La funzione di barriera epiteliale intestinale disregolata e le risposte immunitarie sono segni distintivi della malattia infiammatoria intestinale che rimangono scarsamente studiate a causa della mancanza di modelli fisiologici. Qui descriviamo un modello di loop intestinale del topo che impiega un segmento intestinale ben vascolarizzato ed esteriore per studiare la permeabilità della mucosa e il reclutamento di leucociti in vivo.
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Articolo metodologico
Valutazione funzionale della permeabilità intestinale e della migrazione transepiteliale neutrofila nei topi utilizzando un modello standardizzato di loop intestinale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La mucosa intestinale è rivestita da un singolo strato di cellule epiteliali che forma una barriera dinamica che consente il trasporto paracellulare di nutrienti e acqua prevenendo il passaggio di batteri luminali e sostanze esogene. Una violazione di questo strato si traduce in una maggiore permeabilità al contenuto luminare e al reclutamento di cellule immunitarie, entrambi tratti distintivi di stati patologici nell'intestino tra cui la malattia infiammatoria intestinale (IBD).
I meccanismi che regolano la funzione di barriera epiteliale e la migrazione transepiteliale (TEpM) dei neutrofili polimorfonucleari (PMN) sono incompleti compresi a causa della mancanza di metodi sperimentali in vivo che consentano analisi quantitative. Qui descriviamo un robusto modello sperimentale murino che impiega un segmento intestinale esteriore di ileo o colon prossimale. L'anello intestinale esternaizzato (iLoop) è completamente vascolarizzato e offre vantaggi fisiologici rispetto agli approcci basati su camera ex vivo comunemente usati per studiare la permeabilità e la migrazione della PMN attraverso monostrati di cellule epiteliali.
Dimostriamo in dettaglio due applicazioni di questo modello: (1) misurazione quantitativa della permeabilità intestinale attraverso il rilevamento di dextrans etichettato con fluorescenza nel siero dopo iniezione intraluminale, (2) valutazione quantitativa della PMN migrata attraverso l'epitelio intestinale nel lume intestinale dopo l'introduzione intraluminale di chemioattrattanti. Dimostriamo la fattibilità di questo modello e forniamo risultati utilizzando l'iLoop nei topi privi della proteina epiteliale associata alla giunzione stretta JAM-A rispetto ai controlli. JAM-A ha dimostrato di regolare la funzione barriera epiteliale così come il PMN TEpM durante le risposte infiammatorie. I nostri risultati utilizzando iLoop confermano studi precedenti ed evidenziano l'importanza del JAM-A nella regolazione della permeabilità intestinale e del PMN TEpM in vivo durante l'omeostasi e la malattia.
Il modello iLoop fornisce un metodo altamente standardizzato per studi in vivo riproducibili di omeostasi intestinale e infiammazione e migliorerà significativamente la comprensione della funzione barriera intestinale e dell'infiammazione della mucosa in malattie come l'IBD.
Introduzione
La mucosa intestinale comprende un singolo strato di cellule epiteliali intestinali colonnari (IHC), cellule immunitarie lamina propria sottostanti e mucose muscolose. Oltre al suo ruolo nell'assorbimento dei nutrienti, l'epitelio intestinale è una barriera fisica che protegge l'interno del corpo da batteri commensali luminali, agenti patogeni e antigeni dietetici. Inoltre, IEC e le cellule immunitarie lamina propria coordinano la risposta immunitaria inducendo tolleranza o risposta a seconda del contesto e degli stimoli. È stato riferito che l'interruzione della barriera epiteliale può precedere l'insorgenza di infiammazione della mucosa patologica e contribuire alla....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida e le politiche dei National Institutes of Health e approvati dall'Institutional Animal Care & Use Committee dell'Università del Michigan.
1. Preparazione preoperatoria
NOTA: Questo metodo è stato generato impiegando topi adulti provenienti da background genetico C57BL/6, di età compresa tra 8 e 12 settimane. Tutti i topi sono stati tenuti in condizioni specifiche e specifiche esenti da agenti patogeni con accesso ad libitum al normale chow e acqua. I risultati sono stati ottenuti utilizzando C57BL/6, Jam-a - topi nulli....
