Questo studio mira a sviluppare un nuovo modello di coltura retinica organotipica umana (HORC) che impedisce di compromettere l'integrità retinica durante la manipolazione dell'espianto. Ciò si ottiene coltivando la retina con il vitreo sovrastante e il pigmento retinico sottostante epitelio-coroide (RPE-coroide) e sclera.
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Articolo metodologico
Caratterizzazione di una nuova tecnica di coltura retinica organotipica umana
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Precedenti modelli di coltura retinica organotipica umana (HORC) hanno utilizzato retine staccate; tuttavia, senza il supporto strutturale conferito dall'epitelio-coroide pigmentato retinico (RPE-coroide) e dalla sclera, l'integrità della retina fragile può essere facilmente compromessa. Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un nuovo modello HORC che contiene la retina, la coroide RPE e la sclera per mantenere l'integrità retinica durante la coltura di espianti retinici.
Dopo aver tagliato circonferenzialmente lungo il limbus per rimuovere l'iride e la lente, sono state fatte quattro incisioni profonde per appiattire la oculare. In contrasto con i precedenti protocolli HORC, una trefina è stata utilizzata per tagliare non solo la retina, ma anche la coroide RPE e la sclera. Gli espianti a triplo strato risultanti sono stati coltivati per 72 ore. La colorazione di ematossilina ed eosina (H & E) è stata utilizzata per valutare le strutture anatomiche e gli espianti retinici sono stati ulteriormente caratterizzati dall'immunoistochimica (IHC) per l'apoptosi, l'integrità delle cellule di Müller e l'infiammazione della retina. Per confermare la possibilità di induzione della malattia, gli espianti sono stati esposti a glucosio alto (HG) e citochine pro-infiammatorie (Cyt), per imitare la retinopatia diabetica (DR). Il test delle perle magnetiche Luminex è stato utilizzato per misurare le citochine correlate al DR rilasciate nel terreno di coltura.
La colorazione H&E ha rivelato lamelle retiniche distinte e nuclei compatti negli espianti retinici con la coroide RPE e la sclera sottostanti, mentre le retine senza le strutture sottostanti hanno mostrato uno spessore ridotto e una grave perdita di nuclei. I risultati dell'IHC hanno indicato l'assenza di apoptosi e infiammazione retinica, nonché l'integrità delle cellule di Müller preservata. I saggi Luminex hanno mostrato un aumento significativo della secrezione di citochine pro-infiammatorie associate a DR in espianti retinici esposti a HG + Cyt rispetto ai livelli basali a 24 ore.
Abbiamo sviluppato e caratterizzato con successo un nuovo protocollo HORC in cui l'integrità retinica è stata preservata senza apoptosi o infiammazione retinica. Inoltre, la secrezione indotta di biomarcatori pro-infiammatori associati a DR quando espone espianti retinici a HG + Cyt suggerisce che questo modello potrebbe essere utilizzato per studi clinicamente traducibili sulle malattie retiniche.
Introduzione
La retina è una struttura oculare altamente specializzata responsabile della trasformazione dell'energia luminosa in entrata in segnali elettrici, che vengono poi elaborati dal cervello per la percezione visiva. La retina umana contiene una gamma dinamica di tipi cellulari, altamente organizzati in un'unica struttura lamellare costituita da due strati sinaptici e tre nuclei1 (Figura 1). L'omeostasi retinica è sostenuta dalle intricate connessioni tra cellule neuroretiniche, vasi sanguigni, nervi, tessuti connettivi e RPE1. A causa della sofisticata anatomia e fisiologia retinica, i meccanism....
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Protocollo
I colliri per donatori umani sono stati ottenuti dalla New Zealand National Eye Bank dopo l'escissione corneale per il trapianto e come approvato dal Northern B Health and Disability Ethics Committee (NTX/06/19/CPD/AM07).
