Semina cellulare graduale su impalcature tassellate per studiare i vasi sanguigni germogliati

Sommario

I tessuti ingegnerizzati si affidano fortemente a reti vascolari adeguate per fornire nutrienti e gas vitali e rimuovere i rifiuti metabolici. In questo lavoro, un protocollo di semina graduale di cellule endoteliali e cellule di supporto crea reti vascolari altamente organizzate in una piattaforma ad alta produttività per lo studio dello sviluppo del comportamento dei vasi in un ambiente 3D controllato.

Abstract

Il sistema cardiovascolare è un attore chiave nella fisiologia umana, fornendo nutrimento alla maggior parte dei tessuti del corpo; i vasi sono presenti in diverse dimensioni, strutture, fenotipi e prestazioni a seconda di ogni tessuto perfuso specifico. Il campo dell'ingegneria tissutale, che mira a riparare o sostituire i tessuti corporei danneggiati o mancanti, si basa sull'angiogenesi controllata per creare una corretta vascolarizzazione all'interno dei tessuti ingegnerizzati. Senza un sistema vascolare, i costrutti ingegnerizzati spessi non possono essere sufficientemente nutriti, il che può causare morte cellulare, scarso innesto e, in ultima analisi, fallimento. Pertanto, comprendere e controllare il comportamento dei vasi sanguigni ingegnerizzati è una sfida eccezionale sul campo. Questo lavoro presenta un sistema ad alta produttività che consente la creazione di reti di navi organizzate e ripetibili per lo studio del comportamento della nave in un ambiente di impalcature 3D. Questo protocollo di semina in due fase mostra che i vasi all'interno del sistema reagiscono alla topografia dell'impalcatura, presentando comportamenti di germogliatura distintivi a seconda della geometria del compartimento in cui risiedono i vasi. I risultati ottenuti e la comprensione da questo sistema ad alta produttività possono essere applicati al fine di informare meglio i progetti di costrutti di impalcature biostampate 3D, in cui la fabbricazione di varie geometrie 3D non può essere rapidamente valutata quando si utilizza la stampa 3D come base per ambienti biologici cellularizzati. Inoltre, la comprensione da questo sistema ad alta produttività può essere utilizzata per il miglioramento dello screening rapido dei farmaci, il rapido sviluppo di modelli di co-colture e lo studio di stimoli meccanici sulla formazione dei vasi sanguigni per approfondire la conoscenza del sistema vascolare.

Introduzione

Il campo dell'ingegneria tissutale sta rapidamente progredendo verso la fabbricazione di costrutti ingegnerizzati per sostituire organi e tessuti mancanti o^{danneggiati 1}. Tuttavia, i costrutti pienamente funzionali devono ancora essere raggiunti, in parte, poiché generare reti vascolari operative per il nutrimento dei tessuti rimane una sfida eccezionale. Senza un'adeguata vascolarizzazione, i tessuti ingegnerizzati sono limitati a un trasporto passivo di diffusione di ossigeno e sostanze nutritive, vincolando lo spessore massimo vitale del tessuto al limite di diffusione, circa 200 μm². Tali spessori non sono adatti a riparare grandi difetti tissutali o per la fabbricazione completa di organi, il che rende la presenza di rete vascolare funzionale una caratteristica obbligatoria per i tessuti funzionali e impiantabili³.

Il sistema vascolare è composto da un'ampia varietà di vasi sanguigni, con diverse dimensioni, fenotipi e organizzazione, strettamente correlati al tessuto ospite. Comprendere il comportamento, la risposta e le decisioni di migrazione prese dai vasi in via di sviluppo e germogliazione può istruire la loro integrazione nei tessuti^{ingegnerizzati 4}. Attualmente, l'approccio più comune per la creazione di reti vascolari in vitro è la combinazione di cellule endoteliali (EC) con cellule di supporto (SC, con la capacità di differenziarsi in cellule murali), sementi all'interno di un micro-ambiente tridimensionale. Questo ambiente fornisce segnali chimici e fisici per consentire alle cellule di attaccarsi, proliferare e auto-assemblarsi nelle reti^{di recipienti 2,5,6,7,8}. Quando co-coltivati, i SCs secernono proteine della matrice extracellulare (ECM) fornendo al contempo supporto meccanico agli EC, che formano le strutture tubolari. Inoltre, un'interazione incrociata tra entrambi i tipi di cellule promuove la tubulogenesi, la germogliazione e la migrazione dei vasi, oltre alla maturazione e differenziazione delle SCs in cellule murali ad azione muscolare α lisce (αSMA)⁴. Lo sviluppo della rete di navi è più comunemente studiato in ambienti 3D creati utilizzando idrogel, impalcature polimeriche porose o una loro combinazione. Quest'ultima opzione fornisce allo stesso modo un ambiente adatto alle celle e il supporto meccanico richiesto sia per le celle che per l'ECM⁹.

