Articolo metodologico

Modificazione genetica basata sull'elettroporazione delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie utilizzando il sistema di trasposone della bella addormentata nel bosco

DOI:

10.3791/61987

⸱

4 febbraio 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

In questo articolo

Sommario

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Abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare le cellule epiteliali pigmentate umane primarie mediante elettroporazione con il gene che codifica il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Il successo della trasfezione è stato dimostrato mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), immunoblotting e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

Abstract

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La nostra società sempre più anziana porta a una crescente incidenza di malattie neurodegenerative. Finora, i meccanismi patologici non sono adeguatamente compresi, impedendo così l'istituzione di trattamenti definiti. Le terapie geniche additive basate sulle cellule per l'aumentata espressione di un fattore protettivo sono considerate un'opzione promettente per medicare le malattie neurodegenerative, come la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Abbiamo sviluppato un metodo per l'espressione stabile del gene che codifica per il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF), che è caratterizzato come una proteina neuroprotettiva e anti-angiogenica nel sistema nervoso, nel genoma delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie (PE) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Le cellule PE primarie sono state isolate dagli occhi dei donatori umani e mantenute in coltura. Dopo aver raggiunto la confluenza, 1 x 104 cellule sono state sospese in 11 μL di tampone di risospensione e combinate con 2 μL di una soluzione purificata contenente 30 ng di plasmide iperattivo SB (SB100X) trasposasi e 470 ng di plasmide trasposone PEDF . La modificazione genetica è stata effettuata con un sistema di elettroporazione capillare utilizzando i seguenti parametri: due impulsi con una tensione di 1.100 V e una larghezza di 20 ms. Le cellule trasfettate sono state trasferite in piastre di coltura contenenti terreno integrato con siero fetale bovino; Antibiotici e antimicotici sono stati aggiunti con il primo scambio di mezzo. La trasfezione di successo è stata dimostrata in esperimenti eseguiti in modo indipendente. La reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) ha mostrato l'aumentata espressione del transgene PEDF . La secrezione di PEDF era significativamente elevata e rimaneva stabile, come valutato mediante immunoblotting e quantificato mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Il trasferimento mediato da SB100X ha permesso un'integrazione stabile del gene PEDF nel genoma delle cellule PE e ha assicurato la secrezione continua di PEDF, che è fondamentale per lo sviluppo di una terapia di aggiunta genica basata su cellule per il trattamento di AMD o altre malattie degenerative della retina. Inoltre, l'analisi del profilo di integrazione del trasposone PEDF in cellule PE umane ha indicato una distribuzione genomica quasi casuale.

Introduzione

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L'età avanzata è descritta come il principale rischio di malattie neurodegenerative. La degenerazione maculare legata all'età (AMD), una malattia poligenica che porta a una grave perdita della vista nei pazienti di età superiore ai 60 anni, appartiene alle quattro cause più comuni di cecità e compromissione della vista1 e si prevede che aumenterà a 288 milioni di persone nel 20402. Le disfunzioni dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), un singolo strato di cellule strettamente impacchettate situate tra il coriocapillare e i fotorecettori retinici, contribuiscono alla patogenesi dell'AMD. L'RPE svolge molteplici compiti essenziali per una normale funzione retinica3 e secerne una varietà di fattori di crescita e fattori essenziali per mantenere l'integrità strutturale della retina e del coriocapillare, supportando così la sopravvivenza dei fotorecettori e fornendo una base per la circolazione e l'apporto di nutrienti.

Negli occhi sani, il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) è responsabile del bilanciamento degli effetti del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e protegge i neuroni dall'apoptosi, previene la proliferazione delle cellule endoteliali e stabilizza l'endotelio capillare. Uno spostamento del rapporto VEGF-PEDF è correlato alla neovascolarizzazione oculare, che è stata osservata nei modelli animali4,5 e in campioni di pazienti con neovascolarizzazione coroideale (CNV) dovuta a AMD e retinopatia diabetica proliferativa 6,7,8,9,10 . L'aumento della concentrazione di VEGF è l'obiettivo per l'attuale trattamento standard. I farmaci anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept e, più recentemente, brolucizumab migliorano l'acuità visiva in circa un terzo dei pazienti con CNV o meglio stabilizzano la vista nel 90% dei casi11,12,13. Tuttavia, le frequenti iniezioni intravitreali, spesso mensili, comportano il rischio di eventi avversi14, compromettono la compliance del paziente e rappresentano un onere economico significativo per i sistemi sanitari15. Inoltre, una certa percentuale di pazienti (2%-20%) non risponde o reagisce solo male alla terapia anti-VEGF16,17,18,19. Questi concomitanti negativi richiedono lo sviluppo di trattamenti alternativi, ad esempio impianti intraoculari, approcci terapeutici cellulari e/o genici.

