Questo protocollo delinea un metodo di routine per l'utilizzo della microscopia elettronica seriale a scansione block-face (SBF-SEM), una potente tecnica di imaging 3D. L'applicazione di successo di SBF-SEM dipende da corrette tecniche di fissazione e colorazione dei tessuti, nonché da un'attenta considerazione delle impostazioni di imaging. Questo protocollo contiene considerazioni pratiche per l'intero processo.
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Articolo metodologico
Microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi (SBF-SEM) di campioni di tessuto biologico
In questo articolo
Sommario
Abstract
La microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi (SBF-SEM) consente la raccolta da centinaia a migliaia di immagini ultrastrutturali registrate in serie, offrendo una visione tridimensionale senza precedenti della microanatomia tissutale. Mentre SBF-SEM ha visto un aumento esponenziale dell'uso negli ultimi anni, aspetti tecnici come una corretta preparazione dei tessuti e parametri di imaging sono fondamentali per il successo di questa modalità di imaging. Questo sistema di imaging beneficia della natura automatizzata del dispositivo, consentendo di lasciare il microscopio incustodito durante il processo di imaging, con la raccolta automatizzata di centinaia di immagini possibili in un solo giorno. Tuttavia, senza un'adeguata preparazione dei tessuti, l'ultrastruttura cellulare può essere modificata in modo tale da poter trarre conclusioni errate o fuorvianti. Inoltre, le immagini vengono generate scansionando la faccia a blocchi di un campione biologico incorporato nella resina e questo spesso presenta sfide e considerazioni che devono essere affrontate. L'accumulo di elettroni all'interno del blocco durante l'imaging, noto come "carica tissutale", può portare a una perdita di contrasto e all'incapacità di apprezzare la struttura cellulare. Inoltre, mentre l'aumento dell'intensità/tensione del fascio di elettroni o la diminuzione della velocità di scansione del fascio possono aumentare la risoluzione dell'immagine, questo può anche avere lo sfortunato effetto collaterale di danneggiare il blocco di resina e distorcere le immagini successive nella serie di imaging. Qui presentiamo un protocollo di routine per la preparazione di campioni di tessuto biologico che preserva l'ultrastruttura cellulare e diminuisce la carica tissutale. Forniamo anche considerazioni di imaging per la rapida acquisizione di immagini seriali di alta qualità con danni minimi al blocco tissutale.
Introduzione
La microscopia elettronica a scansione facciale a blocchi seriali (SBF-SEM) è stata descritta per la prima volta da Leighton nel 1981, dove ha modellato un microscopio elettronico a scansione potenziato con un microtomo incorporato in grado di tagliare e tagliare sottili sezioni di tessuto incorporate nella resina. Sfortunatamente, le limitazioni tecniche ne limitavano l'uso a campioni conduttivi, poiché campioni non conduttivi come il tessuto biologico accumulavano livelli inaccettabili di carica (accumulo di elettroni all'interno del campione di tessuto)1. Mentre rivesteva il blocco-faccia tra i tagli con la ricarica dei tessuti ridotta al ca....
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Protocollo
Tutti gli animali sono stati trattati secondo le linee guida descritte nella Dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ofthalmology per l'uso degli animali nella ricerca sulla vista e sugli oftalmici e nelle linee guida per la manipolazione animale dell'University of Houston College of Optometry. Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dalle istituzioni in cui sono state gestite: le procedure per topi, ratti, conigli, cavie e primati non umani sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Houston, le procedure zebrafish sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della DeP....
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Risultati
Cornea di topo
Questo protocollo è stato ampiamente applicato alla cornea di topo. Utilizzando l'imaging SBF-SEM, è stata dimostrata la soddisfazione di una rete di fasci di microfibrille senza elastina (EF PCB) all'interno della cornea di topo adulta. In precedenza si credeva che questa rete fosse presente solo durante lo sviluppo embrionale e postnatale precoce. SBF-SEM ha rivelato una vasta rete EFMB in tutta la cornea, con fibre individuali che hanno un diametro di 100-200 nm se misurate in sezion.......
