Metodi di imaging e smistamento cellulare su animali vivi per lo studio della neurodegenerazione in un modello di necrosi eccitotossica di C. elegans

Sommario

In un modello di eccitotossicità di C. elegans , questo protocollo impiega l'imaging in vivo per analizzare la regolazione della neurodegenerazione necrotica, l'effetto dei geni che codificano per i mediatori candidati e il coinvolgimento dei mitocondri. La dissociazione e lo smistamento cellulare vengono utilizzati per ottenere specificamente neuroni a rischio per l'analisi trascrittomica cellulo-specifica della neurodegenerazione e dei meccanismi di neuroprotezione.

Abstract

La necrosi eccitotossica è una delle principali forme di neurodegenerazione. Questo processo di necrosi regolata è innescato dall'accumulo sinaptico del neurotrasmettitore glutammato e dall'eccessiva stimolazione dei suoi recettori postsinaptici. Tuttavia, mancano informazioni sui successivi eventi molecolari che culminano nella distinta morfologia del rigonfiamento neuronale di questo tipo di neurodegenerazione. Altri aspetti, come i cambiamenti in specifici compartimenti subcellulari o la base della vulnerabilità cellulare differenziale di sottotipi neuronali distinti, rimangono poco esplorati. Inoltre, una serie di fattori che entrano in gioco negli studi che utilizzano preparati in vitro o ex vivo potrebbero modificare e distorcere la progressione naturale di questa forma di neurodegenerazione. È quindi importante studiare la necrosi eccitotossica negli animali vivi monitorando gli effetti degli interventi che regolano l'estensione della necrosi neuronale nel sistema modello geneticamente ammissibile e trasparente del nematode Caenorhabditis elegans. Questo protocollo descrive i metodi per studiare la necrosi eccitotossica nei neuroni di C. elegans , combinando analisi ottica, genetica e molecolare. Per indurre condizioni eccitotossiche in C. elegans, un knockout di un gene trasportatore del glutammato (glt-3) è combinato con un background genetico neuronale sensibilizzante (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) per produrre iperstimolazione e neurodegenerazione del recettore del glutammato. Il contrasto di interferenza differenziale (DIC), la microscopia fluorescente e confocale di Nomarski in animali vivi sono metodi utilizzati per quantificare la neurodegenerazione, seguire la localizzazione subcellulare di proteine marcate in fluorescenza e quantificare la morfologia mitocondriale nei neuroni degenerati. La selezione cellulare attivata da fluorescenza neuronale (FACS) viene utilizzata per selezionare distintamente i neuroni a rischio per l'analisi trascrittomica della neurodegenerazione specifica per tipo di cellula. Una combinazione di imaging dal vivo e metodi FACS, nonché i vantaggi dell'organismo modello di C. elegans , consentono ai ricercatori di sfruttare questo sistema per ottenere dati riproducibili con un campione di grandi dimensioni. Le intuizioni di questi saggi potrebbero tradursi in nuovi bersagli per l'intervento terapeutico nelle malattie neurodegenerative.

Introduzione

L'eccitotossicità è la principale causa di morte neuronale nell'ischemia cerebrale e un fattore che contribuisce a molteplici malattie neurodegenerative 1,2,3,4,5,6,7,8,9. L'interruzione del flusso sanguigno ossigenato al cervello (ad esempio, a causa di un coagulo di sangue) provoca il malfunzionamento dei trasportatori del glutammato, portando all'accumulo di glutammato nella sinapsi. Questo eccesso di glutammato attiva eccessivamente i recettori post-sinaptici del glutammato (GluR) portando a un eccessivo afflusso (catalitico, non stechiometrico) di Ca²⁺ nei neuroni (Figura 1A). Questo afflusso dannoso porta a una progressiva neurodegenerazione postsinaptica che morfologicamente e meccanicamente varia dall'apoptosi alla necrosi regolata 10,11,12. Sebbene si basassero su interventi di successo in modelli animali, diversi studi clinici su antagonisti di GluR che cercavano di bloccare l'ingresso di Ca²⁺ e promuovere la vitalità cellulare sono falliti in ambito clinico 13,14,15,16. Un probabile contributo critico a questi fallimenti è il fatto che (a differenza dei modelli animali) il trattamento in ambito clinico viene somministrato ore dopo l'insorgenza dell'ictus, causando il blocco dell'intervento dei meccanismi neuroprotettivi ad azione tardiva, mentre non riesce a interrompere la segnalazione degenerativa a valle di GluRs 14,16,17. Un approccio alternativo, che si basa sulla trombolisi, può essere somministrato solo entro una finestra temporale fortemente limitata, lasciando molti pazienti (che soffrono di ictus a casa con un tempo di insorgenza scarsamente identificabile) incapaci di trarne beneficio¹⁷. Queste battute d'arresto sottolineano la necessità di concentrare la ricerca sull'eccitotossicità sullo studio degli eventi che si verificano dopo l'iperstimolazione con GluR e di differenziare le successive cascate degenerative dai processi neuroprotettivi concomitanti. Questo approccio può aiutare a prevenire il danno cellulare e identificare bersagli farmacologici efficienti che possono essere somministrati in seguito all'insorgenza del danno.

