Articolo metodologico

Valutazione funzionale della permeabilità intestinale e della migrazione transepiteliale neutrofila nei topi utilizzando un modello standardizzato di loop intestinale

DOI:

10.3791/62093

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11 febbraio 2021

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

In questo articolo

Sommario

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La funzione di barriera epiteliale intestinale disregolata e le risposte immunitarie sono segni distintivi della malattia infiammatoria intestinale che rimangono scarsamente studiate a causa della mancanza di modelli fisiologici. Qui descriviamo un modello di loop intestinale del topo che impiega un segmento intestinale ben vascolarizzato ed esteriore per studiare la permeabilità della mucosa e il reclutamento di leucociti in vivo.

Abstract

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La mucosa intestinale è rivestita da un singolo strato di cellule epiteliali che forma una barriera dinamica che consente il trasporto paracellulare di nutrienti e acqua prevenendo il passaggio di batteri luminali e sostanze esogene. Una violazione di questo strato si traduce in una maggiore permeabilità al contenuto luminare e al reclutamento di cellule immunitarie, entrambi tratti distintivi di stati patologici nell'intestino tra cui la malattia infiammatoria intestinale (IBD).

I meccanismi che regolano la funzione di barriera epiteliale e la migrazione transepiteliale (TEpM) dei neutrofili polimorfonucleari (PMN) sono incompleti compresi a causa della mancanza di metodi sperimentali in vivo che consentano analisi quantitative. Qui descriviamo un robusto modello sperimentale murino che impiega un segmento intestinale esteriore di ileo o colon prossimale. L'anello intestinale esternaizzato (iLoop) è completamente vascolarizzato e offre vantaggi fisiologici rispetto agli approcci basati su camera ex vivo comunemente usati per studiare la permeabilità e la migrazione della PMN attraverso monostrati di cellule epiteliali.

Dimostriamo in dettaglio due applicazioni di questo modello: (1) misurazione quantitativa della permeabilità intestinale attraverso il rilevamento di dextrans etichettato con fluorescenza nel siero dopo iniezione intraluminale, (2) valutazione quantitativa della PMN migrata attraverso l'epitelio intestinale nel lume intestinale dopo l'introduzione intraluminale di chemioattrattanti. Dimostriamo la fattibilità di questo modello e forniamo risultati utilizzando l'iLoop nei topi privi della proteina epiteliale associata alla giunzione stretta JAM-A rispetto ai controlli. JAM-A ha dimostrato di regolare la funzione barriera epiteliale così come il PMN TEpM durante le risposte infiammatorie. I nostri risultati utilizzando iLoop confermano studi precedenti ed evidenziano l'importanza del JAM-A nella regolazione della permeabilità intestinale e del PMN TEpM in vivo durante l'omeostasi e la malattia.

Il modello iLoop fornisce un metodo altamente standardizzato per studi in vivo riproducibili di omeostasi intestinale e infiammazione e migliorerà significativamente la comprensione della funzione barriera intestinale e dell'infiammazione della mucosa in malattie come l'IBD.

Introduzione

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La mucosa intestinale comprende un singolo strato di cellule epiteliali intestinali colonnari (IHC), cellule immunitarie lamina propria sottostanti e mucose muscolose. Oltre al suo ruolo nell'assorbimento dei nutrienti, l'epitelio intestinale è una barriera fisica che protegge l'interno del corpo da batteri commensali luminali, agenti patogeni e antigeni dietetici. Inoltre, IEC e le cellule immunitarie lamina propria coordinano la risposta immunitaria inducendo tolleranza o risposta a seconda del contesto e degli stimoli. È stato riferito che l'interruzione della barriera epiteliale può precedere l'insorgenza di infiammazione della mucosa patologica e contribuire alla malattia infiammatoria intestinale (IBD) che comprende sia la colite ulcerosa che la malattia di Crohn1,2,3,4,5,6,7. Gli individui con colite ulcerosa presentano un'eccessiva migrazione transepiteliale (TEpM) dei neutrofili polimorfonucleari (PMN) che formano ascessi di cripta, una scoperta che è stata associata alla gravitàdella malattia 8,9. Sebbene la funzione di barriera epiteliale compromessa e le risposte immunitarie eccessive siano segni distintivi dell'IBD, mancano test sperimentali in vivo per eseguire valutazioni quantitative della permeabilità intestinale e del reclutamento delle cellule immunitarie nella mucosa intestinale.

