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Articolo metodologico

Una cultura di espianto della coda 3D per studiare la segmentazione dei vertebrati nel pesce zebra

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DOI:

10.3791/61981

⸱

30 giugno 2021

 , 
1Division of Developmental Biology, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine, 3Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo il protocollo per la coltura tissutale 3D dell'asse del corpo posteriore zebrafish, consentendo lo studio vivo della segmentazione dei vertebrati. Questo modello di espianto fornisce il controllo sull'allungamento dell'asse, l'alterazione delle sorgenti di morfogeno e l'imaging vivo a livello di tessuto a risoluzione subcellulare.

Abstract

Gli embrioni di vertebrati modellano il loro asse corporeo principale come somiti ripetitivi, precursori di vertebre, muscoli e pelle. I somiti si segmentano progressivamente dal mesoderma presomitico (PSM) mentre l'estremità posteriore dell'embrione si allunga posteriormente. I somiti si formano con periodicità regolare e dimensioni di scala. Zebrafish è un organismo modello popolare in quanto è geneticamente trattabile e ha embrioni trasparenti che consentono l'imaging dal vivo. Tuttavia, durante la somitogenesi, gli embrioni di pesce sono avvolti attorno a un grande tuorlo rotondo. Questa geometria limita l'imaging vivo del tessuto PSM negli embrioni di zebrafish, in particolare a risoluzioni più elevate che richiedono una distanza di lavoro oggettiva ravvicinata. Qui presentiamo un metodo di coltura tissutale 3D appiattito per l'imaging vivo delle espianto della coda di zebrafish. Gli espianto della coda imitano embrioni intatti mostrando un rallentamento proporzionale dell'allungamento dell'asse e accorciamento delle lunghezze del somite rostrocaudale. Siamo inoltre in grado di bloccare la velocità di allungamento dell'asse attraverso la coltura di espianto. Questo, per la prima volta, ci permette di districare l'ingresso chimico dei gradienti di segnalazione dall'ingresso meccanicistico dell'allungamento assiale. Negli studi futuri, questo metodo può essere combinato con una configurazione microfluidico per consentire perturbazioni farmaceutiche controllate nel tempo o screening della segmentazione dei vertebrati senza problemi di penetrazione del farmaco.

Introduzione

La segmentazione metamerica degli organismi è ampiamente utilizzata in natura. Le strutture ripetute sono essenziali per la funzionalità di organi laterale come vertebre, muscoli, nervi, vasi, arti o foglie in un piano corporeo1. Come risultato di tali vincoli fisiologici e geometrici della simmetria assiale, la maggior parte della phyla della Bilateria- come anellidi, artropodi e cordati-mostrano segmentazione dei loro tessuti embrionali (ad esempio, ectoderma, mesoderma) antero-posteriormente.

Gli embrioni di vertebrati segmentano sequenzialmente il loro mesoderma parassiale lungo l'asse corporeo principale in somiti con intervalli specifici per specie, conteggi e distribuzioni delle dimensioni. Nonostante tale robustezza tra i singoli embrioni all'interno di una specie, la segmentazione del somite è versatile tra le specie di vertebrati. La segmentazione avviene in un vasto regime di intervalli di tempo (da 25 minuti in zebrafish a 5 h nell'uomo), dimensioni (da ~ 20 μm in somiti di coda di zebrafish a ~ 200 μm in somiti tronco di topi) e conti (da 32 in zebrafish a ~ 300 nei serpenti di mais)2. Ancora più interessante, gli embrioni di pesce possono svilupparsi in una vasta gamma di temperature (da ~ 20,5 ° C fino a 34 ° C per il pesce zebra) mantenendo intatti i loro somiti con una corretta distribuzione delle dimensioni compensando sia gli intervalli di segmentazione che le velocità di allungamento assiale. Al di là di tali caratteristiche interessanti, zebrafish rimane un organismo modello utile per studiare la segmentazione nei vertebrati a causa dello sviluppo esterno, sincrono e trasparente di una plenitudine di embrioni fratelli e dei loro strumenti genetici accessibili. Negativamente dal punto di vista della microscopia, gli embrioni di teleost si sviluppano su un ingombrante tuorlo sferico, allungando e arrotondando il tessuto gastrulante intorno ad esso (Figura 1A). In questo articolo, presentiamo una coltura appiattita di espianto di tessuti 3D per le code di zebrafish. Questo sistema di espianto aggira i vincoli sferici della massa del tuorlo, consentendo l'accesso all'imaging vivo ad alta risoluzione di embrioni di pesce per il modello somite.

