Articolo metodologico

Sintesi dell'eterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità

DOI:

10.3791/61950

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9 febbraio 2021

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1Department of Biology and Chemistry, Azusa Pacific University

In questo articolo

Sommario

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Qui, descriviamo un saggio biologico che utilizza 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) per testare le ossime spirocicliche precedentemente sintetizzate.

Abstract

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Gli eterocicli spirociclici sono stati recentemente riportati in letteratura come potenziali farmaci per la terapia del cancro. La sintesi di questi nuovi sistemi ad anello ortogonale è impegnativa. Recentemente è stata pubblicata una metodologia efficiente per sintetizzare questi composti che descrive la sintesi in fase solida in quattro fasi anziché le cinque fasi precedentemente riportate. Il vantaggio di questa sintesi più breve è l'eliminazione dell'uso di reagenti tossici. La resina a base di linker Regenerating Michael (REM) a basso carico è risultata cruciale nella sintesi poiché le versioni ad alto carico hanno impedito l'aggiunta di reagenti contenenti ingombranti catene laterali feniliche e aromatiche. Il saggio colorimetrico 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) è stato utilizzato per esaminare la citotossicità delle concentrazioni micromolari di queste nuove molecole spirocicliche in vitro. MTT è prontamente disponibile in commercio e produce risultati relativamente veloci e affidabili, rendendo questo test ideale per questi eterocicli spirociclici. Sono state testate strutture ad anello ortogonali e furfurilammina (un precursore nel metodo di sintesi contenente un motivo ad anello simile a 5 membri).

Introduzione

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È noto che l'inibizione di piccole molecole dell'interazione dell'omologo doppio minuto 2 del topo ubiquitina-ligasi E3 (MDM2) con p53 ripristina l'induzione mediata da p53 dell'apoptosi delle cellule tumorali 1,2,3. MDM2 è un regolatore negativo della via p53 ed è spesso sovraespresso nelle cellule tumorali 4,5,6,7,8,9. Recenti studi cristallografici e biochimici hanno rivelato che piccole molecole contenenti una struttura spirociclica possono inibire efficacemente le interazioni MDM2-p5310. La struttura spirociclica (Figura 1, sfumata in blu) è considerata un motivo privilegiato in quanto la derivatizzazione di questo rigido sistema di anelli ortogonali ha portato alla scoperta di nuovi farmaci terapeutici. L'accesso a questa interessante architettura rappresenta una sfida quando si utilizzano tecniche di sintesi organica tradizionali. Sebbene siano stati studiati gli effetti terapeutici delle molecole spirocicliche nei sistemi biologici, la sintesi di queste molecole è ancora un processo ingombrante. I prodotti collaterali indesiderati, l'utilizzo di condizioni difficili e i metalli di transizione pericolosi sono spesso problematici.

Il potenziale uso del motivo spirociclico nello sviluppo di farmaci ha portato allo sviluppo di un protocollo che utilizza la sintesi in fase solida per generare una libreria di molecole con il motivo in aggiunta ad altri gruppi funzionali intercambiabili11,12. La separazione dei prodotti e dei reagenti tra le fasi potrebbe essere ottenuta semplicemente utilizzando un linker REM collegato a un cordone di resina e un contenitore filtrante in fase solida. Ciò ridurrebbe i passaggi e potenzialmente aumenterebbe i rendimenti. Questo approccio sintetico potrebbe produrre una vasta gamma di potenziali candidati farmaci. Tuttavia, l'efficacia di queste molecole in un sistema biologico richiederebbe ulteriori indagini.

Per determinare la citotossicità di questi composti spirociclici, è stato utilizzato il saggio MTT13,14. Questo metodo misura la vitalità cellulare e può essere utilizzato per determinare indirettamente la citotossicità cellulare. Diverse concentrazioni degli inibitori sono state aggiunte alle cellule coltivate in una piastra a 96 pozzetti e la proporzione di cellule viventi è stata misurata mediante analisi colorimetrica dell'entità della riduzione della MTT gialla da parte delle deidrogenasi mitocondriali al composto formazan viola (Figura 2). L'attività è più spesso riportata come un valore IC 50, la concentrazione alla quale la crescita cellulare è inibita del50% rispetto a un controllo non trattato. Questo articolo descrive il protocollo per il saggio MTT e i risultati preliminari di queste nuove molecole spirocicliche.

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Protocollo

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NOTA: Diversi prodotti chimici e reagenti biologici utilizzati in questo protocollo sono tossici e cancerogeni. Consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) pertinenti prima dell'uso. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza approvati dalla Occupational Safety and Health Administration, guanti adeguati, camici da laboratorio, pantaloni lunghi e scarpe chiuse) prima di iniziare l'esperimento. Inoltre, adottare adeguate pratiche di sicurezza durante l'esecuzione della sintesi e la manipolazione di sostanze chimiche tossiche e reagenti (cappa aspirante).