La terapia genica si è evoluta come trattamento promettente per le malattie ereditarie e non ereditarie e intende ripristinare sequenze geniche non funzionali o sopprimere quelle malfunzionanti. Per le malattie poligeniche, dove l'identificazione e la sostituzione dei fattori causali è difficilmente possibile, le strategie mirano alla fornitura continua di un fattore protettivo. Nel caso dell'AMD, sono state sviluppate varie terapie additive, come l'espressione stabile di endostatina e angiostatina20, l'antagonista VEGF tirosin-simile alla tirosin-chinasi-1 (sFLT-1)21,22, il cluster proteico regolatore del complemento della differenziazione 59 (CD59)23 o PEDF 24,25 . L'occhio, e in particolare la retina, è un bersaglio eccellente per un farmaco basato su geni a causa della struttura chiusa, della buona accessibilità, delle piccole dimensioni e del privilegio immunitario, consentendo così una consegna localizzata di basse dosi terapeutiche e rendendo i trapianti meno suscettibili al rigetto. Inoltre, l'occhio consente un monitoraggio non invasivo e la retina può essere esaminata con diverse tecniche di imaging.

I vettori virali sono, a causa della loro elevata efficienza di trasduzione, il veicolo principale per fornire geni terapeutici nelle cellule bersaglio. Tuttavia, a seconda del vettore virale utilizzato, sono state descritte diverse reazioni avverse, come risposte immunitarie e infiammatorie26, effetti mutageni e oncogeni 27,28 o disseminazione in altri tessuti29. Le limitazioni pratiche includono una dimensione di imballaggio limitata30, nonché difficoltà e costi associati alla produzione di lotti di grado clinico31,32. Questi inconvenienti hanno promosso l'ulteriore sviluppo di vettori non virali basati su plasmidi che vengono trasferiti tramite lipo / poliplex, ultrasuoni o elettroporazione. Tuttavia, l'integrazione genomica del transgene nel genoma dell'ospite di solito non è promossa con vettori plasmidici, risultando così in un'espressione transitoria.

I trasposoni sono frammenti di DNA presenti in natura che cambiano la loro posizione all'interno del genoma, una caratteristica che è stata adottata per la terapia genica. Grazie ad un meccanismo di integrazione attivo, i sistemi vettoriali basati su trasposoni consentono un'espressione continua e costante del transgene inserito. Il trasposone della Bella Addormentata (SB), ricostituito da un antico trasposone di tipo Tc1/marinaio trovato nel pesce33 e ulteriormente migliorato dall'evoluzione molecolare risultante nella variante iperattiva SB100X34, ha permesso una trasposizione efficiente in varie cellule primarie ed è stato utilizzato per la correzione fenotipica in diversi modelli di malattia35. Attualmente, 13 studi clinici sono stati avviati utilizzando il sistema di trasposone SB. Il sistema di trasposone SB100X è costituito da due componenti: il trasposone, che comprende il gene di interesse affiancato da ripetizioni invertite terminali (TIR), e la trasposasi, che mobilizza il trasposone. Dopo la consegna del DNA plasmidico alle cellule, la trasposasi lega i TIR e catalizza l'escissione e l'integrazione del trasposone nel genoma della cellula.