Un approccio per identificare gli eventi successivi nell'eccitotossicità consiste nello studiare i meccanismi di segnalazione della morte cellulare a valle dell'iperstimolazione del GluR, come quelli che portano al collasso mitocondriale. Il drastico malfunzionamento della fisiologia e della dinamica mitocondriale è un segno distintivo della neurodegenerazione, come si vede in eccitotossicità 18,19,20. Mentre tutte le cellule dipendono dalla funzione e dalla disponibilità mitocondriale per la sopravvivenza, l'attività e il mantenimento cellulare, i neuroni dipendono in particolare dalla produzione di energia mitocondriale per supportare la trasmissione e la propagazione del segnale. In particolare, i neuroni spendono ~50% del loro consumo di energia correlato alla segnalazione per ripristinare il potenziale di membrana a riposo in seguito all'attivazione dei recettori/canali postsinaptici²¹, con un'elevata dipendenza da ossigeno e glucosio. La ridotta disponibilità di glucosio e ossigeno osservata nell'ictus porta a gravi alterazioni mitocondriali, causando un'ulteriore riduzione della produzione di ATP 19,22,23,24. Tuttavia, gli studi per identificare la sequenza di eventi che portano al collasso mitocondriale hanno prodotto risultati controversi e mancavano di consenso. L'analisi della morfologia mitocondriale può aiutare a comprendere questi eventi che portano alla patologia mitocondriale poiché è un buon indicatore della salute neuronale 25,26,27,28,29. I mitocondri filamentosi sono rappresentativi di un neurone sano, mentre i mitocondri frammentati rivelano un danno neuronale sostanziale che potrebbe portare alla morte cellulare. L'analisi della morfologia mitocondriale in animali vivi in diverse condizioni genetiche può aiutare a concentrarsi su geni e percorsi specifici coinvolti nella neurodegenerazione mitocondriale-dipendente nell'eccitotossicità.

Un altro approccio per identificare gli eventi successivi che potrebbero regolare l'entità della neurodegenerazione eccitotossica è quello di studiare i meccanismi neuroprotettivi trascrizionali che mitigano alcuni degli effetti dell'eccitotossicità^14,16. Tuttavia, la mancanza di specificità dei principali fattori di trascrizione neuroprotettivi e la divergenza dei modelli sperimentali ostacolano il successo degli sforzi per identificare chiaramente i programmi neuroprotettivi di base (specialmente nella necrosi regolata).

Pertanto, sia lo studio delle vie di segnalazione della morte a valle che lo studio della neuroprotezione trascrizionale nell'eccitotossicità hanno incontrato grandi difficoltà e disaccordi sugli esiti osservati. Gran parte di questa controversia è probabilmente dovuta all'uso di modelli di eccitotossicità ex vivo o in vitro e alla variabilità introdotta dalla specificità di diversi setup sperimentali. È quindi molto utile concentrarsi sull'identificazione di meccanismi fondamentali altamente conservati e studiarli in vivo. Il semplice sistema modello del nematode C. elegans offre un'opzione particolarmente efficace, grazie alla potente combinazione di strumenti di ricerca particolarmente potenti e diversificati, alla conservazione delle vie di morte cellulare centrale e alla ricca informazione sulla struttura e la connettività del suo sistema nervoso 30,31,32,33. In effetti, il lavoro seminale del laboratorio Driscoll sull'analisi genetica della neurodegenerazione necrotica nei neuroni meccanosensoriali è un'eccellente dimostrazione della potenza di questo approccio³⁴. È importante sottolineare che per l'analisi dell'eccitotossicità, la conservazione delle vie di segnalazione nel nematode include tutti i principali componenti della neurotrasmissione glutammatergica^35,36.

Il modello di eccitotossicità dei nematodi si basa su questi studi seminali, consentendo al ricercatore di studiare processi biochimici simili a quelli che si verificano nell'ictus e in altre malattie neurodegenerative colpite da neurotossicità glutammato-dipendente. Per indurre condizioni eccitotossiche in C. elegans, questo approccio sperimentale utilizza un ceppo di eccitotossicità che è la combinazione di un knockout di un gene trasportatore del glutammato (glt-3) e di un background genetico neuronale sensibilizzante (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) per produrre iperstimolazione e neurodegenerazione GluR³⁷. Questo ceppo di eccitotossicità espone 30 neuroni specifici (che esprimono glr-1) che sono postsinaptici, alle connessioni glutammatergiche, alla neurodegenerazione eccitotossica. Di questi 30 neuroni a rischio, i singoli neuroni subiscono necrosi man mano che l'animale progredisce nello sviluppo (con stocasticità mista e preferenza parziale verso alcuni neuroni specifici³⁸), mentre allo stesso tempo anche i cadaveri delle cellule vengono gradualmente rimossi. In combinazione con l'accessibilità di molti ceppi mutanti, questo approccio consente lo studio di molteplici percorsi che influenzano la neurodegenerazione e la neuroprotezione. Questi approcci sono già stati utilizzati per analizzare alcune delle cascate di segnalazione della morte a valle³⁹ e i regolatori trascrizionali della neurodegenerazione eccitotossica in eccitotossicità^38,40. Come altri casi di neurodegenerazione necrotica nel verme⁴¹, la neurodegenerazione eccitossica del nematode non coinvolge l'apoptosi classica⁴⁰.