1. Sintesi in fase solida di eterocicli spirociclici 6 e 7

NOTA: La sintesi era basata sul lavoro precedentemente pubblicato11,12. Il protocollo aggiornato rivela che l'apertura dell'anello catalizzata dal fluoruro di tetrabutilammonio dell'eterociclo triciclico non era necessaria, e quindi la sua eliminazione accorcia la procedura sintetica.

  1. Eseguire l'aggiunta Michael di furfurilamina al linker REM (durata: 25 minuti di configurazione + 24 ore di tempo di reazione).
    1. Aggiungere 1 g (1 equivalente [equiv.]) di resina REM, 20 mL (20 equiv.) di dimetilformammide (DMF) e 2,4 mL di furfurilammina in un recipiente di reazione in fase solida da 25 ml. Agitare il recipiente di reazione a temperatura ambiente per 24 ore dopo l'inizio della reazione.
      NOTA: Assicurarsi una miscelazione accurata in modo che la resina non si trovi sul fondo del recipiente.
    2. Lavare la resina con DMF 1x dopo aver completato la reazione. Quindi, lavare 4 volte, alternando diclorometano (DCM) e metanolo. Asciugare accuratamente la resina nel recipiente di reazione dopo i lavaggi.
  2. Eseguire addizione Michael in tandem/cicloaddizione 1,3-dipolare (durata: 25 min setup + 48 h tempo di reazione).
    1. Alla resina secca, aggiungere 1,48 ml (5 equiv.) di trietilammina (TEA), 0,637 g (2 equiv.) di nitro-olefina e 10 mL di toluene secco al recipiente di reazione.
    2. Quindi, aggiungere 1,085 ml (4 equiv.) di cloruro di trimetilsilile (TMSCl) al recipiente di reazione in una cappa aspirante ben ventilata.
      NOTA: Poiché questa reazione produce gas HCl, non tappare il recipiente di reazione fino a quando il gas non è stato rilasciato sotto una cappa aspirante.
    3. Tappare saldamente il recipiente di reazione e agitare a temperatura ambiente per 48 ore.
      NOTA: Assicurare un'accurata miscelazione della resina con i reagenti.
    4. Utilizzare 5 ml di metanolo per estinguere la reazione.
    5. Scolare il recipiente per rimuovere la soluzione, quindi lavare 4x, alternando DCM e metanolo. Asciugare accuratamente la resina nel recipiente di reazione dopo i lavaggi.
  3. Eseguire la N-alchilazione dell'eterociclo legato alla resina per formare l'ammina quaternaria (durata: 10 min setup + 24 h di reazione).
    1. Alla resina secca nel recipiente di reazione, aggiungere 5 ml di DMF e 10 equiv. di alogenuro alchilico e agitare a temperatura ambiente per 24 ore.
      NOTA: Assicurarsi un'accurata miscelazione dei reagenti con la resina.
    2. Lavare la resina con DMF 1x dopo aver completato la reazione. Quindi, utilizzare DCM e metanolo alternativamente per lavare 4x. Asciugare la resina nel recipiente di reazione dopo i lavaggi.
  4. Eseguire β-eliminazione dell'ammina quaternaria per scissione dal supporto polimerico (durata: 15 min setup + 24 h tempo di reazione).
    1. Alla resina secca nel recipiente di reazione, aggiungere 3 ml di DCM e 1,49 ml (5 equiv.) di TEA per scindere l'eterociclo dal supporto polimerico.
    2. Agitare la miscela di reazione per 24 ore per garantire un'accurata miscelazione della resina con la soluzione. Lavare 4x, alternando DCM e metanolo. Raccogliere l'eluizione da tutti i lavaggi e concentrare tramite evaporazione rotatoria.
    3. Triturare con metanolo per purificare l'ossima spirociclica. Asciugare accuratamente la resina nel recipiente di reazione dopo i lavaggi per riutilizzarla in esperimenti futuri.