NOTA: La coltura deve essere effettuata in un armadio di biosicurezza di Classe II per garantire condizioni di coltura tissutale sterile. I tessuti devono essere coltivati entro 24 ore post-mortem per evitare una significativa perdita di integrità retinica.
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Risultati
L'integrità retinica è stata preservata in questo modello HORC. L'integrità retinica è stata preservata negli espianti retinici sandwich coltivati, ma è stata persa nella retina coltivata senza strutture adiacenti. H&E è stato condotto per esaminare l'integrità strutturale degli espianti retinici a sandwich sezionati dopo 72 ore di coltura. Gli espianti retinici sandwich hanno mostrato integrità preservata e una struttura lamellare distinta da GCL a ONL con nuclei co.......
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Discussione
HORC è attualmente il modello clinicamente più traducibile nella ricerca preclinica retinica. Rispetto ai modelli di coltura cellulare in vitro, HORC può rappresentare meglio l'anatomia della retina umana in situ, attraverso il mantenimento dei tipi di cellule retiniche dinamiche e delle loro connessioni con neuroni, vascolari e ambiente extracellulare19. Rispetto ai modelli animali, gli HORC sono più vantaggiosi nello studio della fisiopatologia e nella progettazione di trattamenti farmaceutici p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i generosi donatori di tessuti oculari e il team della New Zealand National Eye Bank per il loro sostegno. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da sovvenzioni di progetto del Maurice and Phyllis Paykel Trust e della Auckland Medical Research Foundation (1117015). La direzione di IDR è sostenuta dalla Buchanan Charitable Foundation. La borsa di studio di CK è fornita dal New Zealand Association of Optometrists Education and Research Fund (CC36812) e la borsa di studio di HHL è fornita dalla Buchanan Charitable Foundation.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Punzoni monouso per biopsia (5 mm) | Integra York PA Inc., USA | 21909-142 | Indicati come trephine chirurgiche in questo articolo |
| IL-1 ricombinante umanoβ | Peprotech, USA | 200-01B | Concentrazione di lavoro: 10 ng/mL |
| ricombinante umano TNF-A | Peprotech, USA | 300-01A | Concentrazione di lavoro: 10 ng/mL |
| DAPI (1 µ g/mL) | Sigma Aldrich, Germania | #D9542 | Colorante nucleare. Diluizione di lavoro 1:1000 |
| DMEM/F-12, integratore GlutaMAX | Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA | 10565018 | Dulbecco' s Modified Eagle Miscela di nutrienti medi F-12 contenente un 1&volte; Miscela di antibiotici e antimicotici (AA, 100> stock) |
| Forbici fini - Sharp-Blunt | Fine Science Tools (F.S.T) | 14028-10 | Punte: Affilato-Smussato, Tagliente: 27 mm, Lunghezza: 10 cm, Lega/Materiale: Acciaio inossidabile, Seghettato: No, Forma della punta: Pinza a |
| graefe | Strumenti per la scienza fine (FST) | 11050-10 | Lunghezza: 10 cm, Forma della punta: Dritta, Punte: Seghettate, Larghezza della punta: 0,8 mm, Dimensioni della punta: 0,8 x 0,7 mm, Lega/Materiali: Acciaio inossidabile |
| Topo monoclonale GFAP-Cy3 | Sigma Aldrich, Germania#C9205 | Anticorpo primario coniugato a Cy3. Diluizione di lavoro 1:1000. | |
| Monoclonale di topo Vimentina-Cy3 | Sigma Aldrich, Germania#C9080 | Anticorpo primario coniugato a Cy3. Diluizione di lavoro 1:50. | |
| TUNEL policlonale di coniglio (Kit di rilevamento della morte cellulare in situ, fluoresceina) | Sigma Aldrich, Germania | #11684795910 | Anticorpo primario coniugato a fluoresceina-dUTP. Diluizione di lavoro 1:10 con soluzione enzima-tampone. |
Riferimenti
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).
- Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment.<....
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Ristampe e permessi