I metodi più comuni utilizzati per studiare la permeabilità epiteliale intestinale e il PMN TEpM utilizzano approcci a camera ex vivo utilizzando monostrati IEC coltivati su inserti di membrana porosa semi-permeabile10,11,12. L'integrità della barriera epiteliale è monitorata da misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) o del flusso paracellulare dell'isotiocianato di fluoresceina (FITC) etichettato dextran dal compartimento apicale a quello basale13,14,15. Allo stesso modo, il PMN TEpM viene in genere studiato in risposta a un chemioattrattante che viene aggiunto nella camera inferiore16. Le PMN vengono poste nella camera superiore e dopo un periodo di incubazione, le PMN che sono migrate nel compartimento basale vengono raccolte e quantificate. Sebbene questi metodi siano utili, facili da eseguire e molto riproducibili, sono ovviamente approcci riduzionisti e non rappresentano necessariamente un riflesso accurato delle condizioni in vivo.

Nei topi, un saggio comune per studiare la permeabilità paracellulare intestinale è per gavage orale di FITC-dextran e successiva misurazione dell'aspetto FITC-dextran nel siero del sangue13,17. Lo svantaggio di questo saggio è che rappresenta una valutazione dell'integrità complessiva della barriera del tratto gastrointestinale piuttosto che quella dei contributi intestinali regionali. Inoltre, evans blue è comunemente usato per valutare la perdita vascolare in vivo18 ed è stato anche impiegato per valutare la permeabilità della mucosa intestinale nel topoe nel ratto 19,20,21. La quantificazione del blu Evans nella mucosa intestinale richiede l'estrazione dal tessuto impiegando incubazione in formamide durante la notte. Pertanto, lo stesso tessuto non può essere utilizzato per studiare la permeabilità epiteliale intestinale e l'infiltrazione di neutrofili.

Qui evidenziamo un semplice protocollo che riduce il numero di animali necessari per raccogliere dati riproducibili sulla permeabilità della mucosa colonica e sulla migrazione transepiteliale dei leucociti in vivo. Raccomandiamo pertanto l'uso di FITC-dextrans facilmente rilevabili nel siero del sangue senza compromettere l'integrità dei loop intestinali che possono essere raccolti per ulteriori analisi. Da notare che gli anelli legati intestinali sono stati utilizzati in varie specie (tra cui topo, ratto, coniglio, vitello) per studiare l'infezione batterica (come Salmonella, Listeria monocytogenes ed Escherichia coli)22,23,24,25, nonché la permeabilità intestinale26; tuttavia, per quanto ne so non ci sono studi che studiano meccanismi di PMN TEpM in regioni specifiche nell'intestino come l'ileo o il colon che sono comunemente coinvolti nell'IBD.

Qui descriviamo il modello dell'anello intestinale del topo (iLoop) che è un metodo in vivo microchirurgico robusto e affidabile che impiega un segmento intestinale ben vascolarizzato ed esteriore del colon ileo o prossimale. Il modello iLoop è fisiologicamente rilevante e consente la valutazione dell'integrità della barriera intestinale e del TEpM PMN sui topi viventi in anestesia. Dimostriamo due applicazioni: 1) quantificazione dei livelli sieri di 4 kDa FITC-dextran dopo somministrazione intraluminale nell'iLoop 2) quantificazione della PMN trasmigrata nel lume iLoop dopo iniezione intraluminale della potente chemiotractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Inoltre, utilizzando il modello iLoop con topi o topi Jam-a-null che ospitano una perdita selettiva di JAM-A sugli IEC(Villin-cre; Jam-a fl/fl) rispetto ai topi di controllo, siamo in grado di confermare studi precedenti che hanno riportato un importante contributo per la proteina JAM-A associata alla giunzione stretta alla permeabilità intestinale e alla trasmigrazione neutrofila15,28,29,30,31.

Il modello iLoop è un metodo altamente funzionale e fisiologico che può essere utilizzato per confermare saggi in vitro. Inoltre, questo è un modello sperimentale versatile che consente lo studio di vari reagenti che possono essere iniettati nel lume loop, tra cui chemiochine, citochine, agenti patogeni batterici, tossine, anticorpi e terapie.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida e le politiche dei National Institutes of Health e approvati dall'Institutional Animal Care & Use Committee dell'Università del Michigan.

1. Preparazione preoperatoria

NOTA: Questo metodo è stato generato impiegando topi adulti provenienti da background genetico C57BL/6, di età compresa tra 8 e 12 settimane. Tutti i topi sono stati tenuti in condizioni specifiche e specifiche esenti da agenti patogeni con accesso ad libitum al normale chow e acqua. I risultati sono stati ottenuti utilizzando C57BL/6, Jam-a - topi nulli (Jam-a-/-) o topi che ospitano una perdita selettiva di JAM-A sugli IEC (Villin-cre; Jam-afl) elittermate Jam-aflcontrollano come descritto in precedenza30.

