Articolo metodologico

Assemblaggio e funzionamento di un dispositivo acoustofluidico per una maggiore consegna di composti molecolari alle cellule

DOI:

10.3791/62035

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21 gennaio 2021

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1Department of Bioengineering, University of Louisville, 2School of Medicine, University of Louisville, 3Department of Biology, University of Louisville

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un dispositivo accostofluidico a basso costo per la consegna molecolare rapida alle cellule tramite sonoporazione indotta da agenti di contrasto ad ultrasuoni.

Abstract

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Per un'ampia gamma di ricerche biomediche e applicazioni terapeutiche a base cellulare è necessaria un'efficiente fornitura intracellulare di biomolecole. La sonoporazione mediata da ultrasuoni è una tecnica emergente per la rapida consegna intracellulare di biomolecole. La sonoporazione si verifica quando la cavitazione di microbolle riempite di gas forma pori transitori nelle membrane cellulari vicine, il che consente un rapido assorbimento delle biomolecole dal fluido circostante. Le attuali tecniche per la sonoporazione in vitro delle cellule in sospensione sono limitate dalla bassa produttività, dalla variabilità delle condizioni di esposizione agli ultrasuoni per ogni cellula e dall'elevato costo. Per risolvere queste limitazioni, è stato sviluppato un dispositivo acoustofluidico a basso costo che integra un trasduttore ad ultrasuoni in un dispositivo fluido basato su PDMS per indurre una sonoporazione coerente delle cellule mentre scorrono attraverso i canali in combinazione con agenti di contrasto ad ultrasuoni. Il dispositivo è fabbricato utilizzando tecniche di fotolitografia standard per produrre il chip fluido basato su PDMS. Un trasduttore a disco piezografico ad ultrasuoni è collegato al dispositivo e guidato da un microcontrollore. L'assieme può essere integrato all'interno di una custodia stampata in 3D per una maggiore protezione. Cellule e microbolle vengono spinte attraverso il dispositivo utilizzando una pompa per siringa o una pompa peristaltica collegata ai tubi in PVC. Con questo sistema apodtofluidico è dimostrato un migliore recapito di biomolecole alle cellule T umane e alle cellule tumorali polmonari. Rispetto agli approcci di trattamento alla rinfusa, questo sistema acoustofluidico aumenta la produttività e riduce la variabilità, che può migliorare i metodi di lavorazione cellulare per applicazioni di ricerca biomedica e la produzione di terapie a base cellulare.

Introduzione

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Piattaforme virali e non virali sono state utilizzate per migliorare la consegna molecolare alle cellule. La somministrazione virale (trasduzione) è una tecnica comune utilizzata nelle terapie cellulari che richiedono modifiche genomiche. Le limitazioni con la consegna virale includono potenziale mutagenesi inserimento, capacità transgenica limitata e molteplicità indesiderata diinfezione 1,2. Pertanto, le tecniche di somministrazione molecolare non virale sono in fase di sviluppo per un'ampia gamma di applicazioni biomediche e di ricerca. Le tecniche comuni includono l'energia meccanica, elettrica, idrodinami....

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Protocollo

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Le donazioni di sangue intero sono state raccolte da donatori sani a seguito di protocolli approvati dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Louisville.

1. Fabbricazione di dispositivi anotofluidi

  1. Ottenere una maschera fotografica con un design a spirale concentrico contenente canali con un diametro di 500 μm. Nei file supplementari viene fornito un file CAD come esempio. Una maschera fotografica personalizzata può essere ordinata da un fornitore commerciale o modellata utilizzando uno scrittore di maschere.
  2. Prepara uno stampo del design a spirale concentrico su un wafer di silicio riv....

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Risultati

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Un'immagine del sistema acoustofluidico assemblato all'interno di una custodia stampata in 3D è mostrata nella figura 1. Questo protocollo produce un sistema acoustofluidico che può essere utilizzato per migliorare l'erogazione molecolare intracellulare in più linee cellulari utilizzando agenti di contrasto ad ultrasuoni.

Figura 2   dimostra una maggiore somministrazione intracellulare di un composto fluorescente, la .......

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Discussione

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Questo protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un sistema acoustofluidico a basso costo che migliora la fornitura intracellulare di biomolecole per applicazioni di ricerca. Ci sono diversi fattori importanti da considerare quando si assembla e si gestisce questo sistema. Il dispositivo acoustofluidico è fabbricato in PDMS, che è un materiale biocompatibile che può essere facilmente modellato con dimensioni del canale coerenti27. I canali del dispositivo possono essere risciacquati.......

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Dichiarazioni

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I coautori MAM e JAK detengono la proprietà di DesiCorp che può beneficiare finanziariamente dei prodotti relativi a questa ricerca.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai finanziamenti della National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) e dei National Institutes of Health (U01HL127518). I servizi di fotolitografia sono stati forniti dall'University of Louisville Micro/Nano Technology Center.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fabbricazione di dispositivi acustofluidici
DOW SYLGARD 184 INCAPSULANTE IN SILICONE TRASPARENTE 0,5 KG KITEllsworth Adesivi4019862 (SKU)https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2,5 mm)Scienze della microscopia elettronica69039-25
Serbatoio microfluidico per provetta Falcon da 15 mL - S (2/4 porte)Darwin MicrofluidicsLVF-KPT-S-2 (SKU)https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
Vetrino per microscopioVWR16004-430https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
triclorosilanoGelest105732-02-3 (Cas. No.)Il clorosilano è molto hazaradous e infiammabile. L'esposizione provoca gravi ustioni e danni agli occhi.
Tubo in plastica morbida Tygon PVC (1/16" ID, 1/8" OD)McMaster-Carr5233K51 (Parte #)https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/
Assemblaggio del sistema acustofluidico
Arduino UnoArduino7630049200050 (codice a barre)https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
Preparazione di agenti di contrasto ad ultrasuoni
1,2-distearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSEPC)Avanti Lipids890703P-25mg (SKU)https://avantilipids.com/product/890703
1,2-distearoil-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Lipids850365P-25mg (SKU)https://avantilipids.com/product/850365
1,2- distearoil-sn-glicero-3-fosfoglicerolo (DSPG)Avanti Lipids840465P-25mg (SKU)https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (decafluorobutato gassoso)FlouroMed355-25-9 (Cas No.)http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
Amalgamatori DB-338COXOhttps://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
poliossietilene 40 stearato Sigma-AldrichP3440-250G (SKU)https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid=
Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjjj
Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS
vID64X-1KbO3LUKGjVUwb
PDAaAqvOEALw_wcB
Q125Sonicatore QsonicaQ125-110 (Rif.)https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
Preparazione di cellule T primarty
autoMACs running bufferMiltenyi Biotec130-091-221 (Order No.)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
Kit di isolamento delle cellule Pan T, umano (cocktail di anticorpi di biotina Pan T-Cell & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) Miltenyi Biotec130-096-535 (Numero d'ordine)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
selezionatore di celle magnetiche (autoMACS Pro Separator)Miltenyi Biotec130-092-545 (numero d'ordine)https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
Preparazione di cellule tumorali polmonari A549
trealosio strong MegazymeK-TREH (Cat. No.)https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
Blu di tripano (0,4% in soluzione acquosa Pronto all'uso, sterile)VWR97063-702 (Cat. No.)https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
  2. Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vecto....

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Tecnica di sonoporazioneconsegna intracellularetrasduttore a ultrasuonicavitazione di microbollechip fluidico in PDMSpermeabilizzazione della membrana cellularecellule T umanecellule di cancro al polmoneintegrazione di microcontrollori

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