Method Article

Ingegnerizzazione e controllo affidabili di circuiti genetici optogenetici stabili nelle cellule di mammifero

DOI:

10.3791/62109

⸱

July 6th, 2021

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il controllo affidabile delle cellule di mammifero sensibili alla luce richiede la standardizzazione dei metodi optogenetici. Verso questo obiettivo, questo studio delinea una pipeline di costruzione di circuiti genici, ingegneria cellulare, funzionamento di apparecchiature optogenetiche e saggi di verifica per standardizzare lo studio dell'espressione genica indotta dalla luce utilizzando un circuito genico optogenetico a feedback negativo come caso di studio.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un controllo affidabile dell'espressione genica nelle cellule di mammifero richiede strumenti con elevato cambiamento di piega, basso rumore e determinate funzioni di trasferimento input-to-output, indipendentemente dal metodo utilizzato. Verso questo obiettivo, i sistemi di espressione genica optogenetica hanno guadagnato molta attenzione negli ultimi dieci anni per il controllo spaziotemporale dei livelli proteici nelle cellule di mammifero. Tuttavia, la maggior parte dei circuiti esistenti che controllano l'espressione genica indotta dalla luce variano in architettura, sono espressi da plasmidi e utilizzano apparecchiature optogenetiche variabili, creando la necessità di esplorare la caratterizzazione e la standardizzazione dei componenti optogenetici in linee cellulari stabili. Qui, lo studio fornisce una pipeline sperimentale di costruzione, integrazione e caratterizzazione di circuiti genici affidabili per il controllo dell'espressione genica inducibile dalla luce nelle cellule di mammifero, utilizzando un circuito optogenetico a feedback negativo come esempio di caso. I protocolli illustrano anche come la standardizzazione delle apparecchiature optogenetiche e dei regimi di luce possa rivelare in modo affidabile le caratteristiche del circuito genico come il rumore di espressione genica e l'entità dell'espressione proteica. Infine, questo documento può essere utile per i laboratori che non hanno familiarità con l'optogenetica che desiderano adottare tale tecnologia. La pipeline qui descritta dovrebbe applicarsi ad altri circuiti optogenetici nelle cellule di mammifero, consentendo una caratterizzazione e un controllo più affidabili e dettagliati dell'espressione genica a livello trascrizionale, proteomico e, infine, fenotipico nelle cellule di mammifero.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analogamente ad altre discipline ingegneristiche, la biologia sintetica mira a standardizzare i protocolli, consentendo di utilizzare strumenti con funzioni altamente riproducibili per esplorare questioni rilevanti per i sistemi biologici1,2. Un dominio in biologia sintetica in cui sono stati costruiti molti sistemi di controllo è l'area della regolazione dell'espressione genica3,4. Il controllo dell'espressione genica può colpire sia i livelli proteici che la variabilità (rumore o coefficiente di variazione, CV = σ/μ, misurata come deviazione standard rispetto alla media), che sono caratteristiche cellulari cruciali a causa del loro ruolo negli stati cellulari fisiologici e patologici5,6,7,8. Molti sistemi sintetici in grado di controllare i livelli di proteine e il rumore4,9,10,11,12 sono stati progettati, creando opportunità per standardizzare i protocolli tra gli strumenti.

Un nuovo set di strumenti in grado di controllare le reti geniche recentemente emerse è l'optogenetica, che consente l'uso della luce per controllare l'espressione genica13,14,15,16,17. Simili ai loro predecessori chimici, i circuiti genici optogenetici possono essere introdotti in qualsiasi tipo di cellula, dai batteri ai mammiferi, consentendo l'espressione di qualsiasi gene a valle di interesse18,19. Tuttavia, a causa della rapida generazione di nuovi strumenti optogenetici, sono emersi molti sistemi che variano nell'architettura del circuito genetico, nel meccanismo di espressione (ad esempio, integrazione basata su plasmidi vs virale) e nelle apparecchiature di controllo dell'alimentazione della luce11,16,20,21,22,23,24,25 . Pertanto, questo lascia spazio alla standardizzazione delle caratteristiche optogenetiche come la costruzione e l'ottimizzazione del circuito genico, il metodo di utilizzo del sistema (ad esempio, integrazione vs espressione transitoria), strumenti sperimentali utilizzati per l'induzione e analisi dei risultati.

