Stereocilia Bundle Imaging con risoluzione su scala nanometrica in cellule ciliate uditive di mammiferi vivi

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per la Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), una tecnica di scansione senza contatto che consente l'imaging su scala nanometrica di fasci di stereocilia in cellule ciliate uditive vive.

Abstract

Le cellule ciliate dell'orecchio interno rilevano gli spostamenti indotti dal suono e trasducono questi stimoli in segnali elettrici in un fascio di capelli costituito da stereociglia disposte in file di altezza crescente. Quando gli stereocili vengono deviati, tirano su minuscoli (~ 5 nm di diametro) collegamenti di punta extracellulari che interconnettono stereociglia, che trasmettono forze ai canali di trasduzione meccanosensibili. Sebbene la meccanotrasduzione sia stata studiata nelle cellule ciliate vive per decenni, i dettagli ultrastrutturali funzionalmente importanti del meccanismo di meccanotrasduzione alle punte degli stereocilia (come la dinamica del collegamento della punta o il rimodellamento degli stereociglia dipendenti dalla trasduzione) possono ancora essere studiati solo nelle cellule morte con microscopia elettronica. Teoricamente, le tecniche di scansione della sonda, come la microscopia a forza atomica, hanno una risoluzione sufficiente per visualizzare la superficie degli stereociglia. Tuttavia, indipendentemente dalla modalità di imaging, anche il minimo contatto della sonda al microscopio a forza atomica con il fascio di stereociglia di solito danneggia il fascio. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'imaging al microscopio a conduttanza ionica della sonda saltellante (HPICM) di cellule ciliate uditive di roditori vivi. Questa tecnica di scansione senza contatto consente l'imaging time lapse della superficie di cellule vive con una topografia complessa, come le cellule ciliate, con risoluzione di singoli nanometri e senza entrare in contatto fisico con il campione. L'HPICM utilizza una corrente elettrica che passa attraverso la nanopipetta di vetro per rilevare la superficie della cella nelle immediate vicinanze della pipetta, mentre un sistema piezoelettrico di posizionamento 3D scansiona la superficie e genera la sua immagine. Con HPICM, siamo stati in grado di visualizzare fasci di stereocilia e collegamenti che interconnettono stereociglia nelle cellule ciliate uditive vive per diverse ore senza danni evidenti. Prevediamo che l'uso di HPICM consentirà l'esplorazione diretta dei cambiamenti ultrastrutturali nelle stereociglia delle cellule ciliate vive per una migliore comprensione della loro funzione.

Introduzione

Nonostante il fatto che i fasci di stereocilia nelle cellule ciliate uditive siano abbastanza grandi da essere visualizzati al microscopio ottico e deviati nelle cellule vive in un esperimento di patch clamp, i componenti strutturali essenziali del meccanismo di trasduzione come i collegamenti di punta potrebbero essere ripresi solo con la microscopia elettronica nelle cellule morte. Nelle cellule ciliate uditive dei mammiferi, il meccanismo di trasduzione si trova alle estremità inferiori dei collegamenti della punta, cioè alle punte delle stereociglia della fila più corta¹ e regolato localmente attraverso la segnalazione alle punte degli ster....

Protocollo

Lo studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Kentucky (protocollo 00903M2005).

1. Produzione e test delle nanopipette

1. Creare un programma nell'estrattore di micropipette per ottenere pipette con una resistenza compresa tra 200 e 400 MΩ, che corrisponde a diametri interni della punta di circa 50-70 nm. I parametri dipenderanno dall'estrattore di micropipette. Pe....

Risultati

Il protocollo presentato in questo documento può essere utilizzato per visualizzare qualsiasi cellula viva con topografia complessa. Seguendo questi passaggi, otteniamo regolarmente immagini di fasci di cellule ciliate uditive di ratto vivo (Figura 6B, D). Nonostante abbiano una risoluzione X-Y inferiore rispetto alle immagini SEM, le nostre immagini HPICM possono risolvere con successo le diverse file di stereociglia, la forma delle punte stereociglia e persino i piccoli co.......