È stato svolto un grande lavoro per studiare lo sviluppo vascolare, tra cui la co-ristrutturazione delle cellule su idrogel^10,combinazioni idrogel-impalcature^11,12,piattaforme 2D e dispositivi microfluidici¹³. Tuttavia, gli idrogel possono essere facilmente deformati dalle forze esercitate dalle cellule¹⁴, mentre i sistemi 2D e microfluidica non riescono a ricreare un ambiente più vicino alla natura per ottenere una risposta più estrapolabile^15,16. Comprendere come i vasi di formatura reagiscono all'ambiente circostante può fornire informazioni critiche che potrebbero consentire la fabbricazione di ambienti ingegnerizzati con la capacità di guidare lo sviluppo della nave in modo prevedibile. Comprendere i fenomeni di formazione vascolare è particolarmente fondamentale per tenere il passo con la rapida comparsa di tecniche di fabbricazione su scala submicron-a-micron, come stereolitografia, litografia a proiezione digitale, produzione di interfaccia liquida continua, fusione-elettro jetwriting 3D, scrittura elettro getto 3D basata su soluzione e tecniche di biostampa emergenti^{17,18,19,20,21}. Allineare il controllo di queste tecniche di microproduttore con una comprensione approfondita della biologia vascolare è fondamentale per la creazione di una vascolarizzazione ingegnerizzata appropriata per un tessuto bersaglio.

Qui presentiamo un sistema 3D per studiare la risposta dei nuovi vasi di formatura e germogliazione alla geometria circostante dell'impalcatura, osservandone l'origine del germoglio e la successiva^{migrazione 22.} Utilizzando impalcature 3D con geometrie di compartimenti tassellati e una tecnica di semina in due fase, siamo riusciti a creare reti vascolari altamente organizzate in modo chiaro e facile da analizzare. Le geometrie tassellate forniscono un sistema ad alta produttività con singole unità contenenti vasi che rispondono al loro ambiente locale. Utilizzando ec multicolori, abbiamo monitorato le origini di formazione del germoglio e i successivi modelli di migrazione, correlati alla geometria del compartimento e alla posizione dei SCs²².

Sebbene il protocollo proposto sia stato preparato per analizzare gli effetti dei segnali geometrici sul comportamento di vascolarizzazione, questo approccio può essere ampliato e applicato a una varietà di nuove applicazioni. L'impalcatura tassellata e le reti facilmente identificabili consentono l'analisi diretta delle diverse interazioni di ECs e SCs, l'aggiunta di cellule d'organo specifiche e la loro interazione con le reti vascolari, l'effetto farmaco sulle reti vascolari e altro ancora. Il nostro sistema suggerito risulta molto versatile e di semplice fabbricazione e lavorazione.

Protocollo

1. Fabbricazione di impalcature tassellate

NOTA: La fotolitografia è una tecnica diffusa che richiede apparecchiature specializzate tipicamente alloggiate all'interno di un impianto /laboratorio di nanofabbricazione. Il metodo previsto da questo protocollo è stato generalizzato il più possibile per il pubblico; tuttavia, possono essere necessarie lievi modifiche alle procedure a seconda delle attrezzature a disposizione del lettore. Si consiglia di eseguire queste procedure in una stanza pulita presso una struttura di nanofabbricazione per garantire la massima qualità del processo. Prima di iniziare, ottenere l'accesso a un allineatore di maschere (o a qualche set-up di esposizione ai raggi UV), a uno spin coater, a piastre calde, a una stazione di lavaggio con solvente, a una maschera fotografica e a un detergente per plasma. I solventi e le sostanze chimiche utilizzati nella procedura sono pericolosi, quindi si prega di prestare la massima attenzione per evitare qualsiasi esposizione chimica. Quando si progetta la maschera fotografica, identificare quali wafer e fotomaschere in silicio di dimensioni sono compatibili con lo spin-coater e l'allineatore di maschere. Inoltre, il fotoresist situato verso i bordi del wafer di silicio è tipicamente deformato dalla manipolazione; quindi, fare i disegni verso l'area centrale del wafer.