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Figura 1: Sistema di espianto a camera di scorrimento per embrioni zebrafish. (A) Gli embrioni di zebrafish hanno vantaggi per l'imaging dal vivo, come la trasparenza del tessuto embrionale gastrulante (blu), ma il tessuto si forma attorno a una massa di tuorlo sferico ingombrante (giallo) che impedisce immagini quasi oggettive e ad alta risoluzione in embrioni intatti. Le esplant di coda possono essere sezionate a partire da un coltello microchirurgico (marrone) tagliato dal tessuto anteriore dei somiti (rosso) e continuando al confine con il tuorlo posteriormente. (B) Le espianto di coda sezionate possono essere posizionate su un dorsoventrally coverslip (azzurro); mantenendo il tessuto neurale (grigio chiaro) in cima e notocordo (grigio scuro) nella parte inferiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

Questo protocollo prevede l'uso di embrioni vertebrati vivi di età inferiore a 1 giorno dopo la fecondazione. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida etiche del Cincinnati Children's Hospital Medical Center; protocolli animali sono stati rivisti e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (Protocollo # 2017-0048).

1. Raccolta embrionale

  1. Imposta coppie di zebrafish nei serbatoi di attraversamento la notte prima del giorno della raccolta degli embrioni. Per un controllo preciso della stadiazione dello sviluppo degli embrioni, utilizzare barriere tra coppie di accoppiamento.
  2. Alza le barriere prima del tempo di deposizione delle uova preferito e raccogli le uova entro 15 minuti in una piastra di Petri da 100 mm.
    1. Pulire i detriti dalla piastra di Petri. Se più di 50 embrioni vengono raccolti da una singola frizione, dividere la frizione in più piastre di Petri di conseguenza.
  3. Incubare gli embrioni nell'acqua del sistema ittico a 28 °C fino a raggiungere il 50% dello stadio di epiboly (5 ore dopo la fecondazione). Un mezzo standardizzato di crescita dell'embrione come E3 può anche essere utilizzato al posto dell'acqua del sistema dell'acquario fino al passaggio 3.2.
    1. Rimuovere le uova non fecondate sotto uno stereoscopio e spostare gli embrioni in un incubatore di 23,5 °C durante la notte (O /N). Gli embrioni dovrebbero essere in fase di 8-10 somiti la mattina successiva al giorno della raccolta.

2. Preparazione dell'utensile

  1. Sterilizzare la lama del coltello in microchirurgia, le punte dell'ago (utilizzate per la dissezione del tessuto) e la pipetta Pasteur in vetro immergendosi in etanolo al 100% (EtOH) e vetri antincendio.
  2. Utilizzare due strati di nastro trasparente (~100-120 μm di spessore) su vetrini da microscopio da 25 mm x 75 mm. Tagliare ~18 mm x 18 mm quadrati al centro del rivestimento del nastro di ogni diapositiva con bisturi.
    1. Pulire le camere scorrevoli preparate con 70% EtOH. Questi pozzi recheranno ~40 μL di mezzo.

