazione dei nostri sgRNA ha seguito un protocollo18 precedentemente stabilito. Le sequenze geniche sono state ottenute da database del DNA. Anche la sequenza del genoma di H. saltator è stata precedentemente riportata19,20. - Regolare i parametri di iniezione per gli embrioni di H. saltator : una pressione di iniezione di 140 ettopascal (hPa), una pressione costante di 70 hPa e un tempo di 0,4 secondi. Regolare la pressione costante in modo tale che il materiale scorra solo in una direzione. Regolare la pressione e il tempo di iniezione solo se nessun materiale scorre dall'ago all'embrione.
NOTA: Se si inietta un diverso tipo di embrione, il parametro principale che può cambiare è la pressione costante, che è responsabile di garantire che il fluido dall'embrione non rifluisca nell'ago. Il volume non è controllato in questo protocollo. L'impostazione dei parametri del microiniettore è sufficiente per ottenere iniezioni coerenti. - Caricare un ago per microiniezione con 2 μL della miscela utilizzando le punte delle pipette microloader. Fallo lentamente per assicurarti che non si formino bolle nella miscela.
NOTA: Se si formano bolle, può essere difficile mantenere microiniezioni coerenti. - Rompere solo la punta dell'ago rompendo lungo il bordo del nastro in modo che venga mantenuta una cono stretta. Assicurarsi che l'ago sia rotto quel tanto che basta per aprire la punta, ma non così tanto da rompere la conicità.
NOTA: È importante sottolineare che, se l'apertura dell'ago è troppo ampia dopo la rottura, l'utente vedrà il liquido fuoriuscire dall'ago quando montato sul microiniettore pressurizzato prima dell'applicazione della pressione di iniezione. Alcuni protocolli di microiniezione consigliano di rompere gli aghi tagliando la punta con le forbici. Questo metodo non è consigliato, poiché le forbici possono causare la rottura della punta dell'ago. L'iniezione di embrioni con un ago frantumato sarà altamente dannosa. - Montare l'ago sul micromanipolatore
4. Iniezione di embrioni
- Selezionare gli embrioni per la microiniezione dalla fase sinciziale: il tempo durante lo sviluppo in cui i nuclei si dividono senza citochinesi.
NOTA: Questo è il momento ideale durante lo sviluppo per l'editing del genoma mediante microiniezione, come scoperto in precedenza in Drosophila21. Gli embrioni di H. saltator superano lo stadio sinciziale e raggiungono la cellularizzazione circa 36 ore dopo la deposizione dell'uovo10. Una maggiore efficienza si ottiene se gli embrioni più giovani vengono utilizzati per le iniezioni. - Rivestire gli embrioni su un pezzo di nastro biadesivo attaccato a un vetrino da microscopio di vetro. Assicurarsi che gli embrioni siano ben fissati al nastro per impedire il movimento durante l'iniezione. Disporre gli embrioni con orientamento verticale, in modo tale che il lato laterale dell'embrione si trovi sul bordo del nastro (Figura 3). Posizionare il vetrino e gli embrioni allineati sul palco del microscopio in una postazione di microiniezione designata.
NOTA: Si raccomanda che gli embrioni siano disposti in modo tale che le iniezioni successive possano essere eseguite spostando il vetrino sul palco invece di regolare la posizione dell'ago ad ogni iniezione. Ciò consente di eseguire iniezioni successive in modo più efficiente. - Allineare l'ago con il primo embrione da iniettare utilizzando il micromanipolatore (Figura 4a).
- Forare lateralmente l'ago nel primo embrione lungo il suo asse dorsale / ventrale al microscopio.
- Iniettare la miscela di microiniezione. Cerca un leggero movimento dell'embrione, che indica un aumento della pressione interna a causa del liquido iniettato. Inoltre, osservare la formazione di una piccola goccia contenente tracce visibili di tessuto e/o lipidi sulla membrana esterna dell'embrione (Figura 4b).
NOTA: La presenza di tracce di tessuto e/o lipidi nella goccia indica che l'ago ha perforato con successo sia il corion che la membrana vitellina dell'embrione. Se non sono presenti tracce di questi materiali, l'iniezione non è stata eseguita correttamente e deve essere ripetuta. Dopo pochi secondi, la goccia verrà riassorbita dall'embrione e non sarà più visibile. - Rimuovere delicatamente l'ago dall'embrione immediatamente e procedere al successivo regolando la posizione del vetrino del microscopio. Ripetere fino a quando tutti gli embrioni sono stati iniettati.
- Una volta che tutti gli embrioni sul vetrino sono stati iniettati con successo, trasferire il vetrino in una scatola umida per 1 ora per dare agli embrioni il tempo di riprendersi dal processo di iniezione prima di essere rimossi dal vetrino.