1. Preparare impalcature utilizzando una tecnica di fotolitografia con la geometria di interesse selezionata.
   1. Prima del rivestimento di rotazione, pulire il wafer di silicio. Questo può essere fatto con la pulizia del plasma o una tecnica a base di solvente. Se si pulisce il plasma, seguire la procedura operativa standard dello strumento per i dettagli operativi. Spruzzare con gas azoto compresso e ispezionare il wafer per assicurarsi che sia privo di detriti prima dello spin-coating. Questo wafer fungerà da substrato su cui vengono create le impalcature.
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati inizia con un wafer fresco. I wafer possono essere ri-utilizzati ma dovrebbero essere esistiti da vecchi fotoresist, difetti superficiali e detriti. È utile utilizzare una pinzetta per wafer per la manipolazione.
   2. Centrare un wafer di silicio sul mandrino spin-coater utilizzando una guida. Ruotare brevemente il wafer per assicurarsi che sia stato centrato correttamente sul mandrino, regolare se necessario fino a quando non è centrato correttamente. Questo deve essere fatto ogni volta che un wafer viene posizionato sullo spin-coater. Erogare 1-4 mL del reagente lift-off sul wafer (questo dipenderà dalle dimensioni del wafer). Circa 2 mL di reagente lift-off funzionano bene per un wafer da 4 pollici.
      1. Impostare la velocità di diffusione dello spin-coater a 500 giri/min per 5 secondi e la velocità di rotazione a 1000 giri/min per 30 secondi, quindi ruotare il reagente lift-off. Ispezionare il wafer per assicurarsi che abbia un rivestimento uniforme attraverso il wafer. Eventuali detriti rimasti sul wafer saranno molto evidenti a questo punto. Eventuali impalcature in un'area con detriti saranno probabilmente inutilizzabili. Dopo il rivestimento di rotazione, trasferire su una piastra calda e cuocere per 1 minuto a 200 °C.
   3. Ripetere il passaggio precedente altre due volte per un totale di tre rivestimenti.
   4. Spin-coat il wafer di silicio rivestito di reagente lift-off con fotoresist SU-8 2050 fino ad ottenere uno spessore di circa 100 μm.
      1. Erogare 1 mL di resistenza per ogni 25 mm di diametro del substrato.
         NOTA: Fare attenzione a evitare bolle durante il versamento della resistenza. Per SU-8 2050, versare circa un cerchio di diametro di 2 pollici, quando si utilizza un wafer di silicio da 4 pollici funziona bene.
      2. Spin-coat il SU-8 2050. Stendere ad una velocità di 500 giri/min per 5 secondi, seguita da una velocità di rotazione compresa tra 1700 e 1800 giri/min per ottenere uno spessore di circa 100 μm.
      3. Facoltativo:dopo la filatura, lasciare i wafer rivestiti di spin per de-gas durante la notte su una superficie piana protetta dalla luce prima della pre-cottura. Questo può aiutare a liberare la resistenza da eventuali bolle e consentire ai difetti di livellare.
         NOTA: Lo spessore effettivo della resistenza e le impalcature risultanti possono variare in base all'errore dell'utente e ai parametri dell'apparecchiatura. Pertanto, lo spessore delle impalcature deve essere verificato in un secondo momento, al passaggio 1.6. Modificare di conseguenza le procedure di rivestimento di rotazione per ottenere lo spessore desiderato.
   5. Prima dell'esposizione, pre-cuocere i wafer a 65 °C per 10 minuti e poi 95 °C per 40-50 min. Prima dell'esposizione, testare la superficie della resistenza premendo sul bordo con un paio di pinzette per assicurarsi che non sia più di cattivo gusto / viscoso. È utile estrarre il wafer dalla piastra calda e lasciare raffreddarlo per 0,5-1 minuti prima di valutare la tackiness.
      NOTA: I tempi lenti della rampa di temperatura (riscaldamento e raffreddamento) possono aiutare a prevenire la dedichiarazione delle impalcature.
2. Esporre il fotoresist alla luce UV (350-400 nm) attraverso una maschera fotografica con un'energia di esposizione di 215-240 mJ/cm² per uno spessore di resistenza di 85 - 110 μm. Fare riferimento alle linee guida del produttore di fotoresist per le correlazioni consigliate di spessore energetico dell'esposizione.
   1. Assicurarsi che l'esposizione sia calibrata correttamente in modo tale che l'energia sia verificata. Regolare il tempo di esposizione in base alle esigenze per ottenere l'energia di esposizione desiderata. Inoltre, gli allineatori di maschere possono consentire diverse modalità di esposizione: contatto sottovuoto, contatto duro, contatto morbido e contatto di prossimità (i termini specifici possono variare). In genere, questi avranno un impatto sulla risoluzione e sull'allineamento delle funzionalità. Gli autori in genere usavano una modalità di "contatto rigido".
   2. Per le piccole feature o più livelli, in cui l'allineamento sarà importante, considerare le modalità di esposizione e le procedure di allineamento delle maschere con maggiore attenzione. Assicurarsi di considerare l'altezza della resistenza quando si regola il valore dello spessore. Per informazioni dettagliate sull'operazione, fare riferimento alle procedure operative standard dell'allineatore maschera.
      NOTA: Il design della maschera fotografica determinerà le dimensioni delle impalcature, la geometria del compartimento e il numero di ponteggi ottenuti per lotto. L'uso di una fotomaschera in vetro duro o quarzo produrrà la massima risoluzione; tuttavia, una morbida maschera fotografica a film trasparente polimerica generalmente può essere utilizzata per queste grandi dimensioni di caratteristiche (>10 μm). L'uso di una maschera film-fotomaschera può portare a caratteristiche topografiche lungo l'asse z dei pori dell'impalcatura a causa della risoluzione delle feature più scarsa. Questo potrebbe potenzialmente avere un'influenza sul comportamento delle cellule. Verificare la risoluzione desiderata consultare chiunque produca la maschera fotografica per garantire il consevio della risoluzione desiderata.
3. Cuocere il wafer subito dopo l'esposizione ai raggi UV a 65 °C per 2-5 minuti e poi a 95 °C per 8-10 minuti.
4. Sviluppare le impalcature per rimuovere la resistenza non sviluppata.
   1. Immergere le impalcature utilizzando un basso volume di soluzione per sviluppatori SU-8 per 7-10 minuti per sciogliere qualsiasi resistenza non sviluppata.
   2. Risciacquare con alcol isopropile (IPA).
   3. Wafer secco con azoto compresso.
      NOTA: Fare attenzione durante il passaggio 1.4 a non causare il rilascio prematuro delle impalcature. Per raggiungere questo obiettivo sono necessari bassi volumi di sviluppo e una gestione delicata.
5. Dopo lo sviluppo, cuocere duramente i wafer a 150 °C per 15 minuti.
   NOTA: Dopo la cottura dura, spegnere la piastra calda per consentire ai wafer di raffreddarsi molto lentamente può essere vantaggioso per prevenire la curvatura / arricciatura delle impalcature finali.
6. Facoltativo:dopo la cottura dura e prima del decollo, valutare lo spessore dell'impalcatura poiché le impalcature devono comunque essere delicatamente aderenti alla superficie del wafer. Per questa procedura, il contatto profilometria funziona bene; tuttavia, potrebbe essere utilizzato qualsiasi metodo appropriato.
7. Sollevare le impalcature dal wafer.
   1. Immergere le impalcature nello sviluppatore SU-8 per farle sollevare immediatamente dal wafer. Se le impalcature non si sollevano, spingere delicatamente le impalcature con un paio di pinzette per wafer.
   2. Rimuovere lo sviluppatore in eccesso.
   3. Trasferire le impalcature in un nuovo contenitore e immergersi nell'alcol isopropile. Risciacquare in IPA per un minimo di 6 volte per assicurarsi che tutti gli sviluppatori siano stati rimossi.
8. Asciugare all'aria le impalcature per un minimo di una settimana prima dell'uso.