3. Preparazione del campione

  1. Dechorionate embrioni usando la punta di due siringhe ad ago sotto uno stereoscopio. Trasferire gli embrioni in una piastra di Petri separata con acqua del sistema ittico per risciacquare.
  2. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro smaltato dal fuoco, trasferire embrioni in una piastra di Petri di 6 cm contenente mezzo di dissezione (mezzo di coltura cellulare Leibovitz-15 con L-glutammina senza fenolo rosso, 0,8 mM CaCl2 e 1× soluzione antibiotico-antimicotica).
    NOTA: Continuare a utilizzare una pipetta di vetro sterilizzata per tutti i trasferimenti successivi a questo passaggio.
    1. Utilizzare una piastra di Petri in vetro per la procedura di espianto per evitare trucioli di polistirolo durante la dissezione.
  3. Mettere 50 μL di mezzo di crescita tissutale (mezzo di dissezione e 10% FBS) nella camera di scorrimento.
  4. Stabilizzare un embrione per la dissezione sotto lo stereoscopio con una punta dell'ago all'intersezione tra vitellino vicino al cervello posteriore.
  5. Mantenendo stabile il tessuto embrionale con un ago, utilizzare il coltello microchirurgico con la lama tenuta a 45° per tagliare il tessuto anteriore al cervello posteriore e staccare il tuorlo dal tessuto embrionale partendo dalla parte anteriore e spostandosi verso il bocciolo di coda(Figura 1A).
    NOTA: Fare attenzione a non perdere il tessuto cutaneo durante la pulizia del tuorlo. La pelle si stacca facilmente come tessuto elastico a strato singolo che si affianca intorno all'embrione durante la dissezione, quindi è facile da riconoscere.
  6. Una volta che il tuorlo è completamente rimosso dal corpo embrionale, tagliare il tessuto cutaneo di fianco dal coccinella. Mantenendo intatti gli ultimi 3-4 somiti formati, tagliare il tessuto più anteriore (espianto a tutto l'asse).
    1. Il tuorlo dovrebbe staccarsi principalmente intatto da questa procedura. In caso di tuorlo rotto, granuli significativi di tuorlo possono rimanere attaccati alla superficie ventrale del tessuto. In tal caso, utilizzare uno strumento per le ciglia per pulire delicatamente i granuli di tuorlo rimanenti.
      NOTA: Uno squilibrio dei tessuti cutanei sui lati laterali di un'espianto non consentirebbe al tessuto di mantenere una direzione di crescita dritta. L'espianto invece si piegherà verso il lato di una pelle più tesa. Questo squilibrio può essere corretto sotto lo stereoscopio ruttando lo strato cutaneo con l'aiuto di coltello microchirurgico.
    2. Per le espianto senza pelle, premere su una punta dello strato cutaneo con ago e sbucciare il tessuto espulso con il coltello microchirurgico. Queste espianto non allineeranno il loro asse corporeo in coltura.
    3. Oltre agli espianto a tutto l'asse, è possibile fare espianto alternativo in questa fase. Ad esempio, sezionare somiti già segmentati utilizzando il coltello microchirurgico (espianto full-PSM) o sezionare il PSM nel suo mezzo anteroposterior (semi-PSM espianto). Si prega di consultare la sezione 5.1 per l'applicazione di tali espianto alternativi.
  7. Trasferire immediatamente l'espianto sezionato su un coverslip da 22 mm x 22 mm su cui verrà eseguita l'imaging.
    1. Disporre l'explant piatto sull'asse dorsoventrale, il lato ventrale toccando il coverslip (Figura 1B). Rimuovere delicatamente il supporto in eccesso intorno all'espianto tissutale utilizzando una pipetta filtrata a punta da 20 μL.
      NOTA: Il trasferimento ritardato delle espianto sezionato al coverslip provoca deformazioni del tessuto, in quanto è alleviato dai vincoli geometrici del tuorlo.
  8. Capovolgere rapidamente e con attenzione il coverslip con l'espianto sulla camera di scorrimento riempita di mezzo di crescita.
    1. Per evitare la formazione di bolle, posizionare un lato del coperchio quadrato sulla camera a nastro e rilasciare delicatamente l'altro lato. Fare attenzione a non spostare/deformare l'espianto in questo passaggio.
    2. Rimuovere delicatamente il sanguinamento del supporto in eccesso dalla camera premendo la camera di scorrimento su un tessuto di laboratorio. Il coverslip si siederà stabilmente sulla camera di scorrimento per l'imaging dal vivo, a causa della tensione superficiale del mezzo liquido senza alcuna sigillatura.
    3. Per la ristrutturazione a lungo termine (>6 ore), utilizzare una camera più grande. In questi casi è possibile utilizzare copripazzo rettangolari da 22 mm x 50 mm insieme a due corsie parallele di strati di nastro sui vetrini. Uno spazio largo ~ 1 mm può essere lasciato tra due corsie a nastro per facilitare l'accesso all'aria nel mezzo di crescita.
  9. Ripetere i passaggi 3.3-3.8 per preparare più espianto. Le espianto preparate allineeranno il loro asse del corpo A-P con una velocità media di ~ 30 μm / h e segmenteranno i loro somiti con intervalli ~ 40 minuti a 25 °C(Figura 2A, Video 1).
    1. Per le espianto non allunganti, applicare una leggera pressione sui lati dello scivolo tenendo il campione nel passaggio 3.8.2 mentre si succhia il supporto in eccesso su un tessuto di laboratorio. In alternativa, gli espianto possono essere coltivati in camere scorrevoli a strato di nastro singolo. Inoltre, l'attivazione chimica della superficie della camera scorrevole con collagene di tipo I comporterà espianto non allungante(Figura 2B,Video 2).
      1. Eseguire il rivestimento della camera con collagene di tipo I in anticipo coprendo completamente le camere scorrevoli con 15-20 mL di soluzione di collagene prediluto a temperatura ambiente per 1 h. Utilizzare una cappa di flusso laminare per questo protocollo per mantenere la sterilità. Risciacquare accuratamente le camere con mezzo di dissezione alla fine.
    2. Per gli embrioni di età superiore a 15 stadio di somite, montare lateralmente il tessuto di espianto della coda anziché un supporto piatto (dorsoventral) (Video 3). Per prevenire contrazioni muscolari, includere la soluzione di tricaina allo 0,004% nei mezzi di coltura come agente anestetico3.