Per fare progressi nella standardizzazione dei protocolli optogenetici nelle cellule di mammifero, questo protocollo descrive una pipeline sperimentale per ingegnerizzare sistemi optogenetici in cellule di mammifero utilizzando un circuito genico a feedback negativo (NF) integrato nelle cellule HEK293 (linea cellulare del rene embrionale umano) come esempio. NF è un sistema ideale per dimostrare la standardizzazione poiché è altamente abbondante26,27,28 in natura, consentendo di sintonizzare i livelli proteici e di ridurre al minimo il rumore. In breve, NF consente un controllo preciso dell'espressione genica da parte di un repressore riducendo la propria espressione sufficientemente velocemente, limitando così qualsiasi cambiamento lontano da uno stato stazionario. Lo stato stazionario può essere alterato da un induttore che inattiva o elimina il repressore per consentire una maggiore produzione di proteine fino a raggiungere un nuovo stato stazionario per ogni concentrazione di induttore. Recentemente, è stato creato un sistema optogenetico NF ingegnerizzato in grado di produrre una risposta dinamica ampia di espressione genica, mantenere un basso rumore e rispondere agli stimoli luminosi consentendo il potenziale per il controllo dell'espressione genica spaziale11. Questi strumenti, noti come sintonizzatori inducibili dalla luce (LITers), sono stati ispirati da sistemi precedenti che consentivano il controllo dell'espressione genica nelle cellule viventi4,10,29,30 e sono stati stabilmente integrati nelle linee cellulari umane per garantire il controllo dell'espressione genica a lungo termine.

Qui, usando il LITer come esempio, viene delineato un protocollo per creare circuiti genici sensibili alla luce, inducendo l'espressione genica con un light plate apparatus (LPA, un hardware di induzione optogenetica)31 e analizzare le risposte delle linee cellulari ingegnerizzate e optogeneticamente controllabili a stimoli luminosi personalizzati. Questo protocollo consente agli utenti di utilizzare gli strumenti LITer per qualsiasi gene funzionale che desiderano esplorare. Può anche essere adattato per altri sistemi optogenetici con diverse architetture circuitali (ad esempio, feedback positivo, regolazione negativa, ecc.) integrando i metodi e le apparecchiature optogenetiche descritte di seguito. Simile ad altri protocolli di biologia sintetica, le registrazioni video e i protocolli optogenetici qui delineati possono essere applicati in studi su singole cellule in diverse aree, tra cui, ma non solo, la biologia del cancro, lo sviluppo embrionale e la differenziazione dei tessuti.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Progettazione del circuito genico