2. Rivestimento di fibronectina impalcatura

1. Per la disinfezione, immergere le impalcature in etanolo al 70% (v/v) per un minimo di 15 minuti e lavare 2 volte in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) prima dell'uso.
   ATTENZIONE: Le impalcature SU-8 sono fragili e possono rompersi facilmente. La manipolazione è consigliata utilizzando forcep smussati e a punta curva e devono essere maneggiati con la massima cura. Una manipolazione più semplice può essere ottenuta immergendo le impalcature in liquido, per evitare interazioni elettrostatiche tra le impalcature e la superficie.
2. Preparare una diluizione di 50 μg/mL di fibronectina umana nel PBS e coprire le impalcature mediante adsorbimento proteico.
   1. Mescolare 1,5 μL di soluzione di fibronectina (1 mg/mL) con 28,5 μL di PBS per ogni impalcatura da seminare. Preferibilmente, preparare una sola diluizione di fibronectina da utilizzare per tutte le impalcature per evitare errori di pipettaggio.
      1. Per 10 ponteggi, mescolare 15 μL di soluzione di fibronectina in 285 μL di PBS, per un totale di 300 μL di diluizione di fibronectina da 50 μg/mL.
   2. Posizionare le impalcature scarsamente sopra una superficie idrofobica (cioè coltura non tissutale (nonTC) 10 cm piatto) e coprire ogni impalcatura con 30 μL della diluizione di fibronectina preparata nella fase 2.2.1.
      ATTENZIONE: Assicurarsi che nessuna bolla sia intrappolata nei compartimenti delle impalcature. Se sono presenti bolle, possono essere rimosse scuotendo delicatamente l'impalcatura all'interno della goccia o della pipettazione leggera.
   3. Sostituire il coperchio della piastra e posizionare le impalcature coperte di fibronectina in un'incubatrice con 37 °C e umidità al 100% per un minimo di un'ora.
   4. Dopo l'incubazione, sciacquare leggermente le impalcature in PBS per rimuovere i resti di fibronectina. Le impalcature possono essere conservate in PBS a 4 °C per un massimo di una settimana prima dell'uso.