4. Acquisizione di immagini in diretta

  1. Campioni di immagini su un campo di dissezione per l'imaging luminoso trasmesso su vasta scala di dimensioni e periodi di segmentazione somite, o con microscopia strutturata illuminazione/ confocale / foglio luminoso utilizzando linee di pesce reporter transgeniche.
  2. Equilibrare la temperatura degli espianto tissutali con la temperatura ambiente di imaging per almeno 15 minuti.
    1. Per un controllo della temperatura più preciso, utilizzare un sistema di controllo della temperatura commerciale montato su un microscopio invertito.
  3. Impostare gli intervalli del fotogramma di acquisizione dell'immagine su 2 - 10 minuti a seconda del processo biologico di interesse.
    NOTA: La segmentazione del somite zebrafish è un processo veloce, che va da 20 a 55 minuti per temperature vitali da 30 °C a 21,5 °C in embrioni interi. Le espianto si allineeranno e segmenteranno ~ 30% più lentamente rispetto agli embrioni interi.
    1. Prestare attenzione a lasciare abbastanza ritardo tra i set di acquisizioni di canali per evitare possibili fototossicità per vivere il tessuto. Non esporre il tessuto al fascio di eccitazione per più della metà della durata dell'imaging e abbassare il più possibile l'intensità del fascio.
      NOTA: L'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è generalmente la principale causa di fototossicità nei campioni vivi4. L'acido ascorbico come spazzino ROS può essere integrato al mezzo di crescita a concentrazione di 4 mM per tamponare l'attività del ROS e alleviare la fototossicità. Gli effetti avversi della fototossicità potrebbero essere difficili da notare durante l'imaging dal vivo. Le esplant della coda sono vantaggiose in questo aspetto poiché alcuni marcatori visivi di fototossicità come l'arresto mitotico, lo sviluppo dei tessuti ostacolati (cioè la formazione di somiti, l'allungamento della coda) e il tessuto disgregante sono più facili da notare. Si prega di fare riferimento al riferimento4 fornito per una discussione dettagliata.
  4. Usa embrioni iniettati di RNA a stadio singolo per acquisire immagini 4D destinate a essere segmentate e analizzate a livello di risoluzione cellulare.
    1. Utilizzare 300 pg di RNA da membrane trascritte in vitro e plasmidi marcatori reporter fluorescenti nucleari come pCS-membrane-ceruleanFP (Addgene plasmid #53749) o pCS-memb-mCherry (plasma addgene #53750) in combinazione con pCS2+ H2B-mTagBFP2 (Addgene plasmid #99267) o pCS2+ H2B-TagRFP-T (Addgene plasmid #99271) in iniezioni. Per un filmato di esempio con membrana cellulare e marcatori di nuclei, vedere Video 4.
      NOTA: La dimensione media cellulare del tessuto PSM è di circa ~ 5 μm di diametro, di cui i nuclei comprendono ~ 3 - 4 μm. Una dimensione in pixel di ~0,5 μm e una sezione z di ~1 μm devono essere registrate per una corretta segmentazione cellulare.

5. Immunostaining degli espianto della coda

NOTA: I tessuti coltivati dopo vari scenari di dissezione (allungamento, non allungamento, germogli di coda sezionati, metà PSM ecc.) come espianto di coda a paretepiatta 5 possono essere recuperati dalle camere di scorrimento per ulteriori quantificazioni immunosottenibili delle proteine di interesse. Qui, presentiamo il protocollo utilizzato per la colorazione della chinasi regolata dal segnale extracellulare di-fosforilato (ppERK) degli espianto come lettura del gradiente di segnalazione FGF.