Questo articolo descrive il sistema di base per indurre, quantificare e manipolare la neurodegenerazione necrotica eccitotossica in C. elegans. Inoltre, delinea due protocolli principali attualmente in uso per semplificare gli studi su aspetti specifici dell'eccitotossicità dei nematodi. Utilizzando reporter fluorescenti e imaging in vivo in vivo, il ricercatore può studiare il coinvolgimento e la dinamica mitocondriale nel modello di nematode di neurodegenerazione eccitotossica. Per determinare l'effetto di specifici fattori di trascrizione neuroprotettivi, lo sperimentatore può utilizzare l'espressione specifica del tipo di cellula di marcatori fluorescenti, la dissociazione di animali in singole cellule e FACS per isolare neuroni specifici che sono a rischio di necrosi da eccitotossicità. Questi neuroni isolati specifici per tipo di cellula possono quindi essere utilizzati per il sequenziamento dell'RNA in ceppi che ospitano mutazioni in fattori di trascrizione chiave. Messi insieme, questi metodi possono consentire ai ricercatori di individuare le basi molecolari della neurodegenerazione eccitossica e della neuroprotezione in vivo con grande chiarezza e precisione.

Protocollo

1. Ceppi utilizzati per studiare la neurodegenerazione eccitotossica e la neuroprotezione

1. Utilizzare il ceppo di eccitotossicità dei nematodi ZB1102 come punto di riferimento per la neurodegenerazione eccitossica standard.
   NOTA: L'eccitotossicità glutammato-dipendente in C. elegans è prodotta nel ceppo ZB1102 combinando un knockout (ko) di un trasportatore di glutammato con un transgene che sensibilizza i neuroni in questi animali alla neurotossicità ed è espressa in un sottogruppo di neuroni postsinaptici-connessioni glutammatergiche³⁷. Questa combinazione genetica è indicata come ceppo di eccitotossicità da nematodi ed è disponibile gratuitamente presso il Caenorhabditis Genetics Center (CGC).
2. Per studiare l'effetto di geni che codificano candidati regolatori della necrosi eccitossica, combinare una mutazione in tali geni (ad esempio, dapk-1 o crh-1) con il ceppo di eccitotossicità del nematode.
3. Condurre incroci genetici secondo i metodi standard di C. elegans ³⁰, come indicato in wormbook.org^42,43.
4. Poiché le basi molecolari della mutazione sono tipicamente documentate, seguire la progenie incrociata genotipizzando il locus specifico utilizzando la PCR. Differenziare WT vs mutante in base alla dimensione del frammento (per le delezioni) o al sequenziamento (per le mutazioni puntiformi).
   NOTA: La Tabella 1 delinea i ceppi che sono stati utilizzati per studiare percorsi distinti di neurodegenerazione e neuroprotezione, in particolare per questo protocollo.
5. Derivare tutti i ceppi critici da due linee indipendenti e testarli separatamente per confermare la validità del fenotipo osservato.

2. Mezzi di crescita e zootecnia

1. Far crescere i vermi a 16-25 °C su piastre NGM standard 30,37,42 o piastre MYOB ^38,44 seminate con OP50 E.coli secondo i metodi standard.
   NOTA: Le piastre MYOB danno risultati identici a quelli delle piastre NGM, ma sono leggermente più facili da preparare.
2. Mantieni le varietà sperimentali costantemente ben nutrite.
   NOTA: La fame può influenzare la neurodegenerazione e ridurre il numero di neuroni della testa morenti. Se i vermi sono mal nutriti o affamati, impiattateli su piatti freschi e aspettate qualche generazione prima di continuare gli esperimenti. L'effetto transgenerazionale della fame svanirà dopo poche generazioni.

3. Quantificazione dei neuroni della testa degeneri mediante contrasto interferenziale differenziale di Nomarski (DIC) e scoring