2. Saggio di citotossicità mediante MTT 14

  1. Preparare 20 mL di una soluzione MTT da 5 mg/mL utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS, 0,9% NaCl in acqua) come diluente. Filtrare e conservare a -20 °C. Quindi, preparare una diluizione 1:1 della soluzione MTT dal punto 2.1 in terreno di coltura cellulare senza siero (DMEM).
  2. Preparare 1 mL ciascuna di soluzioni madre in provette da microcentrifuga da 1,5 mL da 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM e 0,01 μM di composti in esame in dimetilsolfossido (DMSO). Conservare a -20 °C. Preparare 200 μL per dose delle soluzioni di lavoro dei composti in esame diluendo le concentrazioni di stock 1:1000 in terreno privo di siero in provette da 1,5 ml.
  3. Nella cappa di coltura tissutale, seminare cellule COS-7 (cellule renali di scimmia verde africana, rene di Cercopithecus aethiops ) in mezzo completo [DMEM con siero bovino fetale al 10% (FBS)] su piastre a fondo piatto, trattate con coltura tissutale a 96 pozzetti a una concentrazione di 4 × 103 cellule/200 μL per pozzetto utilizzando un pipettatore multicanale. Le cellule COS-7 sono state scelte perché (1) sono cellule comunemente utilizzate per i saggi di citotossicità e (2) erano già disponibili nell'istituzione.
  4. Incubare cellule COS-7 per 24 ore a 37 °C in atmosfera contenente il 5% di CO2.
  5. Aspirare il surnatante dai pozzetti utilizzando una pipetta Pasteur di vetro collegata a una pompa per vuoto. Dosare le cellule in triplice copia con i composti in esame utilizzando le soluzioni di lavoro preparate al punto 2.2 (vedere tabella 1). Incubare le cellule come descritto al punto 2.4.
  6. Aspirare il surnatante dai pozzi. Aggiungere 200 μL di soluzione MTT a ciascun pozzetto. Incubare a 37 °C in atmosfera contenente il 5% di CO2 per 4 ore.
  7. Aspirare delicatamente il surnatante dai pozzetti senza disturbare i cristalli viola formazan. Aggiungere 200 μL di DMSO a ciascun pozzetto per sciogliere i cristalli di formazan viola. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
  8. Misurare l'assorbanza a 590 nm14 o 600 nm per ciascun pozzetto utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. Utilizzare pozzetti senza celle come sfondo e calcolare la media del valore di assorbanza. Sottrarre il valore medio di fondo di assorbanza dal valore di assorbanza di ciascun pozzetto trattato. Normalizzare i dati come percentuale del valore medio di dosaggio zero (media dei tre valori di dose zero). Tracciare i dati sull'asse y: lineare (% di vitalità relativa della cella); Asse X: log (concentrazione). Tracciare ogni serie come una singola curva (ad esempio, i dati triplicati dovrebbero avere 3 curve)

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Risultati

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Le ossime spirocicliche 6 e 7 sono state sintetizzate utilizzando un protocollo modificato (Figura 1). Michael aggiunta di furfurilammina ad un linker REM 1b ha fornito resina legata al polimero 2. Il progresso della reazione è stato monitorato mediante spettroscopia infrarossa (IR) rilevando la scomparsa dell'estere α,β-insaturo a 1722 cm-1 (Figura 3). La resina 4 legata allo spirociclico è stata formata da 2 attraverso un intermedio transitorio 3. L...

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Discussione

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La sintesi dei composti spirociclici era basata su precedenti ricerche condotte da questo laboratorio, ma con alcune modifiche (Figura 1)11,12. L'avanzamento di ogni fase di reazione è stato monitorato mediante spettroscopia IR. Michael aggiunta del linker REM 1 con furfurilammina ha permesso di legare polimericamente 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1).

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Faculty Research Council a K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. e J.F.M. sono destinatari della borsa di studio Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. e B.M.R. sono destinatari delle borse di ricerca STEM (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Siamo grati al Dr. Matthew Berezuk e al Dr. Philip Cox per la guida sui saggi biologici.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CELLULE
Cellule COS-7 (ATCC CRL-1651)ATCCCRL-1651Cellule renali di scimmia verde africana
CHIMICA
1-BromoottanoSigma-Aldrich152951Alchil-alogenuro
allilbromuroSigma-Aldrich337528Alchil-alogenuro
benzilbromuroSigma-AldrichB17905Alchil-alogenuro
cisplatinoCayman Chemical13119Controllo della citotossicità
Diclorometano (DCM)Sigma-Aldrich270997Solvente
Dimetilformammide (DMF)Sigma-Aldrich227056Solvente
Dimetilsolfossido (DMSO)Sigma-Aldrich276855Solvente
DMEM, ad alto contenuto di glucosio, con L-glutamminaGenesee Scientific25-500Terreni di coltura cellulare
FBS (Siero fetale bovino)Sigma-AldrichF4135Terreni di coltura cellulare
FurfurilamminaAcros Organics119800050 reagente 
IodometanoSigma-Aldrich289566Alchil-alogenuro
MetanoloSigma-Aldrich34860Solvente
MTT ((3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio Bromuro)EMD MilliporeCalbiochem 475989-1GMReagente
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Genesee Scientific25-507Terreni di coltura cellulare
Resina REMNova Biochem8551010005Supporto polimerico; 0,500 mmol/g loading
trans-β-nitrostireneSigma-AldrichN26806Reagente nitro-olefinico
TolueneSigma-Aldrich244511Solvente
Trietilammina (TEA)Sigma-AldrichT0886Reagente per l'eliminazione della beta
Cloruro di trimetilsilil (TMSCl)Sigma-Aldrich386529Reagente; ATTENZIONE - altamente volatile; crea HCl gas
VETRERIA/STRUMENTAZIONE
25 mL recipiente di reazione in fase solidaChemglassCG-1861-02Vetreria con filtro
Lettore di piastre a 96 pozzettiPromega (Turner Biosystems)9310-011Strumento
AVANCE III NMR SpectrometerBrukerN/A Instrument; 300 MHz; Solventi: CDCl3 e CD3OH
Thermo Scientific Nicole iS5Thermo ScientificIQLAADGAAGFAHDMAZAStrumento
polso StrumentoBurrellScientific 757950819
da

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  12. Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes. Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).
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