3. Semina di cellule endoteliali

1. Preparare il mezzo EC mescolando il mezzo basale con i suoi componenti corrispondenti del kit medio, tra cui una soluzione antibiotica (Pen/Strep), siero bovino fetale (FBS) e integratori per la crescita delle cellule endoteliali, come indicato dal produttore.
2. Effettuare una sospensione della cellula endoteliale microvascolare adiposa umana (HAMEC) in mezzo CE con una concentrazione di 4 x 10⁶ cellule/mL.
   NOTA: L'imaging in tempo reale può essere eseguito se le cellule endoteliali usate sono precedentemente trasfetate per esprimere una proteina fluorescente o pre-macchiate utilizzando un colorante a membrana citoplasmatica non tossico (ulteriormente indicato come EC etichettato).
3. Utilizzando le forcep, posizionare un'impalcatura rivestita con fibronectina per pozzo su un pozzo di piastra nonTC da 24 po '.
4. Coprire ogni impalcatura con goccioline da 25 μL della sospensione HAMEC. Fai attenzione a non lasciare che la sospensione fluisca lontano dall'impalcatura, poiché può ostacolare l'adesione cellulare.
5. Mettere il coperchio sul piatto e metterlo in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ e 100% di umidità. Lasciare incubare per un minimo di 60 minuti e un massimo di 90 minuti.
   NOTA: Durante l'incubazione, posizionare la piastra su uno shaker orbitale all'interno dell'incubatore migliora l'attacco cellulare sulle pareti dell'impalcatura. Lo shaker orbitale deve essere impostato a non più di 5 giri/min.
6. Dopo l'incubazione, riempire ogni bene con 700 μL di mezzo EC utilizzando una pipetta.
   NOTA: Aspettatevi di vedere gli EC nella parte inferiore del pozzo, poiché alcune delle celle non si attaccano all'impalcatura e cadono attraverso i vuoti dell'impalcatura.
7. Incubare le impalcature endotelializzate fino a quando non si può osservare la confluenza EC usando la microscopia fluorescente sulle pareti dell'impalcatura (quando si utilizzano EC etichettati) o per 3 giorni (quando si utilizzano EC non etichettati), che fornisce abbastanza tempo per ottenere la confluenza EC. Cambia il mezzo a giorni dall'altra.

4. Sostenere la semina cellulare e la co-coltura

1. Preparare il mezzo di cellule staminali della polpa dentale (DPSC) (DPSCm) mescolando 500 mL di mezzo Eagle modificato di Dulbecco a basso glucosio (DMEM a basso glucosio), 57,5 mL di FBS, 5,75 mL di amminoacidi non essenziali (NEAA), 5,75 mL di GlutaMAX e 5,75 mL di soluzione di penicillina-streptomicina-nystatina.
2. Trasferire le impalcature endotelializzate in una nuova piastra nonTC a 24 pozza per scartare i HC attaccati al fondo dei pozzi utilizzando le forcep.
   1. Scartare tutti i supporti dalla piastra corrente utilizzando una pipetta da 1 mL o un'aspirazione sottovuoto. Fare attenzione a non applicare il vuoto direttamente sull'impalcatura.
   2. Posizionare un'impalcatura per pozzo, preferibilmente al centro del pozzo per evitare di correre liquido verso le pareti a causa di effetti di tensione superficiale. Asciugare l'area circostante l'impalcatura con vuoto leggero ma evitare la completa asciugatura dell'impalcatura.
3. Preparare una sospensione DPSC in soluzione pre-gel fibrina.
   1. Diluire le soluzioni di stock di trombina e fibrinogeno con PBS fino ad ottenere una concentrazione finale rispettivamente di 5 U/mL e 15 mg/mL.
   2. Preparare una sospensione 8 x 10⁶ DPSC/mL nella diluizione di trombina da 5 U/mL e distribuire in singoli eppendorf 12,5 μL di detta sospensione per impalcatura da seminare.
   3. Impostare una pipetta da 5-50 μL (o simile) a 12,5 μL e riempirla con la soluzione di fibrinogeno da 15 mg/mL.
   4. Senza rimuovere la punta, impostare la pipetta su 25 μL. Il materiale nella punta dovrebbe alzarsi e lasciare un volume vuoto verso l'apertura della punta.
   5. Premere lentamente il pulsante dello stantuffo fino a quando il liquido non raggiunge l'apertura della punta ma non perde. Tenere lo stantuffo in questa posizione e mettere la punta in uno dei tubi di microcentrifugo contenenti le celle in sospensione trombina, assicurandosi che la punta sia a contatto con il liquido.
      ATTENZIONE: Il collegamento incrociato della fibrina inizierà immediatamente dopo che la trombina e il fibrinogeno entrano in contatto. Il seguente passo dovrebbe essere fatto rapidamente.
   6. Rilasciare delicatamente il pulsante dello stantuffo e disegnare la sospensione cellulare nella punta. Mescolare accuratamente entrambi i materiali, evitando la formazione di bolle.
4. Erogare rapidamente i materiali misti sopra un'impalcatura endoteliale. Ripetere i passaggi precedenti per ogni impalcatura, assicurandosi di cambiare sempre le punte tra gli usi per evitare una formazione imprevista di gel di fibrina all'interno della punta.
5. Sostituire il coperchio della piastra e incubare le impalcature a 37 °C, 5% CO₂ e 100% di umidità per 30 minuti.
6. Dopo l'incubazione, riempire ogni bene con 1 mL di 1:1 DPSC e mezzo EC.
   1. Cultura per 1 settimana, cambiando mezzo a giorni diversi.
   2. Durante la coltura, rimuovere il mezzo dal pozzo e l'immagine dei costrutti utilizzando un microscopio confocale in diversi punti di tempo per studiare lo sviluppo vascolare o qualsiasi altro parametro di interesse.
      NOTA: questo passaggio può essere eseguito solo se l'esperimento viene eseguito utilizzando ec etichettati. Vedi passaggio 6 - NOTA per ulteriori chiarimenti.

