Semina cellulare graduale su impalcature tassellate per studiare i vasi sanguigni germogliati

Summary

I tessuti ingegnerizzati si affidano fortemente a reti vascolari adeguate per fornire nutrienti e gas vitali e rimuovere i rifiuti metabolici. In questo lavoro, un protocollo di semina graduale di cellule endoteliali e cellule di supporto crea reti vascolari altamente organizzate in una piattaforma ad alta produttività per lo studio dello sviluppo del comportamento dei vasi in un ambiente 3D controllato.

Abstract

Il sistema cardiovascolare è un attore chiave nella fisiologia umana, fornendo nutrimento alla maggior parte dei tessuti del corpo; i vasi sono presenti in diverse dimensioni, strutture, fenotipi e prestazioni a seconda di ogni tessuto perfuso specifico. Il campo dell'ingegneria tissutale, che mira a riparare o sostituire i tessuti corporei danneggiati o mancanti, si basa sull'angiogenesi controllata per creare una corretta vascolarizzazione all'interno dei tessuti ingegnerizzati. Senza un sistema vascolare, i costrutti ingegnerizzati spessi non possono essere sufficientemente nutriti, il che può causare morte cellulare, scarso innesto e, in ultima analisi, fallimento. Pertanto, comprendere e controllare il comportamento dei vasi sanguigni ingegnerizzati è una sfida eccezionale sul campo. Questo lavoro presenta un sistema ad alta produttività che consente la creazione di reti di navi organizzate e ripetibili per lo studio del comportamento della nave in un ambiente di impalcature 3D. Questo protocollo di semina in due fase mostra che i vasi all'interno del sistema reagiscono alla topografia dell'impalcatura, presentando comportamenti di germogliatura distintivi a seconda della geometria del compartimento in cui risiedono i vasi. I risultati ottenuti e la comprensione da questo sistema ad alta produttività possono essere applicati al fine di informare meglio i progetti di costrutti di impalcature biostampate 3D, in cui la fabbricazione di varie geometrie 3D non può essere rapidamente valutata quando si utilizza la stampa 3D come base per ambienti biologici cellularizzati. Inoltre, la comprensione da questo sistema ad alta produttività può essere utilizzata per il miglioramento dello screening rapido dei farmaci, il rapido sviluppo di modelli di co-colture e lo studio di stimoli meccanici sulla formazione dei vasi sanguigni per approfondire la conoscenza del sistema vascolare.

Introduction

Il campo dell'ingegneria tissutale sta rapidamente progredendo verso la fabbricazione di costrutti ingegnerizzati per sostituire organi e tessuti mancanti o^{danneggiati 1}. Tuttavia, i costrutti pienamente funzionali devono ancora essere raggiunti, in parte, poiché generare reti vascolari operative per il nutrimento dei tessuti rimane una sfida eccezionale. Senza un'adeguata vascolarizzazione, i tessuti ingegnerizzati sono limitati a un trasporto passivo di diffusione di ossigeno e sostanze nutritive, vincolando lo spessore massimo vitale del tessuto al limite di diffusione, circa 200 μm². Tali spessori non sono adatti a riparare grand....

Protocol

1. Fabbricazione di impalcature tassellate

NOTA: La fotolitografia è una tecnica diffusa che richiede apparecchiature specializzate tipicamente alloggiate all'interno di un impianto /laboratorio di nanofabbricazione. Il metodo previsto da questo protocollo è stato generalizzato il più possibile per il pubblico; tuttavia, possono essere necessarie lievi modifiche alle procedure a seconda delle attrezzature a disposizione del lettore. Si consiglia di eseguire queste procedure in una stanza pulita presso una struttura di nanofabbricazione per garantire la massima qualità del processo. Prima di iniziare, ottenere l'accesso a un allineatore di mas....

Results

Il protocollo presentato, utilizzando tecniche stereolitografiche, consente la fabbricazione di impalcature tassellate realizzate in fotoresist SU-8. Sono state ottenute impalcature con geometrie distinte del compartimento (quadrati, esagoni e cerchi) e caratteristiche altamente accurate e ripetibili (Figura 1).

Discussion

La necessità di una ricca vascucolatura all'interno incorporata nei tessuti ingegnerizzati è fondamentale per costruire la sopravvivenza e la corretta funzione¹. Sebbene l'ingegneria del sistema vascolare sia stata al centro di una grande quantità di ricerche, molto è rimasto da indagare e capire²⁴. In particolare, quando si ricrea un tessuto specifico, la microvascolarizzazione dovrebbe comportarsi e organizzarsi di conseguenza¹². L'approccio più co.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotool freeware	NIH-CCR		Download gratuito su https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Siero di albumina bovina Probumin	Millipore	82-045-1
Cellule staminali della polpa dentale	Lonza	PT-5025
ECM media + kit proiettile	Sciencell	# 1001
Etanolo 96%	Gadot-Gruppo	64-17-5
Evicel sigillante di fibrina	Johnson& Johnson	EVB05IL	Fornisce soluzioni sia di trombina che di fibrinogeno (BAC2)
GlutaMAX	Gibco	35050061
Capra anti-topo Cy3 anticorpo	Jackson	115-166-072
Capra anti-coniglio Alexa-Fluor 488	Thermo-Fisher Scientific	A11034
Cellule microvascolari adipose umane	Sciencell	#7200
Umano fibronectina	Sigma	F0895-5MG	Concentrazione di riserva: 1 mg/mL
ImageJ	NIH		Download gratuito all'indirizzo https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Alcool isopropilico	Gadot-Group	67-63-0
Reagente	di sollevamento Kayaku Advanced Materials, Inc	G112850	Nome commerciale Omnicoat
Low-glucose DMEM	Biological Industries	01-050-1A
Anticorpo anti-SMA di topo	Dako	M0851
NEAA	Gibco 11140068
Soluzione di paraformaldeide 4% in PBS	ChemCruz	SC-281692
Soluzione di penicillina-streptomicina-nistatina	Industrie biologiche	03-032-1B
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma	P5368-10PAK
Anticorpo anti-vWF di coniglio	Abcam	ab9378
Wafer di silicio	Wafer Silicon Valley Microelectronics (SVM)		4", Tipo N-1-10, 500-550 micron di spessore
SU-8 2050 fotoresist	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y11058
SU-8 sviluppatore	Kayaku Advanced Materials, Inc	Y020100
Tryton-X 100	BioLab LTD	Codice: 57836