  1. Selezionare componenti genetiche da combinare in un singolo circuito genico/plasmide (ad esempio, motivi di sequenza di integrazione del DNA dei mammiferi32, elementi sensibili alla luce33 o geni funzionali34).
  2. Utilizzando qualsiasi software di ingegneria genetica e/o clonazione molecolare, memorizzare le sequenze di DNA per un uso e un riferimento successivi, annotare ogni sequenza ed esaminare tutte le caratteristiche necessarie (ad esempio, codoni START, sequenze regolatorie o tradotte)35.
  3. Sviluppare o adottare parti in base al progetto generale del circuito genico36. Ad esempio, per i repressori optogenetici come nei LITers11, fondere una sequenza genica che codifica per un dominio in grado di degradazione inducibile dalla luce37,38 o inattivazione della capacità di legame del DNA di un repressore39, adiacente e nel quadro del gene repressore (ad esempio, TetR)4.
    1. Per gli attivatori optogenetici, assicurarsi della presenza di un dominio attivatore40 che promuova l'espressione genica sul legame del DNA indotto dalla luce41. Per l'autoregolazione negativa o positiva, assicurarsi la presenza di un sito di legame regolatorio all'interno o a monte del promotore del gene regolatore (ad esempio, siti tetO all'interno o a monte del promotore che esprime TetR)42.
  4. Progettare i primer per l'amplificazione della sequenza di DNA o il sequenziamento del plasmide utilizzando il software di clonazione molecolare per ciascun circuito genico.
  5. Convalidare i primer computazionalmente per la costruzione di plasmidi attraverso i feasture integrati del software di clonazione molecolare (ad esempio, allineamento delle sequenze).
  6. Ordina primer oligonucleotidici dal produttore. I plasmidi costruiti e utilizzati in questo lavoro possono essere trovati nel materiale di supporto originale11 insieme ai primer progettati e utilizzati.
  7. Diluire i primer a 100 mM di concentrazione di stock in acqua a doppio distillato (ddH2O).
  8. Diluire lo stock di primer da 100 mM a 10 mM di concentrazione per la PCR.
  9. Preparare la miscela PCR con 1 μL di primer in avanti, 1 μL di primer inverso, 1 μL di DNA modello per una massa totale di 0,5-500 ng per la genomica o 0,5 pg-5 ng per il DNA plasmidico o virale, 12,5 μL di DNA polimerasi 2x master mix (o il volume che soddisfa il fattore di diluizione del produttore) e 9,5 μL di ddH2O per un volume totale di reazione di 25 μL.
  10. Incubare la miscela PCR in un termociclatore alle impostazioni appropriate a seconda dell'enzima scelto43. I cicli di reazione suggeriti includono:
    Fase 1: Un ciclo di 30 s fase iniziale di denaturazione a 95 °C.
    Fase 2: 40 cicli di 5 s di fase di denaturazione a 98 °C.
    Fase 3: Un ciclo di 30 s di fase di ricottura a 65 °C (determinato da primer progettati in precedenza).
    Passo 4: Un ciclo di 1 minuto di estensione a 72 °C (~ 1 kilobase (kb) lunghezza del frammento del modello).
    Fase 5: Un ciclo di un'estensione di 2 minuti a 72 °C.
    Tenere la reazione a 4 °C fino a quando non può essere testata tramite elettroforesi su gel. Questo protocollo varia a seconda dei reagenti utilizzati (ad esempio, polimerasi e tamponi).
  11. Ripetere il passaggio 1.9 per amplificare tutti i frammenti da utilizzare in una reazione di assemblaggio del DNA necessaria per collegare i prodotti della PCR lineare in un singolo vettore circolare del DNA.
  12. Eseguire i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1% seguito dalla purificazione delle fasce della lunghezza desiderata.
  13. Preparare la miscela principale per una reazione di assemblaggio del DNA (Tabella 1).
    NOTA: in questo esempio, il vettore madre viene diviso in due frammenti per aumentare l'efficienza dei passaggi della PCR senza causare modifiche significative al risultato complessivo dell'assemblaggio.
  14. Incubare la miscela principale di reazione di assemblaggio del DNA in un termociclatore a 50 °C per 1 ora (se non diversamente specificato nel protocollo del reagente di assemblaggio del DNA) e conservare la reazione a 4 °C per utilizzare il prodotto di reazione per la trasformazione batterica.
  15. Impostare la trasformazione batterica (chimica o elettroporazione) utilizzando cellule competenti di E. coli (Escherichia coli) e il corrispondente protocollo di trasformazione batterica. Dopo la trasformazione, utilizzare le piastre di agar batterico Luria-Bertani (LB) contenenti il marcatore di selezione batterica scelto (ad esempio, ampicillina) per placcare la miscela di trasformazione. Incubare le piastre a 37 °C durante la notte44.
  16. Controllare le piastre il giorno seguente. Per inoculare le colonie, raccogliere le singole colonie dalle piastre e risospese in un brodo LB liquido con il corrispondente marcatore di selezione batterica nei tubi di coltura. Incubare in un incubatore shaker a 37 °C, 300 giri/min durante la notte.
  17. Eseguire il protocollo di preparazione del plasmide per estrarre il DNA del plasmide dalla coltura batterica.
  18. Convalidare il circuito in due passaggi. In primo luogo, eseguire una digestione di prova utilizzando enzimi di restrizione come verifica grezza per vedere se il prodotto plasmidico approssimativo è stato ottenuto. In secondo luogo, se la digestione del test è superata / confermata, sottoporre il plasmide a un impianto di sequenziamento Sanger (o processo utilizzando l'attrezzatura disponibile) per ottenere la sequenza precisa del DNA per confrontarla successivamente con la sequenza prevista nel software di progettazione.
    1. Per eseguire la digestione di prova, selezionare almeno due enzimi di restrizione che producono almeno due frammenti, in base al software di clonazione molecolare utilizzato. Una volta selezionati gli enzimi, preparare i campioni di prova aggiungendo 1 μL di ciascun enzima, 5 μL del DNA generato e 13 μL di acqua con sali e tamponi appropriati a seconda degli enzimi utilizzati. Incubare la reazione a 37 °C per 1 ora, o come suggerisce il produttore dell'enzima. Eseguire i prodotti di digestione di prova su un gel di agarosio all'1% e determinare se le bande sono corrette.
      NOTA: se le bande sono corrette, procedere alla sequenziazione.
    2. Per eseguire il sequenziamento, generare primer basati sul DNA memorizzato nel software in modo che le regioni di ricottura dei primer siano a circa 500 bp (coppie di basi) di distanza e coprano il frammento di interesse (componente del circuito genico) o il plasmide completo. Diluire i primer con acqua pura priva di nucleasi (NF-H2O) fino a una concentrazione di 10 mM. Preparare i campioni di sequenziamento aggiungendo 1 μL di 10 ng/μL di DNA, 1 μL di primer e 8 μL di NF-H2O a un tubo da 0,2 mL. Ripeti questo per ogni primer.
      NOTA: quando i campioni vengono preparati, consegnarli presso l'impianto di sequenziamento e confrontare i risultati con la sequenza plasmidica utilizzando un software di clonazione molecolare.
  19. In questa fase, generare circa 100-1000 ng / μL di campione di DNA per integrare i plasmidi contenenti circuiti genici nella linea cellulare appropriata.