  1. Preparazione dell'area
    1. Eseguire un intervento chirurgico in area pulita. Il modello loop intestinale, tuttavia, è un intervento chirurgico di non sopravvivenza che non richiede una tecnica aseptica / sterile. Osservare le pratiche igienico-sanitarie veterinarie e utilizzare strumenti chirurgici puliti (ad esempio, scrubbed con sapone, risciacquato con acqua seguito dal 70% di etanolo).
    2. Accendere una scheda chirurgica a temperatura controllata (o pastiglie riscaldanti) e una fonte di luce adattata per evitare che l'animale sia ipotermia durante l'anestesia e l'intervento chirurgico.
    3. Preparare le legature tagliando segmenti di 6 cm di suture chirurgiche di seta 4-0 non assorbibili.
    4. Preparare garze di cotone (5 cm x 5 cm) tagliate al centro seguendo una forma ellissoide. Questi saranno utilizzati per coprire la laparotomia della linea mediana e prevenire il contatto diretto tra l'iLoop esterna e la pelliccia animale. Immergere le garze tagliate nella soluzione salina equilibrata (HBSS) di Hanks calda in un contenitore di piastre di petri.
    5. Preparare tamponi di cotone bagnati imbevuti di HBSS caldi che verranno utilizzati per gestire organi e iLoop esternati.
    6. Preparare una siringa da 10 ml riempita con HBSS caldo e attaccare a un tubo di alimentazione giallo. Questa siringa verrà utilizzata per idratare i tessuti esposti durante l'intervento chirurgico e per sciacquare delicatamente l'iLoop del contenuto fecale.
  2. Preparazione animale
    1. Anestetizzare l'animale in conformità con il protocollo animale approvato. In questo protocollo un mix di isoflurane e ossigeno viene somministrato attraverso un vaporizzatore di anestesia. Secondo le istruzioni del produttore, regolare la portata dell'ossigeno a 1 L /min. Impostare il vaporizzatore sul 5% e precaricere la camera di induzione. Dopo 5 minuti, ridurre il vaporizzatore di isoflurane al 2% - 2,5%.
    2. Posizionare l'animale nella camera di induzione per 3 min - 5 minuti, quindi trasferire l'animale su un tavolo da chirurgia riscaldato e collegare una spina per il cono del naso di anestesia. Trattenere l'animale in posizione supina dai quattro arti usando del nastro adesivo.
      NOTA: In alternativa all'anestesia, una miscela di chetamina (80 mg/kg - 100 mg/kg) e xiloazina (5 mg/kg - 10 mg/kg) diluita in soluzione salina (0,9% NaCl) può essere somministrata mediante iniezione intraperitoneale. L'anestesia deve essere mantenuta durante l'intervento mediante somministrazione intramuscolare di chetamina/xiazina (a 0,1 - 0,25 volte le dosi iniziali) per garantire la profondità anestetica. Se disponibile, si consiglia vivamente un vaporizzatore di anestesia isoflurana per garantire una migliore riproducibilità, sopravvivenza e prevenire il dolore animale.
    3. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale.
    4. Eseguire un esame fisico che includa frequenza cardiaca (circa 500 battiti / min) e ritmo, colore della mucosa (rosa), tempo di ricarica capillare (< 2 s), frequenza respiratoria (non inferiore a 40 - 60 respiri / min) e temperatura (36,5 ° C)32.
    5. Prima di procedere ai passaggi successivi, valutare la profondità anestetica mediante riflesso di prelievo del pedale. Utilizzare uno stimolo doloroso (pizzico) della pelle tra le dita dei piedi e / o le dita dei piedi. Il mouse risponderà contraendo e rimuovendo la gamba. Questo riflesso del pedale scompare quando l'animale viene anestetizzato profondamente.
      NOTA: Il monitoraggio dei segni vitali e del riflesso del pedale è raccomandato in tutta l'anestesia almeno ogni 15 minuti. Le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) per la valutazione della profondità anestetica raccomandano il monitoraggio dei seguenti: (a) colore della coda, del piede e della mucosa (come la lingua). Colore rosa come normale e pallido o blu come indicativo di diminuzione della perfusione sanguigna o disagio respiratorio; b valutazione del modello respiratorio come respiri regolari rispetto a quelli irregolari. Una sonda di temperatura rettale, un ossimetro dei roditori e monitor della frequenza cardiaca possono essere utilizzati rispettivamente per la valutazione della temperatura corporea, del cuore e delle frequenza respiratorie.