  1. Dopo la formazione di somiti fino allo stadio desiderato, spostare cautamente il coverslip a metà strada verso l'angolo della camera di scorrimento senza sollevare.
  2. Con l'aiuto di ~ 100 μL di mezzo di dissezione supplementare in una pipetta Pasteur in vetro, recuperare le espianto dallo scivolo e trasferirli in una piastra di coltura cellulare da 64 po '.
    NOTA: A partire da questo passaggio, tutte le sostituzioni della soluzione possono essere eseguite sotto un mirino di dissezione con una pipetta di vetro separata per campioni fissi. Ciò garantirà di non perdere tessuti di espianto nei pozzi o trasferirli nel mezzo.
  3. Dopo aver trasferito tutte le espianto, succhiare il mezzo eccessivo dai pozzi uno per uno e mettere 100 μL di paraformaldeide al 4% in PBS (PFA) in ogni pozzo.
    ATTENZIONE: La PFA è una soluzione tossica con effetti cancerogeni. Durante la manipolazione devono essere utilizzati DPI adeguati.
  4. Fissare gli espianto in una piastra da 64 po po' a temperatura ambiente per 1 h su uno shaker.
    1. Le esplant tissutali sono più sensibili alle deformazioni rispetto agli embrioni interi. Regolare la velocità dello shaker di conseguenza.
  5. Lavare il fissatore con 150 μL di PBS-Tw (0,1% Tween20 in PBS) tre volte. Raccogliere il primo lavaggio in uno specifico contenitore "PFA Waste".
  6. Disidratare le espianto in 4×5 minuti sostituendo ~40 μL di soluzione ogni volta con il 100% di metanolo (MeOH).
    ATTENZIONE: Il MeOH è una sostanza chimica tossica volatile e infiammabile. Lavorare in uno spazio ben ventilato e utilizzare dPI adeguati per la movimentazione.
  7. Come ultimo passaggio di disidratazione, rimuovere tutta la soluzione dai pozzi e sostituirla con 100 μL di MeOH. Incubare a -20 °C per 15 min.
    NOTA: Utilizzare uno specifico contenitore "MeOH Waste" per raccogliere le soluzioni fino al passaggio 5.11.
  8. Aggiungere 50 μL di MeOH e agitare a temperatura ambiente per 5 minuti.
  9. Reidratare gli espianto in passaggi di 4×5 minuti sostituendo ~40 μL di soluzione ogni volta con PBS-T (0,1% Triton-X 100 in PBS). Utilizzare uno specifico contenitore "MeOH Waste" per raccogliere le soluzioni.
  10. Come ultimo passaggio di reidratazione, rimuovere tutta la soluzione dai pozzi e sostituirla con 100 μL di PBS-T.
  11. Per la permeabilità tissutale trattare le espianto con 1,5% Triton-X 100 in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente sullo shaker.
  12. Lavare i campioni con MAB-D-T (0,1% tritone-X 100 detergente e 1% di solfossido di dimetile (DMSO) in 150 mM NaCl 100 mM tampone di acido maleico pH 7,5) 3×5 min.
    ATTENZIONE: Il DMSO è infiammabile e un mutageno tossico. Durante la manipolazione devono essere utilizzati DPI adeguati.
  13. Incubare le espianto in soluzione di blocco del siero 100 μL/pozzo (siero bovino fetale al 2% in MAB-D-T) per 2 ore a temperatura ambiente.
  14. Sostituire tutta la soluzione di blocco con soluzione anticorpale primaria da 50-100 μL/pozzo (diluizione 1:1000 di anticorpo monoclonale del topo contro ppERK in blocco siero). Incubare campioni O/N (>16 h) a 4 °C sullo shaker.
  15. Lavare la soluzione anticorpale primaria con MAB-D-T 5×5 min.
  16. Incubare campioni in soluzione anticorpale secondaria (Alexa Fluor 597 capra anti-topo IgG2b (1:200) e Hoechst 33342 (1:5000) in MAB-D-T) O/N a 4 °C su uno shaker o per 3 ore a temperatura ambiente.
    NOTA: A partire da questa fase, coprire la piastra da 64 pozzi con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione leggera di campioni trattati con anticorpi secondari.
    ATTENZIONE: Hoechst 33342 è un potenziale cancerogeno. Durante la manipolazione devono essere utilizzati DPI adeguati.
  17. Lavare la soluzione anticorpale secondaria con PBS-Tw 3×5 min.
  18. Fissare i campioni con PFA per 15 minuti a temperatura ambiente.
  19. Lavare il fissatore con campioni di PBS-Tw ed equilibrare i campioni entro il 60% di glicerolo. Montare le espianto su vetrini al microscopio con smalto per unghie e glicerolo al 60% per l'imaging. Per i risultati rappresentativi dell'immunosottenzione si veda la figura 3.