2. Ingegneria della linea cellulare stabile

  1. Ordinare una linea cellulare di mammiferi progettata per la rapida generazione di sottolinee stabili che garantiscano un'espressione di alto livello della proteina di interesse da un vettore di espressione dei mammiferi. Il tipo di cella e la facilità di ingegnerizzazione della linea cellulare possono essere variabili a seconda di ciò che gli utenti preferiscono o mirano a raggiungere.
    1. Ad esempio, se gli utenti preferiscono l'ingegneria della linea cellulare con passaggi intermedi minimi, ordinare le cellule che contengono un singolo sito di integrazione stabile (ad esempio, FRT) in un locus genomico trascrizionalmente attivo. Se si preferisce un'ingegneria cellulare più sfumata, creare siti di integrazione nelle posizioni preferite utilizzando strumenti di ingegneria genetica come CRISPR / Cas9.
  2. Coltiva cellule al 5% di CO2 in aria umidificata a 37 °C. Regolare le condizioni di crescita in base alle esigenze per il tipo di cella.
  3. Trasfettate i circuiti genici progettati sopra nelle cellule desiderate ottenute dai passaggi precedenti per iniziare un processo di generazione stabile della linea cellulare. Per raggiungere questo obiettivo, utilizzare una miscela di liposomi45 del DNA del circuito genico con una ricombinasi appropriata (ad esempio, Flp-ricombinasi per la ricombinazione Flp-FRT) o attraverso altri metodi come l'elettroporazione.
  4. Due giorni dopo la trasfezione, dividere le cellule al 25% di confluenza.
  5. Sei ore dopo aver diviso le cellule, iniziare la selezione antibiotica scambiando il supporto con un mezzo fresco contenente 50 μg / mL di antibiotico igromicina (o un altro agente antibiotico corrispondente al gene di resistenza agli antibiotici dei mammiferi scelto durante la costruzione del plasmide).
    NOTA: Ci sono una varietà di geni di resistenza agli antibiotici dei mammiferi utilizzati nella costruzione del circuito genico, ognuno dei quali ha una curva di uccisione diversa. Pertanto, qualunque sia il gene di resistenza agli antibiotici dei mammiferi scelto per la costruzione del circuito, una curva di uccisione adeguata dovrebbe essere studiata nelle cellule di interesse. Questo passaggio garantisce che le cellule contenenti il carico utile del circuito genico siano arricchite mentre quelle senza il sistema vengono uccise.
  6. Lasciare che le cellule crescano nel mezzo di selezione degli antibiotici, passare a mezzi freschi ogni 2-3 giorni fino a quando il piatto o il pallone ha qualche dozzina di focolai. Passare colture aderenti quando sono nella fase di log prima che raggiungano la confluenza.
  7. Una volta che ci sono abbastanza focolai, tripsinizzare le cellule con 1 ml di tripsina allo 0,25%, EDTA allo 0,1% nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) senza calcio, magnesio e bicarbonato di sodio per diversi minuti. Neutralizzare la tripsina con mezzi freschi e passare tutte le cellule in un contenitore fresco.
  8. Una volta che le cellule nel contenitore fresco sono confluenti all'80% -100%, congelale in un mix di 45% di vecchi supporti, 45% di supporti freschi e 10% dmSO. Trasferire le cellule rimanenti in un tubo sterile ed eseguire lo smistamento a singola cellula per isolare le cellule monoclonali in una piastra a 96 pozzetti.
  9. Circa 2-3 settimane dopo lo smistamento monoclonale, i pozzetti all'interno della piastra a 96 pozzetti dovrebbero avere focolai. Quando circa il 50% -60% confluisce, dividere le cellule in una piastra a 12 pozzetti.
  10. Una volta che la piastra a 12 pozzetti è confluente all'80%-100%, divisa in un pallone T-25 trattato con coltura tissutale. Una volta che le cellule nel pallone T-25 sono confluenti all'80% -100%, congelare le cellule e mantenere un passaggio per la caratterizzazione e il test delle linee cellulari monoclonali.
    1. Caratterizzare le linee cellulari monoclonali mediante microscopia e saggi di citometria a flusso per riportare profili di espressione genica basati sulla produzione di reporter fluorescenti indotti. Verificare la produzione di proteine funzionali tramite l'etichettatura degli anticorpi fluorescenti e il test di immunofluorescenza. Testare l'induzione dell'espressione genica a livello trascrizionale tramite PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Convalidare la sequenza genetica e l'accuratezza dell'integrazione tramite il sequenziamento locale e dell'intero genoma dei cloni.