Abbiamo sviluppato una terapia additiva non virale basata su cellule per il trattamento dell'AMD neovascolare. L'approccio comprende l'inserimento basato sull'elettroporazione del gene PEDF in cellule epiteliali pigmentate primarie (PE) mediante il sistema di trasposone SB100X 36,37,38. Le informazioni genetiche della trasposasi e del PEDF sono fornite su plasmidi separati, consentendo così la regolazione del rapporto ideale tra trasposone SB100X e PEDF. L'elettroporazione viene eseguita utilizzando un sistema di trasfezione capillare basato su pipette caratterizzato da una dimensione massima dello spazio tra gli elettrodi, riducendo al minimo la loro superficie. Il dispositivo ha dimostrato di raggiungere eccellenti tassi di trasfezione in una vasta gamma di cellule di mammifero 39,40,41. La piccola superficie dell'elettrodo fornisce un campo elettrico uniforme e riduce i vari effetti collaterali dell'elettrolisi42.

La funzionalità anti-angiogenica del PEDF secreta dalle cellule epiteliali pigmentate trasfettate è stata dimostrata in vari esperimenti in vitro analizzando la germinazione, la migrazione e l'apoptosi delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana43. Inoltre, il trapianto di cellule trasfettate con PEDF in un modello di coniglio di neovascolarizzazione corneale44 e in un modello di ratto di CNV43,45,46 ha mostrato un declino della neovascolarizzazione.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'inserimento stabile del gene PEDF in cellule RPE umane primarie tramite il sistema di trasposone SB100X utilizzando un sistema di trasfezione capillare. Le cellule trasfettate sono state tenute in coltura per 21 giorni e successivamente analizzate in termini di espressione genica PEDF mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) e in termini di secrezione proteica PEDF mediante immunoblotting e saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA, Figura 1).

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Protocollo

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Gli occhi dei donatori umani sono stati ottenuti dalla Banca della cornea di Aquisgrana del Dipartimento di Oftalmologia (Ospedale universitario RWTH di Aquisgrana) dopo aver ottenuto il consenso informato in conformità con i protocolli della Dichiarazione di Helsinki. Le procedure per la raccolta e l'uso di campioni umani sono state approvate dal comitato etico istituzionale.

1. Isolamento di cellule RPE umane primarie

  1. Stendere indumenti protettivi sterili e guanti. Posizionare un drappo sterile sotto un flusso laminare.
  2. Posizionare gli strumenti sterili di preparazione e altre attrezzature sterili necessarie sotto il flusso laminare.
  3. Registrare la ricezione dei globi oculari, l'inizio della preparazione e possibili anomalie. Registrare l'età del donatore, il sesso, la causa della morte e il periodo tra il momento della morte e la rimozione degli occhi.
  4. Posizionare il globo oculare in un impacco di garza sterile e tenerlo in una mano.
  5. Separare il segmento anteriore dal segmento posteriore con un taglio circonferenziale di circa 3,5 mm posteriormente al limbus usando un bisturi e una forbice per occhi appuntita extra fine.
  6. Dopo aver inclinato il segmento posteriore verso il basso, rimuovere con cura il vitreo e la retina usando una pinza colibri.
  7. Riorganizzare discretamente il complesso RPE/choroidea collassato usando una pinza a iride dritta e successivamente tenerlo in posizione con una pinza dell'iride curva.
  8. Riempire la coppa oculare posteriore con 1 mL di Modified Eagle's Medium/Ham's F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) di Dulbecco integrata con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 80 U/mL di penicillina e 80 μg/mL di streptomicina (Pen/Strep) e 2,5 μg/mL di amfotericina B (AmphoB).
    NOTA: Contrariamente all'isolamento delle cellule RPE primarie dagli occhi di maiale o bovino36,37, la coppa oculare posteriore non deve essere riempita e incubata con tripsina.
  9. Raccogliere le cellule RPE spazzolando delicatamente l'epitelio pigmentato retinico dal nervo ottico verso il limbus con una pipetta Pasteur in vetro curvo lucidato a fuoco, mentre si fissa il complesso RPE / choroidea al limbus usando una pinza colibri. Trasferire la sospensione cellulare in una capsula di Petri.
  10. Ripetere i passaggi 1.8 e 1.9 e raccogliere tutte le cellule nella capsula di Petri. Risospendere attentamente la sospensione della cella mediante pipettaggio su e giù utilizzando una pipetta a canale singolo (100-1.000 μL).
  11. Seminare la sospensione cellulare RPE di ciascun globo oculare in tre pozzetti di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti e riempirli fino a 1 ml con DMEM / F12 integrato con FBS, Pen / Strep e AmphoB.
  12. Mantenere le colture cellulari RPE a 37 °C in atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di CO2 fino al raggiungimento della confluenza. Cambiare il terreno di coltura cellulare due volte a settimana.

