Modificazione genetica basata sull'elettroporazione delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie utilizzando il sistema di trasposone della bella addormentata nel bosco

Summary

Abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare le cellule epiteliali pigmentate umane primarie mediante elettroporazione con il gene che codifica il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Il successo della trasfezione è stato dimostrato mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), immunoblotting e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

Abstract

La nostra società sempre più anziana porta a una crescente incidenza di malattie neurodegenerative. Finora, i meccanismi patologici non sono adeguatamente compresi, impedendo così l'istituzione di trattamenti definiti. Le terapie geniche additive basate sulle cellule per l'aumentata espressione di un fattore protettivo sono considerate un'opzione promettente per medicare le malattie neurodegenerative, come la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Abbiamo sviluppato un metodo per l'espressione stabile del gene che codifica per il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF), che è caratterizzato come una proteina neuroprotettiva e anti-angiogenica nel sistema nervoso, nel genoma delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie (PE) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Le cellule PE primarie sono state isolate dagli occhi dei donatori umani e mantenute in coltura. Dopo aver raggiunto la confluenza, 1 x 10⁴ cellule sono state sospese in 11 μL di tampone di risospensione e combinate con 2 μL di una soluzione purificata contenente 30 ng di plasmide iperattivo SB (SB100X) trasposasi e 470 ng di plasmide trasposone PEDF . La modificazione genetica è stata effettuata con un sistema di elettroporazione capillare utilizzando i seguenti parametri: due impulsi con una tensione di 1.100 V e una larghezza di 20 ms. Le cellule trasfettate sono state trasferite in piastre di coltura contenenti terreno integrato con siero fetale bovino; Antibiotici e antimicotici sono stati aggiunti con il primo scambio di mezzo. La trasfezione di successo è stata dimostrata in esperimenti eseguiti in modo indipendente. La reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) ha mostrato l'aumentata espressione del transgene PEDF . La secrezione di PEDF era significativamente elevata e rimaneva stabile, come valutato mediante immunoblotting e quantificato mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Il trasferimento mediato da SB100X ha permesso un'integrazione stabile del gene PEDF nel genoma delle cellule PE e ha assicurato la secrezione continua di PEDF, che è fondamentale per lo sviluppo di una terapia di aggiunta genica basata su cellule per il trattamento di AMD o altre malattie degenerative della retina. Inoltre, l'analisi del profilo di integrazione del trasposone PEDF in cellule PE umane ha indicato una distribuzione genomica quasi casuale.

Introduction

L'età avanzata è descritta come il principale rischio di malattie neurodegenerative. La degenerazione maculare legata all'età (AMD), una malattia poligenica che porta a una grave perdita della vista nei pazienti di età superiore ai 60 anni, appartiene alle quattro cause più comuni di cecità e compromissione della vista¹ e si prevede che aumenterà a 288 milioni di persone nel 2040². Le disfunzioni dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), un singolo strato di cellule strettamente impacchettate situate tra il coriocapillare e i fotorecettori retinici, contribuiscono alla patogenesi dell'AMD. L'RPE svolge molteplici compiti ....

Protocol

Gli occhi dei donatori umani sono stati ottenuti dalla Banca della cornea di Aquisgrana del Dipartimento di Oftalmologia (Ospedale universitario RWTH di Aquisgrana) dopo aver ottenuto il consenso informato in conformità con i protocolli della Dichiarazione di Helsinki. Le procedure per la raccolta e l'uso di campioni umani sono state approvate dal comitato etico istituzionale.

1. Isolamento di cellule RPE umane primarie

1. Stendere indumenti protettivi sterili e guanti. Posizionare un drappo sterile sotto un flusso laminare.
2. Posizionare gli strumenti sterili di preparazione e altre attrezzature sterili necessarie sotto il f....