5. Allevamento di embrioni iniettati
- Dopo 1 ora di incubazione in una scatola umida, rimuovere delicatamente gli embrioni iniettati dal nastro usando una pinza leggera e trasferirli in un tubo riempito con una piccola quantità di etanolo al 70%. Capovolgere il tubo più volte per trasferire gli embrioni sul fondo del tubo. Ripetere il lavaggio a base di etanolo una volta, seguito da tre lavaggi con acqua sterilizzata.
- Utilizzando un pennello piccolo e morbido, trasferire tutti gli embrioni iniettati in piastre di agar all'1% con il 2% di antibiotico-antimicotico. Applicare l'antibiotico-antimicotico dopo che le piastre di agar versate si sono raffreddate diffondendo sulla superficie della piastra utilizzando uno spargitore cellulare. Sigillare la piastra di agar con parafilm per evitare l'essiccazione dell'agar.
NOTA: Non tentare di restituire gli embrioni iniettati ad una colonia dopo le iniezioni poiché i lavoratori potrebbero distruggere la maggior parte degli embrioni iniettati. La sopravvivenza è quindi ottimizzata consentendo agli embrioni di svilupparsi su piastre di agar al di fuori di un normale ambiente di colonia. - Incubare le piastre di agar a 25 °C per circa 4 settimane. Controllare regolarmente la schiusa.
- Una volta che il primo embrione si è schiuso in una larva, riportare tutti gli embrioni e le larve in una cassetta nido con alcune giovani infermiere per prendersi cura dei piccoli. Nutrire con grilli pre-punti da una colonia selvatica più grande, rimuovere i prodotti di scarto e aggiungere acqua seguendo lo stesso protocollo discusso nella Sezione 1.
NOTA: Le piccole scatole (9,5 x 9,5 cm2) sono ideali per tali colonie. H. saltator si riproduce bene in cattività. Pertanto, gli embrioni mutanti possono essere allevati fino all'età adulta. L'isolamento degli adulti mutanti induce la transizione allo stadio di gamergate riproduttivo. Gli incroci controllati sono usati per stabilire colonie mutanti con individui eterozigoti o omozigoti (Figura 5).
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Risultati
Utilizzando il protocollo fornito qui, l'editing del genoma negli embrioni di Harpegnathos saltator è stato eseguito con successo. Questi risultati sono stati convalidati tramite reazione a catena della polimerasi e clonazione pGEM del DNA estratto da embrioni iniettati seguiti dal sequenziamento del DNA. L'efficienza della mutagenesi somatica utilizzando questo protocollo ha raggiunto circa il 40%. I maschi mutanti F1 sono stati accoppiati con femmine wild type per produrre femm...
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Discussione
L'evoluzione dell'eusocialità tra gli insetti, tra cui formiche, api, vespe e termiti, ha portato alla comparsa di nuovi tratti comportamentali e morfologici, molti dei quali sono intesi come influenzati da una combinazione di fattori ambientali e genetici 1,2,3,4. Sfortunatamente, l'attrattiva e l'utilità degli insetti eusociali come modelli di ricerca nel campo della genetica sono state ostac...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i laboratori di Danny Reinberg e Claude Desplan alla New York University e il laboratorio di Jürgen Liebig all'Arizona State University per il loro supporto sulla genetica delle formiche. Hua Yan riconosce il sostegno della National Science Foundation I / UCRC, del Center for Arthropod Management Technologies sotto Grant No. IIP-1821914 e dei partner industriali. Maya Saar è stata sostenuta dal Fondo binazionale per la ricerca e lo sviluppo agricolo degli Stati Uniti - Israele, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Antibiotico-antimicotico (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Proteina Cas9 con NLS, alta concentrazione | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 pollici X 5 piedi | Ipogloss Prodotti | B00254CNJA | Il prodotto ha molte variazioni di colore. Acquistalo in rosso per utilizzarlo nella creazione di nidi di formiche. |
| Microscopio verticale Eclipse Ci-S | Nikon | Ci-S | |
| Pinze peso piuma, punta stretta | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microiniettore | Eppendorf | 920010504 | Questo prodotto non è più venduto o supportato da Eppendorf. In alternativa è possibile utilizzare un microiniettore comparabile. |
| Puntali per pipette per microloader | Eppendorf | 930001007 | |
| database NCBI | Centro nazionale per le informazioni biotecnologiche | ID gene: 105183395 | |
| P-2000 Estrattore per micropipette | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Scatole di plastica (19 X 13,5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Scatole in plastica (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Scatole in plastica (9,5 X 9,5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Vetro di quarzo senza filamento | Forbici Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Pennello sintetico manico corto - Rotondo #000 | Winsor e Newton | 5301030 |
Riferimenti
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