2. Elettroporazione di cellule RPE umane primarie

  1. Preparazione della miscela di plasmidi SB100X trasposasi/PEDF trasposone
    1. Purificare il DNA plasmidico della trasposasi SB100X e del trasposone PEDF utilizzando i consueti kit di purificazione del plasmide, che sono identificati per essere adatti all'uso in applicazioni come la trasfezione, secondo il protocollo del produttore.
    2. Quantificare il contenuto di DNA plasmidico utilizzando uno spettrofotometro a microvolume e regolarlo a una concentrazione di 250 ng/μL con 10 mM Tris-HCl (pH 8,5).
    3. Mescolare una porzione di DNA plasmidico trasposasi SB100X da 250 ng/μL (ad esempio, 2,5 μL) con 16 porzioni di DNA plasmidico trasposone PEDF da 250 ng/μL (ad es. 40 μL). La miscela plasmidica residua può essere conservata a -20 °C.
      NOTA: devono essere evitati cicli multipli di congelamento e scongelamento ripetuti della miscela plasmidica.
    4. Introdurre 2 μL della miscela di plasmidi trasposasi/trasposone SB100X, contenente 29,4 ng di plasmide trasposasi SB100X e 470,6 ng di plasmide trasposone PEDF, in una provetta da microcentrifuga sterile da 1,5 mL con blocco sicuro. Conservare in ghiaccio fino a quando non si mescola con le cellule.
  2. Messa a punto del sistema di trasfezione capillare
    NOTA: L'elettroporazione delle cellule RPE umane primarie è stata eseguita tramite un sistema di trasfezione capillare utilizzando il kit da 10 μL secondo il protocollo del produttore. Il sistema comprende il dispositivo di trasfezione, la pipetta di trasfezione e la stazione di pipetta. Il kit contiene punte di trasfezione da 10 μL, tubi tampone, tampone elettrolitico E (tampone E) e tampone di risospensione R (tampone R).
    1. Collegare la stazione di pipetta al dispositivo di trasfezione.
    2. Riempire un tubo tampone con 3 mL di tampone E e inserirlo nella stazione di pipette fino a quando non si sente un clic.
      NOTA: Assicurarsi che l'elettrodo laterale del tubo tampone sia collegato allo stantuffo a sfera laterale della stazione di pipetta.
    3. Per l'elettroporazione delle celle RPE umane primarie, impostare le seguenti condizioni di impulso sul dispositivo di trasfezione: 1.100 V (tensione di impulso), 20 ms (larghezza dell'impulso), due impulsi (numero di impulso).
  3. Preparazione delle cellule RPE umane primarie coltivate
    1. Documentare la forma e la morfologia delle colture cellulari RPE primarie tramite microscopia a contrasto di fase. Prendi micrografie a basso ingrandimento per dimostrare la crescita delle celle RPE in un monostrato confluente e integrato, nonché micrografie a ingrandimento più elevato per evidenziare la tipica morfologia del ciottolo delle celle RPE.
    2. Aspirare il terreno di coltura cellulare e lavare le cellule due volte con 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS, pH 7,4).
    3. Tripsinizzare le cellule RPE umane primarie con 0,5 mL 0,05% di tripsina-EDTA a 37 °C in atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di CO2 per 7-15 minuti (massimo). Controllare il distacco della cellula al microscopio.