Discussione

Per ottenere immagini HPICM di successo, gli utenti devono stabilire un sistema a basso rumore e basse vibrazioni e produrre pipette appropriate. Raccomandiamo vivamente l'uso di standard di calibrazione AFM per testare la stabilità del sistema prima di tentare di eseguire qualsiasi imaging di cellule vive. Una volta testata la risoluzione del sistema, gli utenti possono prendere in considerazione l'imaging di organi fissi di campioni Corti per familiarizzare con le impostazioni di imaging prima di tentare qualsiasi imag.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Oscilloscopio analogico	B& K Precision	2160C	Oscilloscopio analogico per il monitoraggio in tempo reale della corrente delle nanopipette e dell'approccio all'asse Z
STANDARD DI CALIBRAZIONE AFM	TED PELLA Inc	HS-100MG; HS-20MG	Questi standard di calibrazione da 100 e 20 nm vengono utilizzati per testare le prestazioni del sistema HPICM
Isolatore di vibrazioni	da banco AMETEK/TMC	Everstill K-400	Isolamento attivo dalle vibrazioni
Capillari in vetro borosilicato	World Precision Instruments (WPI)	1B100F-4	Capillari in vetro borosilicato per le nanopipette
D-(+)-Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270	Da aggiungere alla soluzione da bagno per regolare l'osmolarità
Digitalizzatore	National Instruments Corporation	PCI-6221	Digitalizzatore multicanale di ingresso/uscita
Controllo analogico veloce proporzionale-integrale-derivativo (PID) per il movimento Z	Standford Research Systems	SIM900, SIM960, SIM980	Moduli di strumentazione integrati in un controller PID esterno per il movimento Z. Richiede una risposta rapida che di solito non è implementata negli amplificatori piezoelettrici commerciali.
Gabbia di Faraday	AMETEK/TMC	Tipo II	Necessario per schermare le interferenze elettromagnetiche
Piatto con fondo in vetro	World Precision Instruments (WPI)	FD5040-100	Utilizzato come piatto per la camera per il tessuto
salina bilanciata di Hanks (HBSS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	14025092	Soluzione extracellulare (bagno)
Amplificatore per strumentazione	Brownlee L'amplificatore	Model 440	fornisce gli offset, il filtraggio e l'ingrandimento o l'attenuazione secondari necessari
Estrattore per micropipette basato su laser Estrattore per micropipette	Sutter Instrument	P-2000/G	per fabbricare le nanopipette. Il laser è necessario per le pipette al quarzo affilate.
L-15 di Lebovitz, senza rosso fenolo	Gibco, Thermo Fisher Scientific	21083027	Soluzione extracellulare (bagno)
Micromanipolatore	Scientifica	PatchStar	Utilizzato per il posizionamento "di percorso" dell'attuatore piezoelettrico
Z Microscopio	Nikon	Eclipse TS100	Microscopio ottico invertito
Amplificatore di patch	Molecular Devices	Axopatch 200B	L'amplificatore patch clamp misura la corrente attraverso l'amplificatore piezoelettrico a nanopipetta
(assi XY)	Physik Instrumente (PI)	E-500.00, E-505.00, E-509. Amplificazione C2A	e controllo PID per stadio di traslazione piezoelettrica XY
Amplificatore piezoelettrico (asse Z)	Piezosystem jena	ENT 400 & 800	Amplificatore personalizzato composto da alimentatore ENT 400 e due amplificatori ENT 800 in parallelo per raggiungere una corrente massima di 1,6 nA
Vetrini coprioggetti in plastica	TED PELLA Inc	26028	Utilizzato nella fabbricazione delle camere per il tessuto
Controller e software SICM	*Ionscope, Regno Unito (ionscope.com)	N/A	Controller personalizzato basato su SBC6711 scheda di elaborazione del segnale digitale di Innovative Integration Ltd
Elastomero siliconico (Sylgard)	World Precision Instruments (WPI)	SYLG184	Utilizzato per fissare le fibre di vetro flessibili alla camera per il tessuto
Colla siliconica	The Dow Chemical Company	734	Utilizzato per incollare le diverse parti della camera per il tessuto
Asta di tungsteno	A-M Systems	717500	Utilizzato per tenere i fili del filo interdentale nella camera per il tessuto
Nanoposizionatore piezoelettrico XY	Physik Instrumente (PI)	P-733.2DD	Stadio di traslazione XY con sensori capacitivi
Nanoposizionatore piezoelettrico Piezosystem	RA 12/24 SG	Piezoattuatore ad anello con sensore estensimetrico
*Ionscope non vende più controller SICM separati. Ci sono pochi altri sistemi commerciali:  NX12-Bio e NX10 SICM,
Park Systems, Corea e moduli SICM di ICAPPIC Limited, Regno Unito (icappic.com). Tutti questi sistemi si basano sull'originale.
Principi HPICM. Tuttavia, l'imaging dei fasci di stereociglia nelle cellule ciliate richiede diverse modifiche personalizzate che sono tecnicamente
impegnativo (o addirittura impossibile) in ambito chiuso" pronto all'uso" sistemi come Ionscope o NX12-Bio/NX10. Attualmente, ce n'è solo uno
sistema modulare (ICAPPIC) che ha la flessibilità necessaria per adattarsi a qualsiasi esperimento SICM/HPICM, ma richiede l'integrazione di alcuni componenti.

Soluzione per strumentazione Precision jena