1. Utilizzare il ceppo di eccitotossicità dei nematodi [ZB1102: glt-3(bz34) IV; nuIs5 V] come controllo sperimentale per la quantificazione, che rappresenta i normali livelli di eccitotossicità. Il protocollo non segue lo stesso animale attraverso diverse fasi di sviluppo. Invece, fornisce un'istantanea di una popolazione di animali a stadi misti, in modo che in totale si raccolgano informazioni da diversi animali per rappresentare tutti gli stadi di sviluppo.
   NOTA: Il transgene nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L). Pglr-1::GFP]⁴⁵ (che esprime una Gαs e una GFP attivate nei neuroni connessioni postsinaptiche-glutammatergiche) produce un livello di neurodegenerazione necrotica indipendente da GluR di ~1 neurone testa/animale morente (in qualsiasi momento durante lo sviluppo). L'aggiunta di glt-3 (ko) aumenta la neurodegenerazione necrotica dei neuroni postsinaptici che esprimono nuIs5 in modo GluR-dipendente, arrivando fino a 4-5 neuroni della testa morenti/animale nel terzo stadio larvale (L3)³⁷.
2. Per i ceppi di prova, utilizzare animali provenienti da un incrocio genetico completato di recente o scongelare ceppi di interesse provenienti da ceppi congelati a -80 °C preparati da incroci freschi. Attendere alcune generazioni (≥4) prima di ottenere un fenotipo e una neurodegenerazione.
3. Taglia e rimuovi un pezzetto di agar da un piatto di una popolazione mista di animali ben nutriti e montalo su un vetrino coprioggetti capovolgendo il pezzo di agar, in modo che gli animali che strisciavano sulla superficie dell'agar ora siano rivolti verso il vetrino.
   NOTA: Gli animali possono ancora muoversi, ma ora sono in qualche modo trattenuti e possono essere osservati senza anestesia. Un pezzo del genere può essere utilizzato per ~1 ora prima di sostituirlo con uno nuovo.
4. Utilizzando un cannocchiale DIC invertito con oculare x10 e obiettivo x40 o x63, scansiona gli animali in modo casuale facendo scorrere manualmente il vetrino coprioggetti. Mentre le altre fasi di imaging descritte di seguito possono essere eseguite su microscopi invertiti o verticali, l'esame dei vermi nel pezzo di agar richiede un endoscopio invertito.
5. Identificare lo stadio di sviluppo di ogni animale in base alla forma del suo utero (fare riferimento ai diagrammi dell'utero in wormbook.org).
6. Per ogni animale, registrare il suo stadio di sviluppo e il numero di neuroni morenti (cioè vacuolati). Contare e registrare il numero totale di neuroni morenti nella testa, il numero di neuroni morenti nel ganglio retrovicolare (che consente una facile identificazione di cellule specifiche) e il numero di neuroni morenti nella coda (che non è influenzata dal glutammato e funge da controllo interno, confermando che il transgene sensibilizzante nuIs5 è completamente attivo).
7. Registrare questi dati in una tabella in cui gli animali di un determinato ceppo sono raggruppati per categorie di stadio di sviluppo.
8. In ogni sessione, raccogli dati in modo casuale da vermi di diversi stadi di sviluppo; Esegui diverse sessioni di punteggio in più giorni per raccogliere dati sufficienti per l'analisi statistica. Registra i livelli di neurodegenerazione in più fasi e costruisci un grafico a barre simile alla Figura 1C.
   NOTA: Questo metodo consentirà di determinare se un determinato trattamento o mutazione aumenta/diminuisce i livelli di neurodegenerazione in tutte le fasi (spostando la distribuzione su/giù) o sposta il picco della neurodegenerazione a una fase di sviluppo precedente o successiva (spostando la distribuzione a sinistra/destra).
9. Eseguire la raccolta dei dati mentre si è all'oscuro dell'identità del genotipo. Confermare in due isolati indipendenti della linea genetica (per ridurre al minimo il pericolo di effetti indesiderati di altre/impreviste differenze genetiche tra gli isolati) e raggruppare i dati per l'analisi.
10. In ogni ceppo, calcolare la media e il SEM del numero di neuroni degeneri nella testa (compreso il ganglio retrovisicolare) in ogni stadio di sviluppo (Figura 1D). Eseguire un'analisi simile dei neuroni del ganglio retrovisicolare e della coda morenti, se necessario.

4. Identificazione di specifici neuroni della testa degeneranti

1. Monta singoli (o piccoli gruppi di) animali su un agar pad⁴⁶ e paralizza il verme con tetramisolo (vedi sotto, sezione 5).
2. Con una fluorescenza combinata e un endoscopio DIC (in posizione verticale o invertita) localizzano specifici neuroni vacuolati.
3. Determinare l'identità neuronale specifica del neurone vacuolato tracciando i suoi processi marcati GFP e confrontando la posizione del corpo cellulare e la forma dei processi con quelli dei neuroni noti per esprimere glr-1 utilizzando WormAtlas⁴⁷.
   NOTA: In alternativa, l'identificazione può essere assistita da nuovi metodi per identificare rapidamente i neuroni mediante marcatura multicolore che arriveranno presto dal laboratorio Hobert⁴⁸.

5. Imaging dal vivo della morfologia mitocondriale neuronale mediante microscopia fluorescente di ceppi reporter

1. Per l'imaging delle alterazioni mitocondriali nei neuroni postsinaptici degenerativi (che sono marcati con GFP citoplasmatica nel ceppo di eccitotossicità originale) esaminare la fluorescenza mito-mCherry.
2. Incrociare il ceppo di eccitotossicità di prova con ceppi che marcano i mitocondri dei neuroni postsinaptici con fluorescenza rossa (esprimendo una fusione tra la proteina fluorescente e l'N-terminale di TOM-20 sotto il promotore di glr-1 ; per dettagli su costrutti e ceppi, vedere⁴⁹). Gli animali possono ora essere ripresi utilizzando un normale microscopio a epifluorescenza (verticale o invertito) o un microscopio confocale.
3. Per paralizzare il verme senza influire sulla sopravvivenza neuronale, pipettare 5 μl di tetramsolo da 10 mM su un tampone di agarosio appena preparato. Vedi Arnold et ^al.46 per un protocollo dettagliato sulla preparazione dei pad.
4. Posiziona gli animali al centro della goccia tetramisola e montali con un vetrino coprioggetti.
5. Sigillare i lati del vetrino coprioggetto con lo smalto e lasciare asciugare lo smalto.
6. Entro 20 minuti dal trattamento con tetramisolo e utilizzando un endoscopio con DIC e imaging a fluorescenza, localizzare i vermi utilizzando una lente obiettiva 20x.
7. Una volta individuata la testa del verme (o i neuroni di interesse), passare a un obiettivo di olio 100x e concentrarsi sulla marcatura a fluorescenza dei mitocondri nel soma.
8. Acquisisci immagini Z-stack utilizzando le impostazioni dei filtri DIC, GFP e TxRed.