    4. Interrompere la tripsinizzazione con 1 mL di DMEM/F12 integrato con FBS. Prendere un'aliquota di 20 μL per il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare la sospensione della cella RPE a 106 x g per 10 minuti.
    5. Mescolare l'aliquota da 20 μL con una soluzione di blu tripano da 20 μL. Pipettare 10 μL in ciascuna metà dell'emocitometro e contare le cellule al microscopio a contrasto di fase.
    6. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet della cella RPE in 1 mL di PBS.
    7. Prelevare 10.000-100.000 cellule RPE per reazione di trasfezione e centrifugarle a 106 x g per 10 minuti.
      NOTA: Oltre alle reazioni di trasfezione con applicazione di campo elettrico e aggiunta di DNA plasmide, ogni approccio include anche due diverse colture di controllo: (1) senza applicazione di campo elettrico e senza DNA plasmide; (2) con applicazione di campo elettrico, ma senza DNA plasmide.
    8. Risospendere il pellet cellulare in 11 μL di tampone R e combinarlo con 2 μL della miscela di plasmide SB100X trasposasi/PEDF (vedere punto 2.1.4).
      NOTA: Dopo la risospensione nel tampone R, le cellule devono essere elaborate entro 15 minuti per evitare una riduzione della vitalità cellulare e dell'efficienza di trasfezione.
    9. Inserire la testa della pipetta di trasfezione nella punta di trasfezione da 10 μL fino a quando il morsetto non raccoglie completamente lo stelo di montaggio del pistone. Aspirare la soluzione cellulare/plasmidica nella punta di trasfezione.
      NOTA: Evitare la generazione di bolle d'aria e la loro aspirazione nella punta di trasfezione.
    10. Fornire 1 mL di DMEM/F12 integrato con FBS, ma senza Pen/Strep e senza AmphoB, nel numero richiesto di pozzetti di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti.
  4. Processo di elettroporazione
    1. Inserire la pipetta di trasfezione nel tubo tampone posto nella stazione della pipetta (vedere punto 2.2.2) fino a quando non si sente un clic.
      NOTA: Assicurarsi che la testa metallica della pipetta a trasfezione sia collegata allo stantuffo a sfera all'interno della stazione di pipetta e al tubo tampone.
    2. Premere Start sul touchscreen del dispositivo di trasfezione. Prima dell'applicazione dell'impulso elettrico, il dispositivo controlla automaticamente se il tubo tampone e la pipetta di trasfezione sono inseriti correttamente. Dopo l'erogazione degli impulsi elettrici, Complete viene visualizzato sul touchscreen.
    3. Rimuovere con cautela la pipetta di trasfezione dalla stazione di pipetta e rilasciare immediatamente le cellule elettroporate dalla punta di trasfezione da 10 μL pipettando la soluzione cellulare/plasmidica nei pozzetti preparati della piastra di coltura cellulare (vedere punto 2.3.10).
    4. Mantenere le colture cellulari RPE trasfettate a 37 °C in atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di CO2. Aggiungere Pen/Strep e AmphoB con il primo mezzo di scambio 3 giorni dopo l'elettroporazione.