5. Colorazione immunofluorescente per marcatori vascolari caratteristici

NOTA: I seguenti passaggi possono essere eseguiti negli stessi pozzi in cui i costrutti sono stati coltivati. È fondamentale assicurarsi sempre che le soluzioni coprano completamente le impalcature. Inoltre, quando possibile, si consiglia di eseguire i passaggi su uno shaker orbitale, anche se non obbligatorio.

1. Al giorno 7, scartare il supporto dai pozzi e sciacquare le impalcature aggiungendo PBS ai pozzi e rimuovendolo usando il vuoto.
2. Fissare le impalcature aggiungendo il 4% di paraformaldeide per 20 minuti. Lavare in PBS 3 volte, 5 minuti per lavaggio.
3. Permeabilizzare le celle fisse utilizzando lo 0,3% di Tritone-X in PBS (v/v) per 15 minuti. Lavare in PBS 3 volte, 5 minuti per lavaggio.
4. Preparare un'albumina di siero bovino al 5% (BSA) in soluzione di blocco PBS (w/v) e coprire le impalcature. Lasciare a temperatura ambiente per 1 ora.
   NOTA: Tutti gli importi della soluzione richiesti dipenderanno dal numero di impalcature da macchiare. Preparare le soluzioni in base alle esigenze mantenendo le concentrazioni dichiarate.
5. Preparare e applicare la soluzione di colorazione degli anticorpi primari .
   1. Diluire l'anticorpo del fattore anti-von Willebrand del coniglio (vWF) 1:150 e l'anticorpo anti-SMA del topo 1:50 in soluzione di blocco fresco.
      NOTA: Possono essere utilizzati altri marcatori di cellule endoteliali, come CD31 o VE-Cadherin.
   2. Coprire le impalcature con la soluzione di anticorpi primari e conservare a 4 °C durante la notte. Lavare in PBS tre volte, 5 minuti per lavaggio.
6. Preparare e applicare la soluzione di colorazione degli anticorpi secondari.
   1. Diluire l'anticorpo Cy3 anti-topo di capra 1:150 e l'anti-coniglio di capra Alexa-Fluor 488 1:400 in PBS.
   2. Coprire le impalcature con la soluzione di anticorpi secondari e incubare per un minimo di 3 ore a temperatura ambiente o a 4 °C durante la notte. Lavare 3 volte in PBS, 5 minuti per lavaggio. Mantenere l'impalcatura macchiata nello 0,3% di PFA in PBS (v/v) per un massimo di un mese.

6. Imaging confocale dell'impalcatura e analisi dello sviluppo dei vasi

NOTA: I seguenti passaggi possono essere eseguiti sulle impalcature fisse e macchiate nel punto di tempo finale scelto o, se sono state utilizzate celle fluorescenti, durante il periodo di coltura cellulare senza la necessità di terminare l'esperimento. Per quest'ultimo, si consiglia di impostare punti di tempo specifici; questo lavoro mostra il giorno 0 (prima della semina dei SCs) e i giorni 1, 3, 5 e 7 dopo la semina dei SCs (Figura 3A).