6. Punteggio, punteggio, morfologia e quantificazione dei mitocondri neuronali

1. Analizza la morfologia mitocondriale durante l'imaging dal vivo del verme o dopo l'acquisizione dell'immagine utilizzando ImageJ o altri software di imaging.
2. Per una facile identificazione e analisi ripetuta di neuroni specifici, identificare i tre neuroni nel ganglio retrovisicolare, RIGL/R e AVG (in alcuni casi solo due sono presenti a causa della clearance del cadavere cellulare in eccitotossicità).
3. Categorizzare i mitocondri in tre gruppi principali: filamentosi, intermedi e frammentati 50,51,52.
   NOTA: I mitocondri filamentosi appaiono come strutture sottili continue nel soma dei neuroni, di solito circondando il nucleo. I mitocondri intermedi appaiono come una combinazione di almeno una rete filamentosa apparente, anche se con rotture, e una certa frammentazione nel soma. I mitocondri frammentati mostrano rotture complete nella rete mitocondriale, hanno un aspetto gonfio e sono sparsi in tutto il soma (Figura 2A).
4. Per ogni verme, segnare la percentuale di neuroni con mitocondri filamentosi, intermedi o frammentati per un totale di almeno 30 vermi.
5. Eseguire analisi statistiche utilizzando l'ANOVA unidirezionale seguita dal test di Tukey post hoc per ciascuna morfologia mitocondriale tra i ceppi⁵³.

7. Preparazione di tamponi e reagenti per la dissociazione dei vermi per FACS di neuroni a rischio di neurodegenerazione

1. Preparare il tampone M9 come segue: 3 g di KH₂PO₄, 6 g di Na₂HPO₄, 5 g di NaCl, H₂O a 1 L. Sterilizzare in autoclave. Aggiungere 1 mL di 1 M MgSO₄ sterilizzato con filtro. Conservare a temperatura ambiente.
2. Preparare il tampone per uova come segue: 118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ ; autoclave per sterilizzare. Aggiungere 2 M di soluzione madre HEPES pH 7.3 (precedentemente filtrata con un filtro per flacone da 0,2 μm) a una concentrazione finale di 25 mM. Regolare il pH a 7,3 con 1 N NaOH (non più di 10 mL). Utilizzare l'osmometro per assicurarsi che l'osmolarità finale sia compresa tra 335 e 345 mOsm. Filtro Sterilizza il tampone per uova con filtri per flaconi da 0,2 μm. Conservare a 4 °C.
   NOTA: I sali si dissolvono più facilmente quando si utilizzano MgCl₂ ·6H₂O e CaCl₂·2H₂O per ottenere le rispettive soluzioni madre di MgCl₂ e CaCl₂ . Puoi anche fare una scorta di 10 tamponi per uova e diluirlo quando necessario in acqua deionizzata sterile.
3. Preparare SDS-DTT come segue: 20 mM HEPES pH 8.0, 0.25% SDS, 200 mM DTT, 3% saccarosio. In una cappa per coltura tissutale, sterilizzare SDS-DTT con un filtro per siringa da 0,2 μm. Conservare aliquote da 300 μl a -20 °C coperte con un foglio per proteggerle dalla luce.
4. Preparare la soluzione di pronasi come segue: preparare il giorno della dissociazione 15 mg/mL di pronasi nel tampone uovo. Conservare con ghiaccio.

8. Sincronizzazione dell'età per FACS neuronale specifico

1. Utilizzare animali che combinano il genotipo di eccitotossicità (e altre mutazioni, a seconda delle esigenze) con l'espressione transgenica di un marcatore fluorescente forte che può essere facilmente utilizzato per la selezione (ad esempio, FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)⁵⁴. Allevare gli animali su due o tre piastre NGM/MYOB da 100 mm a 20 °C fino a quando la piastra non è piena di vermi prevalentemente gravidi.
2. Lavare i vermi dalle piastre utilizzando il tampone M9. Trasferire i vermi in provette coniche da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica di vetro da 10 mL.
3. Centrifugare a temperatura ambiente per 2,5 minuti a 250x g e rimuovere il surnatante.
4. Risospendere il pellet di verme in 10 mL di soluzione di candeggina (2% 10 N NaOH e 5% candeggina fresca per uso domestico in acqua deionizzata sterile).
5. Posizionare i tubi su uno shaker orizzontalmente, far oscillare a bassa velocità. Assicurarsi che le viti non si depositino sul fondo del tubo. La candeggina apre la cuticola del verme ma non intacca gli embrioni, che sono protetti dal guscio dell'uovo.
   1. Questa fase di decolorazione dura circa 5 minuti, ma varia. Per garantire che non si verifichi un eccesso di sbiancamento, monitorare il processo prelevando un campione ogni minuto: pipettare delicatamente 10 μl da ciascuna provetta su un vetrino da microscopio ed esaminare i vermi utilizzando un microscopio da dissezione.
6. Una volta che la maggior parte dei vermi gravidi si è aperta ma non completamente dissolta, interrompere la fase di sbiancamento riempiendo i tubi conici con tampone per uova.
7. Per recuperare gli ovuli/embrioni, centrifugare le provette a 250x g per 2,5 minuti, rimuovere il surnatante e lavare nuovamente con tampone per uova.
8. Ripetere altri quattro lavaggi.
9. Risospendere gli ovuli pipettando delicatamente il pellet e distribuirli su quattro piastre NGM/MYOB con semina da 100 mm. Lascia che gli embrioni si schiudano e crescano a 20 °C per 3 giorni.
   NOTA: Le placche dovrebbero ora essere piene di vermi prevalentemente gravidi.
10. Ripetere la sincronizzazione dell'età ripetendo questo protocollo di sincronizzazione candeggina/età.
11. Pipettare le uova su otto piastre NGM/MYOB da 100 mm. Lasciare che l'animale si schiuda e cresca a 20 °C fino allo stadio larvale desiderato.