3. Analisi di cellule RPE umane primarie trasfettate

  1. Preparazione del campione
    1. Dopo un tempo di coltivazione di 3 settimane, infine incubare le colture cellulari RPE in un volume definito di 1,0 mL DMEM / F12 integrato con FBS, Pen / Strep e AmphoB per un tempo definito di 24 ore.
    2. Prelevare i surnatanti di coltura cellulare e conservarli a -20 °C fino a un'ulteriore elaborazione o a -80 °C per campioni termicamente instabili e conservazione a lungo termine.
    3. Tripsinizzare colture cellulari RPE trasfettate con 0,5 ml di tripsina-EDTA allo 0,05% a 37 °C in atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di CO2 per 10 min.
    4. Interrompere la tripsinizzazione con 1 mL di DMEM/F12 integrato con FBS. Prendere piccole aliquote per il conteggio delle cellule usando un emocitometro (vedi punto 2.3.5). Centrifugare le sospensioni delle celle RPE a 106 x g per 10 min.
    5. Conservare i pellet della cella RPE a -80 °C fino a ulteriore lavorazione.
  2. Valutazione della secrezione di PEDF mediante western blotting
    NOTA: Per una valutazione qualitativa, i surnatanti di coltura cellulare (vedere il punto 3.1.2) vengono analizzati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato poliacrilammide (SDS-PAGE) e successiva western blotting. A seconda del PEDF plasmide del DNA trasposone utilizzato, i surnatanti devono essere elaborati in modo diverso.
    1. Purificazione di proteine di fusione PEDF marcate con His-da supernatanti di coltura cellulare
      1. Prelevare 30 μL di liquame di acido nichel-nitrilotriacetico (Ni-NTA) per campione utilizzando una punta smussata e pellettare la resina Ni-NTA mediante centrifugazione (2.660 x g per 30 s).
      2. Risospendere con cautela la resina Ni-NTA con 200 μL di tampone di incubazione 1x (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo, pH 8,0) e pellettarla mediante centrifugazione (2.660 x g per 30 s).
      3. Ripetere il passaggio precedente.
      4. Risospendere accuratamente la resina Ni-NTA con 40 μL 4x tampone di incubazione (200 mM NaH 2 PO4,1,2M NaCl, 40 mM imidazolo, pH 8,0) per campione.
      5. Miscelare 900 μL di coltura cellulare surnatante con 260 μL di tampone di incubazione 4x e 55 μL di liquame Ni-NTA pretrattato (cfr. punto 3.2.1.4).
      6. Incubare la miscela su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente per 60 minuti.
      7. Pellettare la resina Ni-NTA per centrifugazione (2660 x g per 60 s).
      8. Risospendere accuratamente la resina Ni-NTA con 175 μL di tampone di incubazione 1x e resina pellet mediante centrifugazione (2.660 x g per 60 s).
      9. Ripetere il passaggio precedente.
      10. Risospendere accuratamente la resina Ni-NTA con 30 μL di tampone di eluizione (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo, pH 8,0) e incubare la miscela su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente per 20 minuti.
      11. Pellettare la resina Ni-NTA mediante centrifugazione (2.660 x g per 30 s).
      12. Prendere con cautela il surnatante e mescolarlo con 2x SDS sample buffer47.
      13. Riscaldare la miscela a 95 °C per 5 minuti e separare le proteine purificate Ni-NTA su un gel di poliacrilammide SDS al 10%.
      14. Eseguire western blotting utilizzando anticorpi anti-Penta-His (monoclonale di topo, 1:500) e anticorpi anti-topo coniugati con perossidasi di rafano (HRP) (policlonale di coniglio, 1:1.000) come descritto in precedenza36,37.
    2. Analisi diretta di proteine PEDF non marcate
      1. Prelevare 15 μL di coltura cellulare surnatante e mescolarla con 2x SDS sample buffer47.
      2. Riscaldare la miscela a 95 °C per 5 minuti e separare le proteine su un gel di poliacrilammide SDS al 10%.
      3. Eseguire western blotting utilizzando anticorpi PEDF anti-umani (policlonale di coniglio, 1:4.000) e anticorpi anti-coniglio coniugati con HRP (policlonale di capra, 1:2.000) come descritto in precedenza38.
    3. Quantificazione della secrezione di PEDF mediante ELISA
      1. Analizzare i surnatanti di coltura cellulare (vedere il punto 3.1.2) utilizzando un kit ELISA PEDF umano secondo il protocollo del produttore.
      2. Mettere in relazione la quantità di PEDF secreta con il tempo e il numero di cellule determinato per ciascuna reazione di trasfezione (vedere punto 3.1.4).
    4. Analisi dell'espressione genica PEDF in cellule RPE trasfettate
      1. Isolare l'RNA totale dai pellet delle cellule RPE (vedere il punto 3.1.5) utilizzando un kit disponibile in commercio secondo il protocollo del produttore.
      2. Quantificare il contenuto di RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
      3. Effettuare la trascrizione inversa su 0,1 μg di RNA utilizzando un sistema di trascrizione inversa secondo il protocollo del produttore.
      4. Eseguire qPCR in tempo reale come descritto in precedenza38.
    5. Analisi dei siti di inserzione del transgene in cellule RPE trasfettate
      1. Isolare il DNA genomico dai pellet cellulari RPE (vedere il punto 3.1.5) utilizzando un kit disponibile in commercio secondo il protocollo del produttore.
      2. Quantificare il contenuto di DNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
      3. Generare librerie di siti di inserimento utilizzando uno schema di PCR emi-specifico assistito dal calcolo come descritto in precedenza38.
      4. Eseguire analisi computazionali come descritto in precedenza38.