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Risultati

Questo protocollo consente una 155 atura geometrica piatta delle espianto di coda di zebrafish vive. La coltura tissutale presenta tre principali vantaggi rispetto agli embrioni interi: 1) controllo della velocità di allungamento dell'asse, 2) controllo su varie fonti di segnalazione (morfogeno) mediante semplice dissezione e 3) quasi obiettivo, alto ingrandimento e imaging vivo NA elevato.

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Discussione

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato di una tecnica di espianto di coltura tissutale che abbiamo sviluppato eutilizzato di recente 5 per gli embrioni di zebrafish. La nostra tecnica si basa sui precedenti metodi di espianto negliorganismi modello chick 8 e zebrafish9,10,11. Le esplant di coda preparate con questo protocollo possono sopravvivere fino a >12 ore in una s...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare e non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo l'AECOM Zebrafish Core Facility e cincinnati Children's Veterinary Services per la manutenzione del pesce, il Cincinnati Children's Imaging Core per l'assistenza tecnica, Didar Saparov per l'assistenza nella produzione video e Hannah Seawall per la modifica del manoscritto. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Sanità con il numero di premio R35GM140805 a E.M.Ö. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa Sub-Q da 1 ml con ago PrecisionGlideBecton, Dickinson and Co.REF 309597per la decoronazione di embrioni e manipolazioni
200 Proof Ethanol, AnhydrousDecon Labs2701per l'immunocolorazione
Soluzione antibiotica antimicotica (100×)Sigma-AldrichA5955per terreni di dissezione tissutale
Cloruro di calcio anidro, polvereSigma-Aldrich499609per terreni di dissezione tissutale
DimetilsolfossidoSigma-AldrichD5879per immunocolorazione
Bisturi monouso, acciaio inossidabile #10Integra-MiltexMIL4-411per la preparazione di pozzetti di scorrimento a nastro
Etile 3-amminobenzoato sale metansolfonato (Tricaina)Sigma-Aldrich886-86-2(opzionale) per l'anestetizzazione di tessuti di età superiore a 20 somiti stadio
Siero fetale bovino (FBS)ThermoFisherA3160601aggiuntivo per terreni di coltura tissutale
Capra anti-Topo IgG2b, Alexa Fluor 594InvitrogenCat#A-21145; RRID:AB_2535781 anticorpo secondario per l'immunocolorazione
L-15 Medium con L-Glutammina senza rosso fenoloGIBCO21083-027per terreni di dissezione tissutale
MetanoloSigma-Aldrich179337per l'immunocolorazione
Coltello corneale microchirurgico Punta angolata da 2,85 mm Lama a doppia smussaturaSpecialità chirurgiche72-2863per la dissezione tissutale
Monoclonale di topo anti-ppERKSigma-AldrichCat#M8159; RRID:AB_477245per l'immunocolorazione ppERK
NucRed Live 647 Reagente ReadyProbesInvitrogenR37106(opzionale) per la colorazione in tempo reale dei nuclei cellulari Polvere di
paraformaldeide, 95%158127 Sigma-Aldrichper la fissazione di campioni per l'immunocolorazione Soluzione di
rivestimento in collagene a coda di rattoSigma-Aldrich122-20(opzionale) per l'attivazione chimica delle camere di scorrimento
Stage Top IncubatorTokai Hittokai-hit-stxg(opzionale) per il controllo della temperatura durante l'imaging dal vivo
Nastro trasparente 3/4''ScotchS-9782per la preparazione di pozzetti di scorrimento a nastro
Triton X-100Sigma-AldrichX100per l'immunocolorazione
Tween 20Sigma-AldrichP1379per l'immunocolorazione
Zebrafish: Tg( actb2:2xMCP-NLS-EGFP)Campbellet al., 2015ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4pesce transgenico con EGFP localizzato nucleare
Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)Cooper et al., 2005ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75pesce transgenico con EGFP localizzato a membrana cellulare

Riferimenti

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