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Discussione
Lo scopo di questo documento sui metodi è quello di evidenziare la metodologia di preparazione e imaging dei tessuti che ha permesso al nostro laboratorio di catturare in modo affidabile immagini di microscopia elettronica seriale ad alta risoluzione e di evidenziare i passaggi critici che portano a questo risultato e potenziali insidie che possono verificarsi durante la conduzione dell'imaging SBF-SEM. Il successo nell'utilizzo di questo protocollo richiede una corretta fissazione dei tessuti, l'impregnazione di metalli.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown e Margaret Gondo per la loro eccellente assistenza tecnica. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dai National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 e P30 EY007551 (National Eye Institute), in parte dalla Lion's Foundation for Sight, e in parte da NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health & Human Development).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1/16 x 3/8 Rivetti in alluminio Rivetto | industriale & Dispositivo di fissaggio Co. | 6N37RFLAP/1100 | Utilizzato come perni per campioni. |
| Cacciavite a testa piatta da 2,5 mm | Wiha Quality Tools | 27225 | |
| Acetone | Microscopia elettronica Scienze | RT 10000 | Utilizzato per diluire la vernice d'argento. |
| Acido aspartico | Sigma-Aldrich | A8949 | |
| Cloruro di calcio | FisherScientific | C79-500 | |
| Vernice conduttiva all'argento | Ted Pella | 16062 | |
| Denton Desk-II Dispositivo di sputtering a vuoto dotato di bersaglio standard in lamina d'oro | Denton Vacuum | N/A | Questo è il dispositivo di sputtering dell'oro utilizzato dagli autori, le alternative sono accettabili. |
| Rasoi a doppio taglio | Fisher Scientific | 50-949-411 | |
| Embed 812 | Microscopia elettronica Scienze | 14120 | |
| Gatan 3View2 montato in un Tescan Mira3 Emissione di campo SEM | Gatan & Tescan | N/A | Questo è il dispositivo SBF-SEM utilizzato dagli autori, le alternative sono accettabili. |
| Fiale con guscio di vetro, 0,5 DRAM (1,8 ml) | Scienze della microscopia elettronica | 72630-05 | |
| Microscopia elettronica della | gluteraldeide | Scienze 16320 | |
| Gorilla Super Colla - Resistente agli urti | NA | NA Indicata | come colla cianoacrilica nel testo. |
| Ketjen Black | HM Royal | EC-600JD | Indicato come nerofumo nel testo. |
| KOH | FisherScientific | 18-605-593 | |
| Nitrato di piombo | Fisher Scientific | L62-100 | |
| Microonde | Pelco | BioWave Pro | Questo è il forno a microonde utilizzato dagli autori, le alternative sono accettabili. |
| Tetrossido di osmio | Sigma-Aldrich | 201030 | |
| Ferrocianuro di potassio | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Stampo per inclusione in silicone | Ted Pella | 10504 | |
| Cacodilato di sodio triidrato | Microscopia elettronica Scienze | 12300 | |
| Pipetta di trasferimento Samco | ThermoFisher Scientific | 202 | Utilizzato per realizzare il perno del campione tubi di stoccaggio. |
| Lime ad ago modello svizzero Scienze | microscopia elettronica | 62115 | |
| Tiocarbobidrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
| Acetato di uranile | Polysciences, Inc. | 21447-25 | |
| Software per la ricostruzione | |||
| Amira Software | Thermo Scientific | N/A | Utilizzato per creare le ricostruzioni che si trovano nelle figure 5-7 e 9. |
| Figi (Figi è solo ImageJ) | ImageJ.net | N/A | TrakEM2 può essere aggiunto a Figi per asist nella segmentazione manuale. |
| Browser di immagini per microscopia (MIB) | Università di Helsinki, Istituto di Biotecnologia | N/A | |
| Software di ricostruzione | Laboratorio di sistemi neurali | N/A | |
| Banco di lavoro SuRVoS | Sorgente luminosa a diamante & L'Università di Nottingham | N/A | |
| SyGlass | IstoVisio, Inc. | N/A | Consente la ricostruzione in realtà virtuale e metodi di ricostruzione basati su istogrammi. |
Riferimenti
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscop....
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Ristampe e permessi