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Risultati

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Coltivazione ed elettroporazione di cellule RPE umane primarie
Abbiamo dimostrato che la semina di un numero sufficiente di cellule RPE primarie di origine animale consente la coltivazione e la crescita in un monostrato integrato di cellule pigmentate di forma esagonale36,37,48. La loro capacità di formare giunzioni strette, di esibire attività fagocitaria e di esprimere geni ...

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Discussione

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Nel nostro progetto, miriamo alla produzione non virale di cellule RPE umane primarie geneticamente modificate che sovraesprimono continuamente e secernono un fattore efficace al fine di utilizzare le cellule trasfettate come terapia a lungo termine per la creazione e il mantenimento di un ambiente protettivo. Abbiamo stabilito l'introduzione del gene che codifica per il PEDF, una proteina multifunzionale ubiquitariamente espressa con funzioni anti-angiogeniche e neuroprotettive. Il protocollo qui descritto può essere ut...

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Dichiarazioni

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Zoltán Ivics e Zsuzsanna Izsvák sono inventori di diversi brevetti sulla tecnologia di trasposone SB

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Settimo programma quadro dell'Unione europea per la ricerca, lo sviluppo tecnologico e la dimostrazione, convenzione di sovvenzione n. 305134. Zsuzsanna Izsvák è stata finanziata dal Consiglio europeo della ricerca, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Gli autori desiderano ringraziare Anna Dobias e Antje Schiefer (Dipartimento di Oftalmologia, Ospedale universitario RWTH Aachen) per l'eccellente supporto tecnico e la Banca della cornea di Aquisgrana (Dipartimento di Oftalmologia, Ospedale universitario RWTH Aachen) per aver fornito gli occhi del donatore umano.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Isolamento di cellule RPE umane primarie
24-Well Cell Culture PlateEppendorf, Amburgo, Germania0030722019
Amfotericina B [250 &; g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, GermaniaA2942
Colibri ForcipeGeuder, Heidelberg, GermaniaG-18950
Pinze a iride curve Geuder, Heidelberg, GermaniaG-18856
Bisturi monouso (n. 11)Feather, Osaka, Giappone
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio/Prosciutto' s Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, GermaniaP04-41150
Forbice per occhi appuntiti extra fini Geuder, Heidelberg, GermaniaG-19405
Siero fetale bovino [0,2 &; m Sterile Filtrato] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, GermaniaP40-37500
Pipette in vetro Pasteur Pipette,Wertheim, Germania747715
Penicillina [10.000 unità/mL] e Streptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, GermaniaP0781
Puntali per pipette (1000 & micro; L)Starlab, Amburgo, Germania
Pipetta a canale singolo (100-1000 &; micro; L)Eppendorf, Amburgo, Germania
Telo sterileLohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germania
Impacco di garza sterile Fink-Walter, Merchweiler, Germania321063
Guanti steriliSempermed, Wien, Austria
Piastra di Petri sterile (Falcon 60 mm x 15 mm)Corning, Corning, NY351007
Camice chirurgico sterileHalyard Health, Alpharetta, GA
Pinze a iride diritte Geuder, Heidelberg, GermaniaG-18855
Elettroporazione di cellule RPE umane primarie
10 mM Tris-HCl (pH 8,5)Piastra
colture cellulari a 12 pozzettiThermo Fisher Scientific, Waltham, MA150628
Piastra per colture cellulari a 24 pozzettiEppendorf, Amburgo, Germania
Amfotericina B [250 &5; g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, GermaniaA2942
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio/Prosciutto' s Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, GermaniaP04-41150
Provette per microcentrifuga Safe-Lock (1,5 mL)Eppendorf, Amburgo, Germania
Siero fetale bovino [0,2 &; m Sterile Filtrato] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, GermaniaP40-37500
Microscopio invertitoLeica Mikrosysteme, Wetzlar, GermaniaLeica DMi8
Spettrofotometro per microvolumi (spettrofotometro NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Sistema di trasfezione capillare (sistema di trasfezione al neon)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Sistema di trasfezione al neon 10 µ L KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK1096