1. Immagine delle impalcature utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 5X e uno zoom di 0,5 e l'intera gamma z dell'impalcatura. Ciò consentirà di catturare 9 scomparti separati per le geometrie squadrate e circolari, o 8 scomparti completi per la geometria esagonale. Immagine del segnale fluorescente e della luce trasmessa, per ottenere sia la struttura della rete del contenitore che la geometria del compartimento (Figura 3A).
2. Utilizzando ImageJ (o qualsiasi altro software di elaborazione delle immagini), ritagliare ogni singolo compartimento; per questo processo, solo i marcatori delle reti vascolari sono rilevanti. Rimuovere qualsiasi nave non posizionata all'interno dell'area del compartimento. Create una proiezione di intensità massima e salvate ogni singolo compartimento ritagliato come immagine TIFF.
   1. In ImageJ, premete File > Apri e selezionate l'immagine TIFF desiderata contenente diversi scomparti. L'immagine dovrebbe avere almeno due canali, la rete di vasi fluorescenti e l'immagine luminosa trasmessa.
   2. Sulla barra degli strumenti selezionare lo strumento di selezione Poligono. Selezionare il canale di luce trasmesso. Clicca su uno degli angoli del compartimento esagonale, all'interfaccia tra l'area del compartimento e la parete dell'impalcatura, inizierà la definizione della maschera. Continuare a fare clic sugli angoli successivi in ordine sequenziale fino a selezionare l'angolo iniziale, chiudendo la maschera.
      NOTA: Questa spiegazione si applica a un compartimento esagonale. Quando il compartimento è quadrato o circolare, utilizzate rispettivamente gli strumenti Rettangolo o Ovale per creare una maschera appropriata. Indipendentemente dalla forma, adattare sempre la maschera per seguire la parete interna dell'impalcatura.
   3. Fare clic su Analizza > strumenti > gestore del ROI. Nel gestore del ROI (ROI, area di interesse), fare clic sul pulsante Aggiungi per salvare la maschera creata. La nuova maschera verrà visualizzato nell'elenco dei lati sinistro. Questo passaggio consente all'analisi di essere coerente tra immagini diverse.
      NOTA: nel gestore del ROI, è possibile salvare un file con tutte le maschere create facendo clic su Altro > Salva. Nella finestra Salva selezione scegliere un nome e un percorso e salvare il file ROI. Per recuperare la maschera, in Gestione ROI fare clic su Altre > Apri e scegliere il file ROI desiderato.
   4. Selezionare l'immagine di rete del recipiente fluorescente e fare clic su Modifica > cancella all'esterno. Rimarrà solo l'immagine contenuta nella maschera, mentre il resto verrà eliminato.
   5. Con l'immagine di rete cancellata aperta, fare clic su Immagine > duplicato. Nella finestra popup Duplica scrivere il nome dell'immagine. Se è selezionata l'opzione Iperstack duplicato, deselezionarla e fare clic su OK. Verrà creata una nuova immagine contenente solo le reti di recipienti fluorescenti ritagliate.
   6. Salvare l'immagine ritagliata facendo clic su File > Salva con nome > Tiff. Scegliere il nome e la directory e fare clic su OK.
3. Analizza lo sviluppo vascolare sulle immagini ritagliate.
   1. Scarica e installa il software libero analitico AngioTool, che fornisce strumenti quantitativi per quantificare una varietà di parametri vascolari. Il software può essere ottenuto dal seguente indirizzo https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
   2. Impostare il valore di scala delle immagini per ottenere risultati in unità millimetriche e caricare un'immagine.
      1. Fare clic sulla scheda Impostazione e riempire la distanza in pixel e la distanza in mm con i valori rappresentativi delle immagini acquisite. Utilizzando i parametri di imaging sopra menzionati, i valori da riempire sono 400 pixel per 1 mm.
      2. Premere il pulsante Apri immagine e cercare l'immagine di interesse.
   3. Selezionate i parametri di analisi per quantificare lo sviluppo del contenitore nella scheda Analisi (Analysis).
      1. Sotto il campo Diametro e intensità del recipiente, deselezionate qualsiasi marcatore presente dal selettore di fascia superiore e attivate il marcatore che rappresenta il numero 3.
      2. Sotto il campo Diametro e intensità del recipiente, sul selettore dell'intervallo inferiore, spostare il marcatore dell'intervallo inferiore a 60 e lasciare il produttore di ranger alto a 255.
      3. Attivate la casella Rimuovi piccole particelle e impostate il marcatore su 100.
      4. Nel campo Preferenze di salvataggioselezionare il nome e il percorso del file del foglio di diffusione in cui verranno salvati i risultati e premere il pulsante Esegui analisi. Se la casella Salva immagine risultato è selezionata, Angiotool genererà e salverà una nuova immagine jpeg che mostra i parametri quantificati della rete di recipienti.
         NOTA: per ogni analisi eseguita senza modificare il nome del file del foglio di diffusione, verrà aggiunta una nuova riga nella parte inferiore del file, con i risultati appena acquisiti.
4. Organizzare i dati ed eseguire un'analisi statistica.
   1. Per tutte le immagini elaborate, scegliere il parametro di interesse dalla scheda di diffusione (ad esempio lunghezza totale della nave e area della nave)e immetterle in un software di analisi statistica per studiare correttamente i risultati ottenuti (Figura 3C).