3. Saggi di induzione dell'apparato a piastre leggere

  1. Costruire un dispositivo LPA31,46 da utilizzare per l'induzione luminosa di celle ingegnerizzate. In breve, diversi passaggi generali sono cruciali per la creazione di LPA da utilizzare per il controllo dell'espressione genica. Questi includono la stampa 3D di componenti del telaio LPA, la costruzione del circuito stampato, la programmazione del circuito tramite programmatore di microcontrollori, l'assemblaggio dei componenti in un LPA finale, la programmazione della scheda di memoria tramite software IRIS e la calibrazione del dispositivo finito. Per una spiegazione più approfondita, fare riferimento ai riferimenti di cui sopra.
    1. Stampare le parti 3D come delineato in Gerhardt et al. (2016 e 2019)31,46.
    2. Assemblare il circuito stampato come delineato in Gerhardt et al. (2016 e 2019)31,46.
    3. Aggiungere il firmware al circuito LPA assemblato utilizzando il programmatore di microcontrollori come descritto in Gerhardt et al. (2016 e 2019) 31,46.
    4. Combina parti stampate in 3D e il circuito assemblato come delineato in Gerhardt et al. (2016 e 2019) 31,46. Ciò include l'acquisizione della piastra di montaggio, del circuito stampato, del distanziatore a LED (diodi emettitori di luce), dell'adattatore per piastre, di una piastra a 24 pozzetti, di un coperchio della piastra, dei bulloni di montaggio e dei dadi alari e dei componenti impilabili, come mostrato nel video filmato e nella Figura 2.
    5. Per la programmazione della scheda di memoria e la calibrazione del dispositivo, attenersi alla procedura descritta di seguito.
  2. Utilizzare il software IRIS disponibile sul sito Web Tabor Lab47 per programmare una scheda SD per il Light Plate Apparatus (LPA)31 ed esplorare le condizioni di luce appropriate necessarie per iniziare un esperimento optogenetico.
    NOTA: Il software IRIS è un'applicazione web-based per la programmazione dell'hardware elettronico optogenetico, noto come LPA, sviluppato dal Tabor Lab. Il software consente la programmazione dei relativi valori IRIS che controllano i singoli diodi emettitori di luce (LED) in ciascun pozzetto dell'hardware LPA.
  3. Scegliere l'opzione a discesa LPA (4 x 6), quindi fare clic sull'approccio di illuminazione appropriato (Stato stazionario, Dinamico, Avanzato).
    NOTA: Per questo manoscritto, tutti i saggi si concentreranno sugli esempi di stato stazionario. Tuttavia, gli esempi di impostazione avanzata possono essere utilizzati per la durata degli impulsi e i regimi del ciclo di lavoro.
  4. Scegli se i LED superiori o inferiori saranno illuminati inserendo valori nelle celle corrispondenti ai pozzetti della piastra. Per gli LPA utilizzati in questo lavoro, i LED blu posti in prima posizione sono stati utilizzati in tutti gli esperimenti. Ogni LED, una volta programmato, può fornire un'esposizione continua alla luce con un'intensità luminosa costante. Il software IRIS consente di programmare 4096 livelli di intensità.
  5. Una volta scelte le posizioni dei LED, immettere i valori di intensità per il contorno sperimentale desiderato. Ad esempio, immettere 8 diverse intensità luminose (o durate di impulso o cicli di lavoro) con tre repliche tecniche per piastra (Tabella 2). G.s. si riferisce alle unità in scala di grigi, i valori di misurazione del livello di intensità luminosa utilizzati per la programmazione LPA nel software IRIS.
    1. Quando si progettano file sperimentali IRIS, tenere presente gli effetti dei bordi dai pozzetti adiacenti sul dispositivo LPA, la tossicità della luce derivante dall'aumento delle intensità di esposizione alla luce blu e la determinazione del tipo di dose-risposta desiderata (ad esempio, monotonica vs non monotona).
    2. Se gli utenti programmano le celle nell'LPA in ordine ascendente/decrescente di un particolare parametro di luce (ad esempio, intensità), i pozzetti possono produrre effetti di bordo della diafonia della luce o persino calore che può influenzare i pozzi adiacenti. Ciò può inavvertitamente influenzare il risultato dei risultati misurati quando gli esperimenti sono completi. Per alleviare questo problema, gli utenti possono implementare una matrice di randomizzazione sul software IRIS per rimescolare le posizioni dei pozzi, riducendo al minimo gli effetti dei bordi. Un esempio è descritto nei risultati rappresentativi riportati di seguito (Figura 4A-B).