Emocitometro (Camera Neubauer)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Germania0640110
PBS Dulbecco senza Ca2+ senza Mg2+Biochrom, Berlino, GermaniaL182-50
Penicillina [10.000 unità/mL] e streptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, GermaniaP0781
Puntali per pipette (10 &; L)Starlab, Amburgo, Germania
Puntali per pipette (1000 &; micro; L)Starlab, Amburgo, Germania
Puntali per pipette (200 &; micro; L)Starlab, Amburgo, Germania
Maxi Kit di plasmidiQiagen, Hilden, Germania12163
Pipetta a canale singolo (0,1-10 &; L)Eppendorf, Amburgo, Germania
Pipetta monocanale (100-1000 &; micro; L)Eppendorf, Amburgo, Germania
Pipetta monocanale (10-200 &; micro; L)Eppendorf, Amburgo, Germania
Soluzione di blu di tripanoMerck, Darmstadt, GermaniaT8154
Tripsina-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
Analisi di cellule RPE umane primarie trasfettate
10% SDS-Geldi poliacrilammide
1x tampone di incubazione (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo, pH 8.0)
2x tampone
4x tampone di incubazione (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM di imidazolo, pH 8,0)
Amersham Protran supportato 0,2 µ m  Membrana di tamponamento della nitrocellulosaCytiva, Marlborough, MA10600015
Amfotericina B [250 &; g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, GermaniaA2942
Anticorpi anti-PEDF (policlonali di coniglio)BioProducts, Middletown, MDAB-PEDF1
Anticorpi anti-Penta-His (monoclonali di topo)Qiagen, Hilden, Germania34660
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio/Prosciutto' s Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, GermaniaP04-41150
Tampone di eluizione (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo, pH 8.0) 
Siero fetale bovino [0,2 & micro; m Sterile Filtrato] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, GermaniaEmocitometro P40-37500
(Camera Neubauer)Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Germania0640110
Anticorpi anti-topo coniugati con perossidasi di rafano (policlonale di coniglio)Agilent Dako, Santa Clara, CAP0260
Anticorpi anti-coniglio coniugati con perossidasi di rafano (policlonale di capra)Abcam, Cambridge, Regno Unitoab6721
Kit ELISA PEDF umano BioProducts, Middletown, MDPED613
LAS-3000 Sistema di imagingFujifilm, Minato, Giappone
LightCycler 1.2 StrumentoRoche Life Science, Penzberg, Germania
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green IRoche Life Science, Penzberg, Germania12239264001
LightCycler  Capillari (20 μ l)Roche Life Science, Penzberg, Germania4929292001
Spettrofotometro per microvolumi (spettrofotometro NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN  Modulo di colata Tetra CellBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germania1658015
Mini-PROTEAN  Cella di elettroforesi verticale Tetra per mini gel prefabbricati, 4 gelBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germania1658004
Ni-NTA SuperflowQiagen, Hilden, Germania30410
PageRuler Scala di proteine predefiniteThermo Fisher Scientific, Waltham, MA26616
Penicillina [10.000 unità/mL] e streptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, GermaniaP0781
Puntali per pipette (10 & micro; L)Starlab, Amburgo, Germania
Puntali per pipette (1000 &; micro; L)Starlab, Amburgo, Germania
Puntali per pipette (200 &; micro; L)Starlab, Amburgo, Germania
Alimentatore di base PowerPacBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germania1645050
Mini kit QIAamp DNAQiagen, Hilden, Germania51304
Sistema di trascrizione inversaPromega, Madison, WIA3500
Set di DNasi senza RNasiQiagen, Hilden, Germania79254
Mini kit RNeasy Qiagen, Hilden, Germania74104
Agitatore a dondoloCole-Parmer, Staffordshire, Regno UnitoProvette per microcentrifuga SSM3
Safe-Lock (1,5 mL)Eppendorf, Amburgo, Germania
Provette per microcentrifuga Safe-Lock (2,0 mL)Eppendorf, Amburgo, Germania
Pipetta a canale singolo (0,1-10 µ L)Eppendorf, Amburgo, Germania
Pipetta monocanale (100-1000 &; micro; L)Eppendorf, Amburgo, Germania
Pipetta monocanale (10-200 &; micro; L)Eppendorf, Amburgo, Germania
Sistema di trasferimento turbo Trans-BlotBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germania1704150
Soluzione di blu di tripanoMerck, Darmstadt, GermaniaT8154
Tripsina-EDTA (0,05%)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
per 0030722019MPK5000campione SDS

Riferimenti

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