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Risultati
Una rappresentazione schematica dei modelli ileal loop e pcLoop è illustrata rispettivamente nella figura 1 e nella figura 2. Le immagini anatomiche mostrano le fasi critiche della procedura, tra cui l'esternalizzazione del segmento intestinale(Figura 1B e Figura 2B),l'identificazione di una posizione appropriata per le legazioni che consente un disturbo minimo dell'apporto di sangue
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Discussione
I meccanismi responsabili della disregolazione della funzione barriera intestinale e del reclutamento delle cellule immunitarie in condizioni patologiche come l'IBD sono incompleti compresi. Qui, dettagliamo un robusto modello murino in vivo che utilizza un segmento intestinale esteriore ben vascolarizzato di ileo o colon prossimale e consente la valutazione della permeabilità intestinale, studi sulla migrazione dei neutrofili e altre applicazioni.
L'iLoop è un intervento chirurgico di non rec.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. Sven Flemming dell'Università di Wuerzburg per i suoi contributi alla creazione del modello a colon loop prossimale, Sean Watson per la gestione delle colonie di topi e Chithra K. Muraleedharan per aver contribuito all'acquisizione delle immagini del modello iLoop. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione tedesca per la ricerca/DFG (BO 5776/2-1) a KB, R01DK079392, R01DK072564 e R01DK061379 a C.A.P.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Attrezzature e materiale | |||
| BD Tamponi imbevuti di alcol | BD | 326895 | |
| BD Precision Glide Needle, 25G x 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G x 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Siringa per tubercolina senza ago | BD | 309659 | |
| Provetta da centrifuga da 15 ml | Corning | 14-959-53A | |
| Micropiastra in polistirene nero solido a 96 pozzetti | Corning FisherScientific | 07-200-592 | |
| Piatto di coltura non trattato Corning, | CLS430588 | Millipore | |
| (batuffolo di cotone), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Spugne di garza riempite di cotone, Vaporizzatore per anestesia non sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 (sistema classico, comprese le unità di riscaldamento) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Nastro adesivo colorato | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (porta aghi) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, piccolo (salvietta per tessuti) | FisherScientific | 06-666 | |
| Provette per microcentrifuga da 1,7 ml | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (tubo attivatore del coagulo di siero) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Forbici fini Moria | FST | 14370-22 | |
| Tubo a fondo tondo in polistirene da 5 ml con tappo per filtro cellulare (35 &; m maglia di nylon) | Falcon | 352235 | |
| Puralube, lubrificante oculare sterile | Dechra | 12920060 | |
| Ring Ropeps (pinza per tessuti smussati) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Seta intrecciata nera, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (pinza anatomica) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk non assorbibile rivestito sutura nera intrecciata seta taglia 3-0, 18", ago 19 mm lunghezza 3/8 cerchio taglio inverso | HenrySchein | SS694 | |
| Pinza fine per studenti, FST angolata | 91110-10 | ||
| Siringa da 10 ml PP / PE senza ago | Millipore Sigma | ||
| Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti | Corning | 3799 | |
| Tubi di alimentazione gialli per roditori 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions e tamponi | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Tampone di lisi di ammonio-cloruro-potassio (ACK) | BioWhittaker | 10-548E | |
| salina bilanciata di Hanks | Corning | 21-023-CV | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anticorpo Ly-6G anti-topo (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Anticorpo monoclonale, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Ditiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Siero fetale bovino, inattivato a caldo | R& D Systems | 511550 | |
| Fluoresceina Isotiocianato-Destrano, peso molecolare medio 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurano | Alocarbonio | 12164-002-25 | |
| Leucotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ratto purificato anti-topo CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| IFN murino ricombinante-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Ricombinante Murina TNF-&alfa; | Peprotech | 315-01A |
Riferimenti
- Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
- Jump, R. L., Levine, A. D. M....
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Ristampe e permessi