    3. Inoltre, è stato scoperto che intensità più elevate di luce blu interferiscono con la crescita e la vitalità cellulare48. Pertanto, per mitigare la tossicità della luce, è importante produrre una curva di intensità luminosa, durata dell'impulso o risposta del ciclo di lavoro a seconda della modalità studiata.
      1. Ad esempio, programmare 8 valori di intensità luminosa con tre repliche per piastra da 24 pozzetti, con un intervallo da nessuna luce a un'intensità massima dell'LPA. Quindi, eseguire questi campioni su un citometro a flusso con un gate SSC-FSC o una macchia viva come lo ioduro di propidio per quantificare la sopravvivenza delle cellule della popolazione (cellule viventi rispetto agli eventi totali tra cui cellule morte / detriti cellulari) a ciascun valore di luce.
      2. Quindi, determinare la quantità ideale di sopravvivenza della popolazione per la configurazione sperimentale, poiché qualsiasi stimolo può influire negativamente sulla proliferazione, sull'espressione genica o sulla sopravvivenza (ad esempio, impostando la sopravvivenza cellulare dell'80% come compromesso appropriato). Ad esempio, in questo lavoro, una volta calibrato, l'intensità non superava le unità di 3000 g.s. (~3/4 l'intensità massima del dispositivo LPA). Un esempio di questo è descritto nei Risultati rappresentativi di seguito.
    4. Oltre a limitare i valori di luce a causa della tossicità, gli utenti potrebbero voler limitare i valori di luce per caratterizzare una particolare parte della dose-risposta, come l'intervallo della risposta monotona.
      1. Per raggiungere questo obiettivo, inizialmente eseguire la scansione di un'ampia gamma di intensità luminose, durate di impulsi o cicli di lavoro a seconda della modalità analizzata nel determinare la dose-risposta desiderata (Tabella 2) per restringere il regime di luce di interesse, ad esempio, dove l'espressione genica è correlata positivamente con l'aumento dei valori di luce per una dose-risposta monotona.
      2. Per determinare l'intervallo di luce di interesse, programmare un singolo LPA con un massimo di 24 pozzetti di diversa intensità / durata dell'impulso / ciclo di lavoro / ecc. o più pozzi (ad esempio, 48, 72, 96, ecc.) a seconda che più LPA siano calibrati per fornire quantità di luce equivalenti e procedere con il lavoro di coltura cellulare o i saggi descritti di seguito. Pertanto, iniziare la caratterizzazione di un sistema optogenetico con un ampio intervallo di dosi di stimoli luminosi per determinare l'intervallo che dà l'espressione genica desiderata e successivamente eseguire esperimenti in quell'intervallo di dose raffinato.
      3. Ad esempio, in questo lavoro, una volta che 3000 g.s. unità sono state determinate come soglia per l'intensità della luce tossica; questa soglia è stata utilizzata come limite superiore della luce per i saggi descritti di seguito (ad esempio, immunofluorescenza).
        NOTA: I passaggi precedenti sono indipendenti dalla calibrazione ottica dell'LPA e si riferiscono a una calibrazione a livello molecolare per ciascun sistema optogenetico.
  6. Una volta programmati i valori di intensità luminosa appropriati in IRIS, inserire una scheda di memoria con la presa USB 3.0 nell'LPA per scaricare e trasferire i file.
  7. Se la calibrazione dell'LPA è completa31, procedere al lavoro di coltura cellulare per l'avvio del saggio di induzione della luce. Se la calibrazione non è stata eseguita, calibrare l'LPA utilizzando un metodo di analisi dell'immagine (passaggi 3.7.1-3.7.3) una volta programmato l'LPA con il programmatore del microcontrollore.
    1. Programmare brevemente l'LPA per avere lo stesso livello IRIS descritto da Gerhardt et al. (2016)31.
      NOTA: Per la calibrazione, l'LPA è stato programmato per avere un valore di 2000 g.s.