9. Dissociazione di cellule di verme intere per FACS

1. Coltiva i vermi sincronizzati fino allo stadio di sviluppo desiderato. Lavare delicatamente le piastre da 100 mm con tampone M9 e pipette sierologiche in vetro e trasferirle in provette coniche da 50 mL.
2. Aggiungere M9 freddo fino a 45 ml. Metti i tubi sul ghiaccio per 30 minuti per consentire ai vermi di depositarsi sul fondo per gravità, mentre eventuali detriti batterici residui dalle piastre galleggeranno nel surnatante.
3. Rimuovere il surnatante e lavare i vermi con M9 fresco.
4. Ripeti i 30 minuti di sedimentazione gravitazionale sul ghiaccio.
5. Rimuovere il surnatante, aggiungere M9 fino a 45 ml e centrifugare a 250 x g per 5 minuti.
6. Trasferire il pellet in una provetta da microcentrifuga e aggiungere M9 fino a 1 mL.
7. Centrifugare a 14.000 giri/min su una centrifuga da tavolo per 1 minuto e rimuovere il surnatante.
8. Per distruggere la cuticola, risospendere il pellet di verme con SDS-DTT utilizzando (circa) il doppio del volume del pellet e incubare con dondolo a temperatura ambiente per 4 minuti per gli stadi L2-adulti.
   NOTA: Non superare i 4 minuti di incubazione in SDS-DTT perché il segnale proteico fluorescente diminuirà drasticamente con un trattamento SDS-DTT più lungo. Poiché la SDS-DTT è sensibile alla luce, non dovrebbe avere più di 3 mesi perché la soluzione potrebbe aver perso potenza con il tempo; Le dissociazioni funzionano meglio con la soluzione SDS-DTT preparata di recente.
9. Aggiungere 1x tampone uovo (pH 7,3, 335-345 mOsm) fino a 1 mL per interrompere il trattamento SDS-DTT.
10. Centrifugare a 14.000 giri/min su una centrifuga da tavolo per 1 minuto e rimuovere il surnatante.
11. Per distruggere ulteriormente la cuticola e dissociare le cellule degli animali, risospendere il pellet con una soluzione di pronasi a temperatura ambiente, utilizzando il triplo del volume del pellet.
12. Incubare a temperatura ambiente per 15-30 min.
13. Pipettare su e giù 40 volte ogni 5 minuti con una pipetta P-200 o P-1000, toccando il fondo della provetta con il puntale della pipetta.
    NOTA: La pressione creata dal contatto della punta con il fondo del tubo facilita la dissociazione della vite senza fine. Utilizzare un puntale del filtro in modo che i vermi non entrino accidentalmente nello stelo della pipetta durante il pipettaggio rapido.
14. Dopo 15 minuti, controllare l'andamento della dissociazione del verme pipettando delicatamente 5μl su un vetrino e osservando l'andamento al microscopio da dissezione. Quando la maggior parte (~90%) dei vermi intatti è scoppiata, il processo è completo.
    NOTA: L'incubazione della pronasi può essere prolungata se molti vermi rimangono intatti.
15. In una cappa per colture cellulari, aggiungere 1 tampone per uova fino a 1,5 mL per interrompere il trattamento con pronasi.
16. Trasferire nelle provette FACS, aggiungere 5 ml di tampone per uova e centrifugare a 800 x g per 5 minuti.
17. Rimuovere il surnatante e risospendere in 3 mL di tampone per uova.
18. Posizionare un tappo del filtro cellulare da 70 μm sulle nuove provette FACS, pipettare la sospensione cellulare sul filtro e centrifugare a 800 x g per 1 minuto. Raccogliere la sospensione della cella di efflusso.
19. Posizionare un tappo del filtro cellulare da 5 μm sulle nuove provette FACS, pipettare la sospensione cellulare sul filtro e centrifugare a 800 x g per 1 minuto.
20. Aggiungere DAPI per una concentrazione finale di 0,5 μg/mL nel tampone per uova, mettere su ghiaccio con un coperchio/coperchio per proteggere dalla luce.
21. Eseguire il FACS il prima possibile. Il segnale della proteina fluorescente diminuisce con il tempo e l'esposizione alla luce, quindi è importante eseguire il protocollo di dissociazione il più rapidamente possibile ed eseguire il FACS immediatamente dopo il completamento della dissociazione.
    NOTA: Il protocollo di dissociazione dei vermi è stato adattato dai protocolli del laboratorio Miller 55,56,57, del laboratorio Murphy ⁵⁸ e del laboratorio Shaham⁵⁹.

10. Modifiche al funzionamento della macchina FACS per l'identificazione dei neuroni di C. elegans

1. Utilizzare 4 litri di tampone d'uovo refrigerato (4 °C) al posto del normale liquido di guaina per la selezione dei neuroni di C. elegans .
   NOTA: L'osmolarità delle cellule di C. elegans è molto più alta di quella delle cellule di mammifero e il fluido della guaina standard farà scoppiare i neuroni. Tutte le impostazioni e le calibrazioni della macchina vengono eseguite dopo l'aggiunta del tampone uovo, perché la viscosità del tampone uovo è diversa da quella del fluido guaina standard. Il tecnico di smistamento farà passare le perline diagnostiche attraverso la macchina per garantire che i laser funzionino correttamente.
2. Quando i neuroni selezionati devono essere utilizzati in successivi studi di trascrittomica, selezionare un minimo di 100.000 cellule GFP+ direttamente in 800 μL di Trizol-LS + 10 μL di inibitore della RNasi.
3. Capovolgere le cellule in Trizol 15 volte per mescolare.
4. Congelare a scatto in un bagno di ghiaccio secco/etanolo e conservare a -80 °C fino al momento di estrarre l'RNA da tutti i campioni per un esperimento di sequenziamento dell'RNA.
   NOTA: Mentre la maggior parte delle cellule selezionate viene raccolta direttamente in Trizol per l'analisi del trascrittoma, assicurarsi di recuperare un piccolo campione di cellule selezionate GFP+ (da ciascun ceppo) raccolte nel tampone uovo, per la convalida al microscopio dell'efficienza dello smistamento.