Results

Coltivazione ed elettroporazione di cellule RPE umane primarie
Abbiamo dimostrato che la semina di un numero sufficiente di cellule RPE primarie di origine animale consente la coltivazione e la crescita in un monostrato integrato di cellule pigmentate di forma esagonale^36,37,48. La loro capacità di formare giunzioni strette, di esibire attività fagocitaria e di esprimere geni .......

Discussion

Nel nostro progetto, miriamo alla produzione non virale di cellule RPE umane primarie geneticamente modificate che sovraesprimono continuamente e secernono un fattore efficace al fine di utilizzare le cellule trasfettate come terapia a lungo termine per la creazione e il mantenimento di un ambiente protettivo. Abbiamo stabilito l'introduzione del gene che codifica per il PEDF, una proteina multifunzionale ubiquitariamente espressa con funzioni anti-angiogeniche e neuroprotettive. Il protocollo qui descritto può essere ut.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolamento di cellule RPE umane primarie
24-Well Cell Culture Plate	Eppendorf, Amburgo, Germania	0030722019
Amfotericina B [250 &; g/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germania	A2942
Colibri Forcipe	Geuder, Heidelberg, Germania	G-18950
Pinze a iride curve	Geuder, Heidelberg, Germania	G-18856
Bisturi monouso (n. 11)	Feather, Osaka, Giappone
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio/Prosciutto' s Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germania	P04-41150
Forbice per occhi appuntiti extra fini	Geuder, Heidelberg, Germania	G-19405
Siero fetale bovino [0,2 &; m Sterile Filtrato] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germania	P40-37500
Pipette in vetro Pasteur Pipette,	Wertheim, Germania	747715
Penicillina [10.000 unità/mL] e Streptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germania	P0781
Puntali per pipette (1000 & micro; L)	Starlab, Amburgo, Germania
Pipetta a canale singolo (100-1000 &; micro; L)	Eppendorf, Amburgo, Germania
Telo sterile	Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germania
Impacco di garza sterile	Fink-Walter, Merchweiler, Germania	321063
Guanti sterili	Sempermed, Wien, Austria
Piastra di Petri sterile (Falcon 60 mm x 15 mm)	Corning, Corning, NY	351007
Camice chirurgico sterile	Halyard Health, Alpharetta, GA
Pinze a iride diritte	Geuder, Heidelberg, Germania	G-18855
Elettroporazione di cellule RPE umane primarie
10 mM Tris-HCl (pH 8,5)Piastra
colture cellulari a 12 pozzetti	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	150628
Piastra per colture cellulari a 24 pozzetti	Eppendorf, Amburgo, Germania
Amfotericina B [250 &5; g/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germania	A2942
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio/Prosciutto' s Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germania	P04-41150
Provette per microcentrifuga Safe-Lock (1,5 mL)	Eppendorf, Amburgo, Germania
Siero fetale bovino [0,2 &; m Sterile Filtrato] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germania	P40-37500
Microscopio invertito	Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germania	Leica DMi8
Spettrofotometro per microvolumi (spettrofotometro NanoDrop)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Sistema di trasfezione capillare (sistema di trasfezione al neon)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Sistema di trasfezione al neon 10 µ L Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MPK1096
Emocitometro (Camera Neubauer)	Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Germania	0640110
PBS Dulbecco senza Ca2+ senza Mg2+	Biochrom, Berlino, Germania	L182-50
Penicillina [10.000 unità/mL] e streptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germania	P0781
Puntali per pipette (10 &; L)	Starlab, Amburgo, Germania
Puntali per pipette (1000 &; micro; L)	Starlab, Amburgo, Germania
Puntali per pipette (200 &; micro; L)	Starlab, Amburgo, Germania