7. Imaging time lapse per il rilevamento delle origini e il monitoraggio della migrazione

1. In alternativa, per coltivare le impalcature nell'incubatore come descritto nella fase 4.6, impostare una camera di coltura al microscopio confocale a 37 °C, 5% CO₂ e 100% di umidità.
   1. Mettere la piastra contenente le impalcature completamente sementi nella camera del microscopio confocale e impostare i parametri di imaging sui valori desiderati.
   2. Impostare l'intervallo di acquisizione dell'immagine su 30 minuti e il tempo totale di imaging di 72 ore. Ciò consentirà di eseguire completamente il lapse senza la necessità di un cambiamento medio.
      ATTENZIONE: Nel caso in cui si desideri un'immagine a termine più lungo, è necessario eseguire un'attenta calibrazione della posizione per poter recuperare la posizione di imaging originale, poiché i cambiamenti medi richiedono la rimozione della piastra dall'incubatore confocale e nella cappa biologica sterile.
      NOTA: Il distacco dei PAESI EC dalle pareti dell'impalcatura e dalla formazione di strutture tubolari inizierà entro la prima ora dalla semina dei SCs (fase 4) e potrebbe richiedere fino a 50 ore per essere completato. Dopo la formazione iniziale del tubo, nuovi germogli inizieranno a migrare nel compartimento dalle navi circostanti. La germinazione e il successivo rimodellamento della rete proseguiranno durante l'esperimento approssimativamente fino al giorno 10, quando le reti delle navi diventeranno^{stabili 22}. Utilizzare queste informazioni per scegliere di conseguenza il punto di partenza e il passo dell'ora di time lapse.
2. Salvate il file filmato time lapse completo come sequenza TIFF.
3. Apri ImageJ e fate clic su File > Importa > sequenza immagine e selezionate i file. Questo aprirà la sequenza TIFF come film.
4. Aprire il plug-in Tracciamento manuale facendo clic su Plugin > Manual Tracking. In questo modo si aprirà la finestra Rilevamento.
5. Osservare il filmato e selezionare la nave da tracciare. Prestare attenzione alla sua origine e migrazione.
6. Attivare la casella Mostra parametri e immettere i 30 minuti per l'intervallo di tempo. La calibrazione x/y dipenderà dalla quantità di pixel selezionata durante l'imaging.
7. Procedere a tracciare manualmente i vasi di germogliazione dal contorno dell'impalcatura.
   1. Premere il pulsante Aggiungi traccia. Sul primo fotogramma del film, premere la posizione della nave da tracciare. Successivamente, il filmato cambierà automaticamente nel fotogramma successivo.
   2. Clicca sull'immagine del secondo fotogramma in cui si trova la nave. Ancora una volta, il filmato cambierà automaticamente nel fotogramma successivo.
   3. Procedere con la stessa nave fino al completamento del monitoraggio completo della migrazione.
   4. Nella finestra Tracking, fare clic sulla sovrapposizione Dots & Lines per imprimere un percorso visivo della migrazione della nave sul filmato. Verrà aperta una copia del filmato con un punto che rappresenta la posizione corrente del tracker e una linea che mostra il percorso precedente.
   5. Fate clic sul pulsante Traccia finale (End Track) per finalizzare la registrazione del movimento corrente della nave.
   6. Clicca di nuovo sul pulsante Aggiungi traccia per ricominciare con una nuova nave. In questo modo, i marcatori linea e punto cambieranno automaticamente il loro colore per la nuova nave. Ripetere fino a quando tutte le navi desiderate non vengono tracciate.
      NOTA: la posizione x/y, la velocità del contenitore e la distanza spostata possono essere recuperate dalla finestra popup Risultati. Ogni nave sarà identificata dal suo numero di binario nella colonna più a sinistra. Questi dati possono essere copiati e incollati in una scheda di diffusione per eseguire ulteriori analisi.

Risultati

Il protocollo presentato, utilizzando tecniche stereolitografiche, consente la fabbricazione di impalcature tassellate realizzate in fotoresist SU-8. Sono state ottenute impalcature con geometrie distinte del compartimento (quadrati, esagoni e cerchi) e caratteristiche altamente accurate e ripetibili (Figura 1).

Discussione

La necessità di una ricca vascucolatura all'interno incorporata nei tessuti ingegnerizzati è fondamentale per costruire la sopravvivenza e la corretta funzione¹. Sebbene l'ingegneria del sistema vascolare sia stata al centro di una grande quantità di ricerche, molto è rimasto da indagare e capire²⁴. In particolare, quando si ricrea un tessuto specifico, la microvascolarizzazione dovrebbe comportarsi e organizzarsi di conseguenza¹². L'approccio più co...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Angiotool freeware	NIH-CCR		Download gratuito su https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Siero di albumina bovina Probumin	Millipore	82-045-1
Cellule staminali della polpa dentale	Lonza	PT-5025
ECM media + kit proiettile	Sciencell	# 1001
Etanolo 96%	Gadot-Gruppo	64-17-5
Evicel sigillante di fibrina	Johnson& Johnson	EVB05IL	Fornisce soluzioni sia di trombina che di fibrinogeno (BAC2)
GlutaMAX	Gibco	35050061
Capra anti-topo Cy3 anticorpo	Jackson	115-166-072
Capra anti-coniglio Alexa-Fluor 488	Thermo-Fisher Scientific	A11034
Cellule microvascolari adipose umane	Sciencell	#7200
Umano fibronectina	Sigma	F0895-5MG	Concentrazione di riserva: 1 mg/mL
ImageJ	NIH		Download gratuito all'indirizzo https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Alcool isopropilico	Gadot-Group	67-63-0
Reagente	di sollevamento Kayaku Advanced Materials, Inc	G112850	Nome commerciale Omnicoat
Low-glucose DMEM	Biological Industries	01-050-1A
Anticorpo anti-SMA di topo	Dako	M0851
NEAA	Gibco 11140068
Soluzione di paraformaldeide 4% in PBS	ChemCruz	SC-281692
Soluzione di penicillina-streptomicina-nistatina	Industrie biologiche	03-032-1B
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma	P5368-10PAK
Anticorpo anti-vWF di coniglio	Abcam	ab9378
Wafer di silicio	Wafer Silicon Valley Microelectronics (SVM)		4", Tipo N-1-10, 500-550 micron di spessore
SU-8 2050 fotoresist	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y11058
SU-8 sviluppatore	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y020100
Tryton-X 100	BioLab LTD	Codice: 57836