Definizione del programma di traduzione dell'mRNA materno durante la maturazione in vitro utilizzando un saggio single oocyte reporter

Natasja G. J. Costermans; Enrico M. Daldello; Ria J. Marathe; Marco Conti

doi:10.3791/62041

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Articolo metodologico

Definizione del programma di traduzione dell'mRNA materno durante la maturazione in vitro utilizzando un saggio single oocyte reporter

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DOI:

10.3791/62041

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16 giugno 2021

Natasja G. J. Costermans¹^,² , Enrico M. Daldello¹^,²^,³ , Ria J. Marathe¹^,² , Marco Conti¹^,²

¹Center for Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, ²Department of Obstetrics Gynecology and Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, ³Present affiliation: Laboratoire de Biologie du Développement-Institut de Biologie Paris Seine, LBD-IBPS, Sorbonne Université

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un saggio di reporter per studiare la regolazione della traduzione dell'mRNA in singoli ovociti durante la maturazione in vitro.

Abstract

Gli eventi associati alla maturazione nucleare degli ovocite sono stati ben descritti. Tuttavia, molto meno si sa delle vie molecolari e dei processi che si svolgono nel citoplasma in preparazione alla fecondazione e all'acquisizione della totipotenza. Durante la maturazione degli ovocite, i cambiamenti nell'espressione genica dipendono esclusivamente dalla traduzione e dal degrado degli RNA messaggeri materni (mRNA) piuttosto che dalla trascrizione. L'esecuzione del programma trascizionale, quindi, svolge un ruolo chiave nello stabilire la competenza allo sviluppo degli ovocite per sostenere lo sviluppo degli embrioni. Questo articolo fa parte di un focus sulla definizione del programma di traduzione dell'mRNA materno che avviene durante la maturazione meiotica e alla transizione tra ovocita e zigote. In questo documento di metodo viene presentata una strategia per studiare la regolazione della traduzione degli mRNA bersaglio durante la maturazione degli ovocite in vitro. Qui, un reporter Ypet viene fuso alla regione non tradotta 3 ' (UTR) del gene di interesse e quindi micro-iniettato in ovociti insieme alla codifica dell'mRNA poliadenilato per mCherry per controllare il volume iniettato. Utilizzando la microscopia time-lapse per misurare l'accumulo del reporter, i tassi di traduzione sono calcolati a diverse transizioni durante la maturazione meiotica degli ovocite. Qui, sono stati descritti i protocolli per l'isolamento e l'iniezione degli ovocite, la registrazione time-lapse e l'analisi dei dati, usando il reporter UTR Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' come esempio.

Introduzione

Un ovocita di mammiferi completamente cresciuto subisce rapidi cambiamenti nella preparazione alla fecondazione e all'acquisizione della totipotenza. Questi cambiamenti sono essenziali per sostenere lo sviluppo embrionale dopo la fecondazione. Sebbene gli eventi associati alla maturazione nucleare siano relativamente ben descritti, molto meno si sa dei processi molecolari e delle vie nel citoplasma degli ovocite. Durante le fasi finali della maturazione degli ovociti, gli ovociti sono trascrittamente silenziosi e l'espressione genica dipende interamente dalla traduzione e dalla^{degradazione dell'mRNA 1,}². La si....