11.Strategia di gating FACS

1. Per identificare il segnale positivo GFP utilizzare il laser a 488 nm con filtro 530/30 e 502 long pass (LP).
2. Per identificare le celle DAPI positive e negative utilizzare il laser a 405 nm con il filtro 450/50.
3. Per identificare le cellule autofluorescenti che potrebbero essere scambiate per cellule GFP-positive, utilizzare il laser a 488 nm con il filtro 610/20 e 595 LP (comunicazione personale, Stanka Semova, Operations Manager, Flow Cytometry Resource Center, Rockefeller University).
4. Eseguire una strategia di gating standard e rimuovere gli eventi con un'ampia area di dispersione laterale (SSC-A) e una piccola area di dispersione in avanti (FSC-A), che probabilmente rappresentano grumi di cellule e detriti.
5. Isolare i singoletti di dispersione di prefazione e poi i singoletti di dispersione laterale.
6. Isolare le cellule con un alto segnale GFP e un basso segnale di autofluorescenza.
   NOTA: Le cellule con un alto livello di autofluorescenza e un livello inferiore di GFP non sono vere cellule GFP positive.
7. La soglia per il gate GFP+ è determinata confrontando le cellule GFP- (cioè N2) con le cellule GFP+ ^55,56.
8. Rimuovere tutte le cellule morte con un cancello vivo/morto, in base alla permeabilità selettiva del DAPI alle cellule morte: la soglia per il cancello morto vivo è determinata confrontando le cellule non colorate con le cellule colorate DAPI.
   NOTA: Quando si selezionano più campioni, lavare il flusso tra i campioni per assicurarsi che non vi siano contaminazioni incrociate.

12. Microscopia di neuroni ordinati per convalidare l'efficienza della strategia di gating FACS

1. Disegna un cerchio su un vetrino da microscopio con una penna repellente per liquidi.
2. Pipettare 10 μl di cellule selezionate in sospensione nel tampone per uova all'interno del cerchio. Posizionare un vetrino coprioggetti sul campione e sigillare con smalto per unghie attorno al perimetro del vetrino coprioggetti.
3. Dopo che lo smalto si è asciugato, controllare al microscopio a fluorescenza verticale/invertito che le cellule selezionate siano effettivamente principalmente cellule GFP +.
   NOTA: Eseguire questo controllo dopo ogni sessione di smistamento per convalidare la strategia di gating FACS⁵⁷.

13. Estrazione dell'RNA e quantificazione della qualità dell'RNA su un sistema di elettroforesi automatizzato per il controllo qualità

NOTA: Tutto il lavoro sull'RNA deve essere eseguito con estrema cura per evitare la contaminazione con l'RNasi (compresa un'attenta preparazione di reagenti, materiali di consumo e le migliori pratiche sicure per l'RNasi).

NOTA: Eseguire tutti i passaggi in cui i campioni contengono fenolo e/o cloroformio in una cappa aspirante.

1. Scongelare le fiale di cellule in Trizol a temperatura ambiente.
2. Utilizzando un puntale del filtro P200, pipettare su e giù più volte per omogeneizzare il campione.
3. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
4. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio per 1 mL di reagente Trizol utilizzato per la lisi, quindi tappare saldamente la provetta.
5. Capovolgere le provette 15 volte e incubare (a 20-25 °C) per 2-3 minuti.
6. Centrifugare il campione per 15 minuti a 12.000 × g a 4 °C. La miscela si separa in una fase rossa fenolo-cloroformio inferiore, un'interfase e una fase acquosa superiore incolore.
7. Raccogliere esclusivamente la fase acquosa superiore contenente l'RNA e trasferirla in una nuova provetta da 1,5 mL a basso legame DNA/RNA.
   NOTA: In alcuni casi, se il rapporto tra le cellule del tampone per uova che sono uscite dal selezionatore di cellule in Trizol è maggiore di un rapporto 1:3 campione:Trizol-LS, l'alto contenuto di sale del tampone per uova può causare l'inversione degli strati; in tal caso, aggiungere altro Trizol-LS e ripetere l'inversione e la centrifugazione. Questo può essere evitato anche se si prende nota dell'aumento del volume del campione dopo lo smistamento; se il rapporto 1:3 non viene mantenuto, aggiungere una quantità sufficiente di trizol prima di iniziare l'estrazione dell'RNA.
8. Per purificare ulteriormente l'RNA, utilizzare la chimica della colonna di estrazione dell'RNA.
9. Utilizza il sistema di elettroforesi automatizzato per il controllo qualità per misurare il numero di integrità dell'RNA (RIN) e confermare un RIN dell'RNA di 8,0 o superiore per l'input nei successivi esperimenti di sequenziamento dell'RNA.