    2. Una volta programmato il dispositivo con la scheda di memoria e premuto il pulsante di ripristino (pulsante fisico sull'LPA), acquisire un'immagine dell'intero dispositivo (ad esempio, imager della stazione gel, dispositivo scanner, ecc.). Per la calibrazione, acquisire due immagini con il dispositivo ruotato di 180°.
    3. Quindi, utilizzare un software open source progettato da Gerhardt et al. (2016) 31 per mostrare la variabilità dell'intensità del LED sulla piastra LPA e calcolare i valori di compensazione dei LED per rendere l'intensità uguale tra i pozzi. Un esempio di questo è descritto nei risultati rappresentati di seguito (Figura 3). Una volta completata questa calibrazione, procedere al lavoro di coltura cellulare per l'avvio del saggio di induzione della luce.
  8. Ottenere palloni di cellule monoclonali ingegnerizzate dalla sezione precedente per studiare gli effetti di induzione della luce sull'espressione genica.
  9. Rimuovere il vecchio supporto dal pallone.
  10. Aggiungere 1 mL di tripsina alle cellule e incubare per 5 minuti.
  11. Dopo 5 minuti, neutralizzare la tripsina aggiungendo 4 mL di terreno di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM o altri mezzi desiderati) integrato con le sostanze chimiche necessarie (questo lavoro ha utilizzato 50 μg / mL di igromicina, soluzione di penicillina / streptomicina all'1%, siero bovino fetale al 10%, FBS).
  12. Aggiungere ~ 75.000 celle per pozzetto in una piastra nera a 24 pozzetti in un volume totale di 500 μL. Il numero di cellule seminate può variare a seconda della durata dell'esperimento desiderato e del tipo di cellula utilizzata.
    NOTA: Inoltre, si noti che la densità di semina cellulare influisce sul mantenimento della coltura e potenzialmente sulla durata dell'esperimento. Partire da un numero inferiore di cellule per pozzo garantisce una durata temporale più lunga prima che la coltura raggiunga la confluenza. Inoltre, il tipo di componenti optogenetiche integrate nei circuiti genici di interesse influenzerà quando l'espressione genica raggiunge uno stato stazionario e quindi influenzerà la durata degli esperimenti. Altri fattori che possono essere considerati sono i tassi di crescita specifici della linea cellulare, la composizione dei media e gli effetti di crescita condizionali (cioè la luce).
  13. Dopo la placcatura, posizionare le cellule in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 per consentire loro di stabilirsi per 2-6 ore.
  14. Dopo l'incubazione, trasferire le cellule in un cappuccio di coltura di tessuto, rimuovere il coperchio di plastica e aggiungere una striscia di lamina adesiva nella parte superiore della piastra (Figura 2D). Questo passaggio consente un trasferimento minimo di luce tra i pozzetti, poiché la parte superiore e i lati dei pozzetti sono rivestiti e la luce può ora entrare solo dal fondo del pozzo in cui è posizionato il LED.
  15. Posizionare la piastra nelle parti 3D montate dell'LPA. Quindi, coprire la piastra con il coperchio LPA stampato in 3D, che si adatta alle viti del dispositivo su ogni angolo.
  16. Collegare il dispositivo alla fonte di alimentazione e premere il pulsante di ripristino sul dispositivo LPA per assicurarsi che vengano applicate le impostazioni dell'esperimento LPA aggiornate.
  17. Incubare le cellule all'interno del sistema sperimentale per un periodo di tempo appropriato, a seconda della densità di semina originale, della velocità di crescita specifica della linea cellulare e delle condizioni di crescita. In questo esempio, le linee cellulari sono state indotte per 3 giorni ininterrottamente affinché l'espressione genica raggiungesse uno stato stazionario. Tuttavia, va notato che molti sistemi optogenetici (ad esempio, VVD) possono raggiungere l'espressione genica allo stato stazionario molto prima (ad esempio, 24 ore), e quindi i tempi di induzione sperimentale possono essere ridotti o prolungati secondo necessità.
  18. Alla fine dell'esperimento di induzione della luce, utilizzare i campioni per uno dei seguenti quattro saggi per caratterizzare le linee cellulari ingegnerizzate (sezioni 4-7).