2. Generazione del ciclo ileale

  1. Preparazione della pelle: Pulire la pelliccia della linea mediana addominale con tamponi di alcol o spugna di garza imbevuta di 70% di etanolo. Non bagnare un'ampia area di pelliccia con alcool per prevenire l'ipotermia.
  2. Usando le forbici, eseguire una laparotomia di media linea. Fare un'incisione verticale al centro dell'addome (circa 2 cm di lunghezza) ed esporre il peritoneo. Fare attenzione a non ferire gli organi intra-addominali.
  3. Posizionare una garza di cotone bagnata pretagliata sulla cavità intra-addominale esposta.
  4. Utilizzare tamponi di cotone bagnati per mobilitare ed esternaizzare il caecum. Posizionare con cura il caecum sulla garza di cotone bagnata.
    NOTA: Caecum è localizzato nel quadrante caudale sinistro della cavità addominale nella maggior parte dei topi indipendentemente dal sesso dell'animale.
  5. Utilizzare tamponi di cotone bagnati per mobilitare e esternalizzare delicatamente l'ileo di cui la sezione terminale (estremità distale) è attaccata al caecum(Figura 1B).
  6. Dispiegare almeno 6 cm di ileo terminale sulla garza di cotone bagnata senza interruzione dei vasi mesenterici e dell'apporto di sangue. L'apporto di sangue viene mantenuto se non c'è sanguinamento e il tessuto mantiene il suo colorerosa ( Figura 1B).
    NOTA: Evitare l'essiccazione dei tessuti esposti mantenendo i tessuti umidi in ogni momento con HBSS caldo (ogni 2 - 3 minuti) utilizzando una siringa da 10 ml attaccata a un tubo di alimentazione giallo (fase 1.1.6).
  7. Vicino al catecum, identificare l'arteria principale che fornisce l'ileo nel mesenterio. Quindi individuare due siti di litigazione nel mesenterio che sono liberi da vasi sanguigni critici.
  8. Usando le forcelle dei tessuti smussati, afferrare saldamente l'ileo terminale (più vicino al caecum) e usando le forcelle a punta fine, fenestrare il mesentere evitando i vasi sanguigni. Posizionare la sutura di seta sulla perforazione e legare un nodo chirurgico per creare la prima legatura (estremità distale del ciclo).
  9. Utilizzare il righello per misurare a 4 cm di distanza dalla prima legatura e creare la seconda legatura (estremità prossimale del ciclo) come menzionato nel passaggio 2.8 (Figura 1C).
  10. Con forbici fini accuratamente tagliate accanto a ciascuna legatura per isolare l'anello ileale di 4 cm, mantenendo intatto l'apporto di sangue e la membrana mesenterica.
    NOTA: Tagliare entrambe le estremità del segmento esteriore dell'iLoop, quindi sciacquare delicatamente come passo necessario che impedisce interferenze con il contenuto luminare (materia fecale), facilitando così anche la dispersione di FITC-dextrans o stimoli chemiotattici su tutta la lunghezza del segmento isolato oltre a consentire una quantificazione più accurata dei leucociti per citometria del flusso. Questa procedura consente anche una distensione uniforme della mucosa dopo l'iniezione di volumi specificati di reagente e una migliore riproducibilità tra gli animali.
  11. Sciacquare delicatamente il contenuto del segmento dell'anello ileale con HBSS caldo utilizzando un tubo di alimentazione giallo flessibile collegato a una siringa da 10 ml (vedere il passaggio 1.1.6).
  12. Ligate le due estremità tagliate del loop ileale lavato usando sutura di seta.
  13. Utilizzare una siringa da 1 ml con ago da 30 G per iniettare lentamente 250 μL di reagente come FITC-dextrans (fase 4.2) o chemiochina (fase 5.3) nel lume intestinale. Il ciclo ileale si gonfierà causando una moderata distensione della mucosa (Figura 1D).
    NOTA: Iniettare reagente nel lume ad anello sul lato opposto dell'arteria mesenterica. Fare attenzione a non estrarre l'anello ileale dall'animale durante l'iniezione per evitare di strappare i vasi sanguigni e indurre sanguinamento.
  14. Utilizzando tamponi di cotone bagnati, rimettere delicatamente l'anello ileale, l'ileo prossimale e il caecum.
  15. Utilizzare un portaaghi, pini anatomici e 3,0 suture di seta non assorbibili con ago da taglio inverso per chiudere la parete addominale.
  16. Posizionare l'animale in una camera di anestesia regolata dalla temperatura per il periodo di incubazione.