Risultati

Modello di eccitotossicità dei nematodi e identificazione dei neuroni degenerativi vacuolati
I dati qui riportati sono riprodotti da pubblicazioni precedenti^37,38. Per imitare la neurodegenerazione indotta da eccitotossicità, un knockout genico trasportatore del glutammato (glt-3) è combinato con un background transgenico neuronale sensibilizzante (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L); Pglr-1::GFP)

Discussione

Mentre le controversie e i fallimenti prevalenti suggeriscono che l'eccitotossicità presenta un processo eccezionalmente difficile da decifrare, l'analisi dell'eccitotossicità nel nematode offre una strategia particolarmente interessante per illuminare le vie di morte delle cellule neuronali conservate in questa forma critica di neurodegenerazione. Lo sperimentatore può fare affidamento sulla ricca collezione di strumenti di ricerca disponibili in questo sistema, e in particolare sulla t...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	VWR	AAA10752-0E
Bactopeptone	VWR	90000-264
BD FACSAriaIII
Candeggina	Qualsiasi domestico
CaCl2	VWR	97062-586
CaCl2· 2H2O	BioExpress	0556-500G
Filtro cellulare, PluriFiltro mini 70um	PluriSelect	43-10070-40
Filtro cellulare, PluriFiltro mini 5um	Centrifuga PluriSelect	43-10005-60
- 15-50 mL Sorval da banco  LEGENDX1R TC	Fisher Sci 75618382
Centrifuga - microfuge ; Ependorff 5424	VWR	MP022629891
Cloroformio	VWR	97064-680
Colesterolo	Sigma	C8667-25G
DAPI	Fisher Sci EN62248
Ghiaccio	secco United City Ice Cube
DTT	VWR	97061-340
E. coli OP50	CGC	OP50
Etanolo (100%)	VWR	EM-EX0276-1S
Etanolo (90%)	VWR	BDH1160-4LP
FACS tubi	USA Sci	1450-2810
Puntali filtranti	USA Sci	1126-7810
Pipette sierologiche in vetro da 10 mL	USA Sci	1071-0810
Blocco riscaldante	BioExpress	D-2250
Hepes	VWR	97061-824
Olio da immersione - Carl Zeiss Immersol	Fisher Sci	12-624-66A
Isopropanolo	VWR	EM-PX1830-4
KCl	VWR	BDH9258-2,5 kg
KH2PO4	VWR	BDH9268-2,5 kg
Provette da 1,5 ml a basso legame	USA Sci	4043-1021
Software di imaging Metamorph			molecolari
MgCl2	VWR	97063-152
MgCl2· 6H2O	BioExpress	0288-500g
MgSO4	VWR	97061-438
microscopio, confocale, per imaging a fluorescenza Microscopio	Zeiss	LSM 880
, invertito, per imaging a fluorescenza	Microscopio Zeiss	Axiovert 200 M
Fotocamera	Q-Imaging	Retiga R1
Microscopio Sorgente luminosa per imaging a fluorescenza	Lumencor	SOLA SE Light
Engine Microscopio, Nomarski DIC	Zeiss	Axiovert Observer A1
Microscopio, Nomarski DIC	Nikon	Eclipse Ti-S
Na2HPO4	VWR	97061-588
NaCl	VWR	BDH9286-2.5KG
NaOH	VWR	97064-476
piastre di Petri, 100mm	Fisher Sci FB0875712
piastre di Petri, 60mm	TriTech	T3308
Pipet Controller	TEquipment	P2002
Pipettor P10 Punte	USA Sci	1110-3000
Pipettor P1000 Punte	USA Sci	1111-2020
Pipettor P200 Tips	USA Sci	1110-1000
Pronase	Sigma	P8811-1G
RNAse away spray	Fisher Sci	7000TS1
Pipette sierologiche senza RNAsi	USA Sci	1071-0810
Provette da 50 mL senza RNAsi	USA Sci	5622-7261
RNeasy micro	Qiagen	74004
SDS	VWR	97064-496
Streptomicina solfato	Sigma	S6501-100G
Saccarosio	VWR	AAJ63662-AP
SUPERase· in inibitore della RNasi	Fisher Sci	AM2694
Sistema automatizzato di elettroforesi per il controllo qualità: Tapestation - High Sensitivity RNA ScreenTape	Agilent	5067-5579
Tapestation - Scala RNA ScreenTape ad alta sensibilità	Agilent	5067-5581
Tapestation - Tampone per campioni RNA ScreenTape ad alta sensibilità	Agilent	5067-5580
Tapestation - Vortexer IKA MS3	Agilent/IKA	4674100
Tapestation - Adattatore vortex IKA a 2000 giri/min	Agilent/IKA	3428000
Tapestation - Suggerimenti per il caricamento	Agilent	5067- 5152 o 5067- 5153
Tapestation - Cappuccio ottico 8x Strip	Agilent	401425
Tapestation - Tubo ottico 8x Strip	Agilent	401428
Sistema di elettroforesi automatizzato per il controllo di qualità: TapeStation 2200	Agilent	G2964AA
Tetramisole	Sigma	L9756-10G
Tris base	Fisher Sci	BP152-500
Tris cloridrato	Fisher Sci	BP153-500
Trizol-LS	Fisher Sci	10296-010
Wescor Vapro 5520 Osmometro a pressione di vapore	Fisher Sci NC0044806
Wheaton Unispense μ Dispenser P	VWR	25485-003