Maxi Kit di plasmidi	Qiagen, Hilden, Germania	12163
Pipetta a canale singolo (0,1-10 &; L)	Eppendorf, Amburgo, Germania
Pipetta monocanale (100-1000 &; micro; L)	Eppendorf, Amburgo, Germania
Pipetta monocanale (10-200 &; micro; L)	Eppendorf, Amburgo, Germania
Soluzione di blu di tripano	Merck, Darmstadt, Germania	T8154
Tripsina-EDTA (0,05 %)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054
Analisi di cellule RPE umane primarie trasfettate
10% SDS-Gel	di poliacrilammide
1x tampone di incubazione (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo, pH 8.0)
2x tampone
4x tampone di incubazione (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM di imidazolo, pH 8,0)
Amersham Protran supportato 0,2 µ m  Membrana di tamponamento della nitrocellulosa	Cytiva, Marlborough, MA	10600015
Amfotericina B [250 &; g/mL] (AmphoB)	Merck, Darmstadt, Germania	A2942
Anticorpi anti-PEDF (policlonali di coniglio)	BioProducts, Middletown, MD	AB-PEDF1
Anticorpi anti-Penta-His (monoclonali di topo)	Qiagen, Hilden, Germania	34660
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio/Prosciutto' s Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germania	P04-41150
Tampone di eluizione (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo, pH 8.0)
Siero fetale bovino [0,2 & micro; m Sterile Filtrato] (FBS)	PAN-Biotech, Aidenbach, Germania	Emocitometro P40-37500
(Camera Neubauer)	Paul Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Germania	0640110
Anticorpi anti-topo coniugati con perossidasi di rafano (policlonale di coniglio)	Agilent Dako, Santa Clara, CA	P0260
Anticorpi anti-coniglio coniugati con perossidasi di rafano (policlonale di capra)	Abcam, Cambridge, Regno Unito	ab6721
Kit ELISA PEDF umano	BioProducts, Middletown, MD	PED613
LAS-3000 Sistema di imaging	Fujifilm, Minato, Giappone
LightCycler 1.2 Strumento	Roche Life Science, Penzberg, Germania
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I	Roche Life Science, Penzberg, Germania	12239264001
LightCycler  Capillari (20 μ l)	Roche Life Science, Penzberg, Germania	4929292001
Spettrofotometro per microvolumi (spettrofotometro NanoDrop)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN  Modulo di colata Tetra Cell	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germania	1658015
Mini-PROTEAN  Cella di elettroforesi verticale Tetra per mini gel prefabbricati, 4 gel	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germania	1658004
Ni-NTA Superflow	Qiagen, Hilden, Germania	30410
PageRuler Scala di proteine predefinite	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	26616
Penicillina [10.000 unità/mL] e streptomicina [10 mg/mL] (Pen/Strep)	Merck, Darmstadt, Germania	P0781
Puntali per pipette (10 & micro; L)	Starlab, Amburgo, Germania
Puntali per pipette (1000 &; micro; L)	Starlab, Amburgo, Germania
Puntali per pipette (200 &; micro; L)	Starlab, Amburgo, Germania
Alimentatore di base PowerPac	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germania	1645050
Mini kit QIAamp DNA	Qiagen, Hilden, Germania	51304
Sistema di trascrizione inversa	Promega, Madison, WI	A3500
Set di DNasi senza RNasi	Qiagen, Hilden, Germania	79254
Mini kit RNeasy	Qiagen, Hilden, Germania	74104
Agitatore a dondolo	Cole-Parmer, Staffordshire, Regno Unito	Provette per microcentrifuga SSM3
Safe-Lock (1,5 mL)	Eppendorf, Amburgo, Germania
Provette per microcentrifuga Safe-Lock (2,0 mL)	Eppendorf, Amburgo, Germania
Pipetta a canale singolo (0,1-10 µ L)	Eppendorf, Amburgo, Germania
Pipetta monocanale (100-1000 &; micro; L)	Eppendorf, Amburgo, Germania
Pipetta monocanale (10-200 &; micro; L)	Eppendorf, Amburgo, Germania
Sistema di trasferimento turbo Trans-Blot	Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germania	1704150
Soluzione di blu di tripano	Merck, Darmstadt, Germania	T8154
Tripsina-EDTA (0,05%)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	25300054