3. Generazione del ciclo dei due punti prossimali (pcLoop)

NOTA: per i dettagli sui mouse utilizzati per la generazione del pcLoop, vedere le informazioni fornite all'inizio della sezione del protocollo.

  1. Eseguire i passaggi 2.1. - 2.4. come descritto sopra per il ciclo ileale.
  2. Utilizzando tamponi di cotone bagnati, esternalizza l'intero ileo e posizionalo sulla parte superiore di una garza di cotone bagnata. Identificare il colon prossimale e l'apporto di sangue situato nel mesocolone. Mobilitare il colon prossimale e utilizzando forcep a punta fine creare la prima legatura in un'area priva di vasi nel mesocolone a circa 0,5 cm distale dal celco (Figura 2B).
  3. Misurare 2 cm dalla prima legatura e creare una seconda legatura in un'area priva di apporto di sangue nel mesocolone (Figura 2C).
  4. Utilizzando forbici fini accuratamente tagliate accanto a ogni legatura per isolare un pcLoop lungo 2 cm.
    NOTA: Come indicato nella nota al punto 2.10, è importante tagliare entrambe le estremità per isolare un pcLoop che viene delicatamente pulito dal contenuto luminare. Tagliare accuratamente il tessuto colon e il mesocolone per evitare che piccoli vasi sanguinano nel lume intestinale. Se necessario, utilizzare cautery termico per limitare il sanguinamento nel sito di incisione.
  5. Sciacquare delicatamente il pcLoop con HBSS caldo per rimuovere le feci utilizzando un tubo di alimentazione giallo flessibile collegato a una siringa da 10 ml (vedere il passaggio 1.1.6).
  6. Ligate le due estremità tagliate del pcLoop lavato usando la sutura di seta.
  7. Utilizzare una siringa da 1 ml con ago 30G per iniettare lentamente 200 μL di reagente come FITC-dextrans (fase 4.2) o chemiochina (fase 5.3) nel lume intestinale. Il pcLoop si gonfierà causando una moderata distensione della mucosa (Figura 2D).
    NOTA: Iniettare il reagente nel lume pcLoop sul lato opposto dell'arteria mesenterica. Garantire la consistenza tra gli animali e creare un pcLoop lungo 2 cm per garantire la stessa distensione della mucosa.
  8. Utilizzare tamponi di cotone bagnati per riposizionare delicatamente il pcLoop legato, l'ileo e il caecum nella cavità addominale.
  9. Utilizzare un portaaghi, pini anatomici e 3,0 suture di seta non assorbibili con ago da taglio inverso per chiudere la parete addominale.
  10. Posizionare l'animale in una camera di anestesia regolata dalla temperatura per il periodo di incubazione.

4. Valutazione quantitativa della permeabilità intestinale: 4 kDa test FITC-dextran

  1. Eseguire un ciclo ileale o pcLoop (come descritto sopra).
  2. Utilizzando una siringa da 1 ml con ago da 30 G, iniettare nel lume intestinale 250 μL (ileum - fase 2.13) o 200 μL (colon - fase 3.7) di soluzione FITC-dextran da 4 kDa (1 mg / mL in HBSS). Mantenere la soluzione FITC-dextran inutilizzata protetta dalla luce per preparare la curva standard dopo la raccolta del siero.
  3. Per il ciclo ileale, attenersi ai passaggi da 2.14 a 2.16, per i passaggi da 3.8 a 3.10 pcLoop. In breve, rimettere organi e iLoop nella cavità addominale, chiudere la parete addominale.
  4. Posizionare l'animale per 120 minuti in una camera di anestesia riscaldata.
  5. Dopo il periodo di incubazione aprire la parete addominale, ottenere l'accesso al cuore ed eseguire punture cardiache utilizzando una siringa da 1 ml con ago 25G per raccogliere il sangue. Trasferire il sangue in un tubo attivatore di coaguli di siero da 1,3 ml, mescolare delicatamente e mantenere il ghiaccio protetto dalla luce. Raccogliere almeno 500 μL di sangue per topo.
    NOTA: Gli animali vengono eutanasiati quando sono in anestesia utilizzando un metodo fisico come la decapitazione o la lussazione cervicale e in conformità con il protocollo animale approvato.
  6. Tubo attivatore di coaguli di siebro centrifuga per 5 minuti a 10.000 x g a temperatura ambiente secondo le raccomandazioni del produttore. Raccogliere il siero (supernatante) e trasferirlo in un tubo di centrifuga da 1,7 ml. Tenere il tubo sul ghiaccio e protetto dalla luce.
  7. Quantificazione della fluorescenza nel siero del sangue
    1. Preparare una curva standard di FITC-dextran 4 kDa nel siero dei topi di controllo (saline o HBSS è una valida alternativa). Creare una diluizione seriale duplice con una concentrazione iniziale di 1 mg/mL FITC-dextran. Le concentrazioni di FITC-dextran 4 kDa misurate variano tra 0,25 mg/mL e 2 μg/mL.
    2. Trasferire lo stesso volume del campione e gli standard su una piastra nera da 96 po '(fondo piatto) e misurare FITC in un lettore di piastre a fluorescenza (eccitazione 490 nm, emissione 520 nm), secondo le istruzioni del produttore e i protocollipubblicati 33. Calcolare la concentrazione FITC in base alla curva standard o ai valori di permeabilità presenti come cambio di piegatura normalizzato al gruppo di controllo sperimentale.

5. Valutazione quantitativa della PMN migrata nel lume intestinale dopo la stimolazione intraluminale con chemiochine

NOTA: Pochissime PMN risiedono nella mucosa intestinale al livello di base. Il pretrattamento di animali con citochine pro-infiammatorie si traduce in un ambiente infiammatorio che facilita il reclutamento di PMN dal flusso sanguigno nella mucosa intestinale.

  1. Utilizzando una siringa da 1 ml con ago da 30 G, eseguire l'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una soluzione sterile di 100 ng di fattore di necrosi tumorale-α (TNFα) e 100 ng di interferone-γ (INFγ) in 200 μL di saline tamponata di fosfato (PBS).
  2. Dopo 4 - 24 ore di pretrattamento con citochine pro-infiammatorie, eseguire un ciclo ileale o pcLoop (come descritto sopra).
  3. Utilizzando una siringa da 1 ml con ago da 30 G, iniettare nel lume intestinale 250 μL (ileum - fase 2.13) o 200 μL (colon - fase 3.7) di soluzione chemioattrattrice Leukotriene B4 (LTB4) 1 nM in HBSS.
    NOTA: Leucotriene B4 (LTB4) viene utilizzato in questo protocollo come potente chemioattrattante per la PMN. Altri chemioattrattanti come N-Formylmethionyl-leucil-fenilalanine (fMLF) o chemiochina (motivo C-X-C) ligando 1 (CXCL1/KC) possono anche essere utilizzati per indurre un significativo reclutamento di PMN nel lume colonico30.
  4. Per il ciclo ileale seguire i passaggi da 2.14 a 2.16. Per il pcLoop seguire i passaggi da 3.8 a 3.10. In breve, rimettere organi e iLoop nella cavità addominale, chiudere la parete addominale.
  5. Posizionare l'animale per 60 minuti in una camera di anestesia riscaldata.
  6. Raccolta del contenuto dell'anello intestinale
    1. Preparare le soluzioni e conservare sul ghiaccio: Per l'anello ileale e il pcLoop, preparare un tampone di lavaggio contenente 2 mM di acido etilendiamminatetraacetico (EDTA), 5 mM Ditiothreitol (DTT) e 2% FBS in PBS sterile senza calcio e magnesio.
    2. Dopo il periodo di incubazione e sotto manutenzione dell'anestesia, aprire la parete addominale ed estrarre l'iLoop (anello ileale o pcLoop). Eutanasia degli animali quando sono in anestesia utilizzando un metodo fisico come la decapitazione o la lussazione cervicale e in conformità con il protocollo animale approvato.
    3. Risciacquare il ciclo con PBS freddo per rimuovere qualsiasi contaminante del sangue residuo e assorbire l'eccesso di PBS con salviette tissutali. Raccogliere con cura il contenuto del loop in un tubo di centrifuga da 1,7 ml (circa 250 μL per l'anello ileale e 200 μL per pcLoop). Lavare l'anello con tampone di lavaggio a freddo da 500 μL e, immediatamente dopo la raccolta, posizionare il tubo sul ghiaccio.
      NOTA: DTT aiuta a sciogliere il muco. Se il contenuto luminale di iLoop è molto viscoso (a seconda dello sfondo genetico del topo), diluirlo 1:2 o 1:3 con tampone di lavaggio contenente DTT.
    4. Passare la soluzione di contenuto luminale attraverso un filtro a rete di nylon da 35 μm utilizzando un tubo a fondo tondo da 5 ml con tappo filtrante a celle. Questo passaggio aiuta a rimuovere frammenti di tessuto e aggregati cellulari. Risciacquare il filtro cellulare con 1 mL di tampone di lavaggio.
    5. Tubo di centrifuga a 400 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il supernatante, sciacquare il pellet con tampone di lavaggio da 500 μL - 1 mL, quindi centrifugare a 400 x g per 5 min, 4 °C.
    6. Resuspend iLoop luminal cell pellet in 200 μL di flow citometriry buffer (FCB) contenente il 2% di FBS in PBS sterile senza calcio e magnesio. Le celle possono essere conservate in un tubo o trasferite su una piastra inferiore rotonda da 96 po 'per la colorazione e l'analisi della citometria del flusso.
  7. Colorazione e analisi della citometria del flusso
    1. Controlli di compensazione: globuli bianchi
      1. Preparare una siringa da 1 ml con ago da 25 G preriempita con EDTA sterile da 0,5 M (pH 8.0). 10% DI EDTA per volume di sangue previsto (100 μL di EDTA per 1 mL di sangue).
      2. Raccogliere il sangue in anestesia per puntura cardiaca. Trasferire il sangue in un tubo da 1,7 ml, quindi centrifugare a 400 x g per 10 minuti, 4 °C.
        NOTA: Mentre il topo è in anestesia, utilizzare un metodo fisico per confermare la morte in conformità con il protocollo animale approvato (come la lussazione cervicale).
      3. Aspira il supernatante. Rimescolare il pellet in 1 mL di tampone di lysis Ammonium-Cloro-Potassio (ACK) per lalisi dei globuli rossi. Incubare per 3 min - 5 minuti sul ghiaccio. Centrifuga 400 x g per 5 min, 4 °C. Se il pellet è ancora rosso, ripetere questo passaggio tampone di lisi ACK fino a quando il pellet diventa bianco.
      4. Rimostrare il pellet in FCB da 1 mL e la piastra 0,5 x 106- 1 x 106 di celle per pozzo. Preparare cinque pozzali di una piastra rotonda-fondo da 96 po '. Metti il piatto sul ghiaccio.
        NOTA: utilizzare la stessa piastra a 96 elementi che contiene il contenuto luminare del loop (vedere il passaggio 5.6.6).
    2. Colorazione citometrica a flusso
      1. Centrifugare la piastra da 96 punti per 5 min a 400 x g,4 °C. Scartare il supernatante e rimescolare i pellet con 50 μL di CD16/CD32 per topo di ratto purificato come Blocco Fc (1 μg per 100 μL di FCB). Incubare per 5 min - 10 minuti sul ghiaccio.
      2. Immunostaining del contenuto luminale di iLoop: Preparare una miscela contenente tutti gli anticorpi coniugati con fluorocromo (diluizione 1:50 in FCB): anti-CD45-PerCP, anti-CD11b-PE e anti-Ly-6G-Alexa Fluor 647. Aggiungere 50 μL della combinazione per pozzo, per un volume finale di 100 μL.
      3. Immunostaining dei globuli bianchi per compensazioni (1:50 diluizione in FCB): utilizzare 50 μL di FCB da solo (campione non macchiato, ben 1), 50 μL di ogni singolo anticorpo coniugato al fluorocromo (pozzi 2 - 4), 50 μL della combinazione di tutti gli anticorpi coniugati fluorocromo (pozzo 5). Volume finale di 100 μL.
      4. Incubare la piastra per 30 minuti su ghiaccio protetto dalla luce.
      5. Centrifugare la piastra per 5 min a 400 x g,4 °C. Scartare il supernatante e lavare con 200 μL di FCB. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
      6. Aggiungere FCB 150 μL/bene ai campioni di sangue.
      7. Aggiungere FCB a 100 μL/pozzo al campione di contenuto luminale iLoop. Quindi 50 μL/pozzo di perline di conteggio fluorescenti.
    3. Analisi della citometria del flusso
      1. Gate per eventi positivi CD45 e per l'espressione di Ly-6G-/Gr-1 e CD11b30.
      2. Utilizzare 100 μL del volume del campione come condizione di arresto.
      3. Calcolare il numero assoluto di PMN migrati nell'iLoop lumen in base alle informazioni fornite dal produttore delle perline di conteggio fluorescenti.
        NOTA: I dati possono essere presentati come (1) numero totale di PMN nel lume30,34,35, (2) numero di PMN per grammo di tessuto e (3) numero di PMN per mm3 utilizzando la formula per il volume di un cilindro: V= π(pi) r 2 h (V per volume, r per raggio e h per altezza).

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Risultati

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Una rappresentazione schematica dei modelli ileal loop e pcLoop è illustrata rispettivamente nella figura 1 e nella figura 2. Le immagini anatomiche mostrano le fasi critiche della procedura, tra cui l'esternalizzazione del segmento intestinale(Figura 1B e Figura 2B),l'identificazione di una posizione appropriata per le legazioni che consente un disturbo minimo dell'apporto di sangue

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Discussione

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I meccanismi responsabili della disregolazione della funzione barriera intestinale e del reclutamento delle cellule immunitarie in condizioni patologiche come l'IBD sono incompleti compresi. Qui, dettagliamo un robusto modello murino in vivo che utilizza un segmento intestinale esteriore ben vascolarizzato di ileo o colon prossimale e consente la valutazione della permeabilità intestinale, studi sulla migrazione dei neutrofili e altre applicazioni.

L'iLoop è un intervento chirurgico di non rec...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano il Dr. Sven Flemming dell'Università di Wuerzburg per i suoi contributi alla creazione del modello a colon loop prossimale, Sean Watson per la gestione delle colonie di topi e Chithra K. Muraleedharan per aver contribuito all'acquisizione delle immagini del modello iLoop. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione tedesca per la ricerca/DFG (BO 5776/2-1) a KB, R01DK079392, R01DK072564 e R01DK061379 a C.A.P.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Attrezzature e materiale
BD Tamponi imbevuti di alcolBD326895
BD Precision Glide Needle, 25G x 5/8"BD305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G x 1/2"BD305106
BD 1ml Siringa per tubercolina senza agoBD309659
Provetta da centrifuga da 15 mlCorning14-959-53A
Micropiastra in polistirene nero solido a 96 pozzettiCorning FisherScientific07-200-592
Piatto di coltura non trattato Corning,CLS430588Millipore
(batuffolo di cotone), 6", sterileFisherScientific25806 2WC
Spugne di garza riempite di cotone, Vaporizzatore per anestesia non sterile, 2" x 2"Medex3249-1
EZ-7000 (sistema classico, comprese le unità di riscaldamento)E-Z SystemsEZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml VWR21008-940
Fisherbrand Nastro adesivo coloratoFisherScientific15-901-10R
Halsey Needle Holder (porta aghi) FST12001-13
Kimwipes, piccolo (salvietta per tessuti)FisherScientific06-666
Provette per microcentrifuga da 1,7 ml Thomas Scientific c2170
Micro Tube 1.3ml Z (tubo attivatore del coagulo di siero)Sarstedt 41.1501.105
Forbici fini MoriaFST14370-22
Tubo a fondo tondo in polistirene da 5 ml con tappo per filtro cellulare (35 &; m maglia di nylon)Falcon352235
Puralube, lubrificante oculare sterileDechra12920060
Ring Ropeps (pinza per tessuti smussati)FST11103-09
Roboz Surgical 4-0 Seta intrecciata nera, 100 YDFisherScientificNC9452680
Semken Forceps (pinza anatomica)FST1108-13
Sofsilk non assorbibile rivestito sutura nera intrecciata seta taglia 3-0, 18", ago 19 mm lunghezza 3/8 cerchio taglio inverso HenryScheinSS694
Pinza fine per studenti, FST angolata91110-10
Siringa da 10 ml PP / PE senza agoMillipore Sigma
Piastra per colture cellulari a 96 pozzettiCorning3799
Tubi di alimentazione gialli per roditori 20G x 30 mmInstechFTP-20-30
Solutions e tamponi
Accugene 0.5M EDTALonza51201
Tampone di lisi di ammonio-cloruro-potassio (ACK)BioWhittaker10-548E
salina bilanciata di HanksCorning21-023-CV
Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesioCorning21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anticorpo Ly-6G anti-topo (1A8)BioLegend127610
CD11b Anticorpo monoclonale, PE, eBioscience (M1/70)ThermoFisher12-0112-81
CountBright Absolute Counting BeadsInvitrogenC36950
DitiotreitolFisherScientificBP172-5
Siero fetale bovino, inattivato a caldoR& D Systems511550
Fluoresceina Isotiocianato-Destrano, peso molecolare medio 4.000Sigma60842-46-8
IsofluranoAlocarbonio12164-002-25
Leucotriene B4Millipore Sigma71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)BD Pharmingen557235
Ratto purificato anti-topo CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)BD Bioscience553142
IFN murino ricombinante-γPeprotech315-05
Ricombinante Murina TNF-&alfa;Peprotech315-01A
applicatore con punta in cotone da 10 cmUnguento veterinario Z248029 Soluzione

Riferimenti

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