4. Microscopia a fluorescenza di cellule ingegnerizzate indotte dalla luce

  1. 24-72 ore dopo l'induzione, rimuovere le cellule nell'LPA dall'incubatore e metterle in una cappa di coltura tissutale.
  2. Rimuovere la striscia di alluminio e lasciare riposare la piastra per 1-2 minuti. Ciò impedisce la formazione di condensa sul coperchio di plastica, se posizionato immediatamente sulla piastra.
  3. Dopo 1-2 minuti di seduta, rimettere il coperchio di plastica originale sul piatto.
  4. Immagine delle cellule con il microscopio a contrasto di fase o a fluorescenza appropriato.
  5. A seconda dello strumento, regolare il tempo di esposizione, l'intensità della sorgente luminosa e il guadagno per la visualizzazione delle celle ingegnerizzate. In questo esperimento, sono stati applicati i seguenti parametri: 50 ms per il tempo di esposizione alla sorgente luminosa FITC/GFP (proteina fluorescente verde) e 1-5 ms per il tempo di esposizione a contrasto di fase al 100% di intensità per ciascuno.
    NOTA: Va notato che i tempi di esposizione ottimali, i livelli di guadagno e le intensità delle sorgenti luminose sono spesso derivati empiricamente dall'esperienza di questo lavoro per ridurre al minimo la sovrasaturazione nel reporter di fluorescenza, ridurre al minimo il danno cellulare e acquisire immagini adeguate per l'analisi qualitativa e quantitativa. Quando si determinano i livelli di ciascuno di questi parametri, gli aspetti da tenere a mente includono la massimizzazione dei rapporti segnale-rumore, la minimizzazione della fototossicità, la minimizzazione della sovrasaturazione dei segnali di fluorescenza e l'aumento della capacità di amplificare i deboli segnali di fluorescenza.
    1. Ottimizzare questi parametri grossolanamente ad-hoc; tuttavia, i precedenti valori sperimentali (ad esempio, l'intensità della sorgente luminosa che causa la sovrasaturazione del reporter di fluorescenza) possono guidare le future impostazioni sperimentali, se applicabile. Ad esempio, le impostazioni di guadagno, i tempi di esposizione e i valori iniziali dell'intensità luminosa di un circuito (LITer1.0) o di una configurazione sperimentale (ad esempio, intensità luminosa) possono essere utilizzati come punto di partenza quando si passa a un circuito genico simile ma diverso (LITer2.0)11 o a una diversa modalità di luce (ad esempio, ciclo di lavoro leggero).
  6. Semplifica l'imaging delle lastre tramite un modello di coordinate programmato nel software di microscopia consentendo all'intera dimensione della lastra (ad esempio, 24 pozzetti) di avere un'acquisizione automatica delle immagini da più posizioni di immagine per pozzetto.

5. Citometria a flusso di cellule ingegnerizzate indotte dalla luce

  1. 24-72 ore dopo l'induzione, rimuovere le cellule dall'LPA nell'incubatore o dal microscopio dopo l'imaging e posizionarle nella cappa di coltura tissutale.
  2. Se rimosso direttamente dall'LPA, rimuovere la striscia di alluminio e lasciare riposare la piastra per un minuto o due.
  3. Aspirare il supporto da ciascun pozzo (dell'intera piastra a 24 pozzetti se vengono utilizzati tutti i pozzetti).
  4. Aggiungere 100 μL di tripsina allo 0,25% a ciascun pozzetto, coprire la piastra con un coperchio di plastica e riposizionarla nell'incubatrice.
  5. Lasciare le cellule indisturbate nell'incubatrice per 5 minuti.
  6. Dopo 5 minuti, rimuovere la piastra e restituirla al cappuccio della coltura del tessuto.
  7. Neutralizzare bene ogni tripsinizzato con 400 μL di DMEM.
  8. Etichettare un tubo a fondo tondo in polistirene da 5 ml con filtro cellulare (o tubo citometrico a flusso appropriato che può essere filtrato per rimuovere grandi ciuffi di cellule non completamente tripsinate) con un nome corrispondente a ciascun pozzetto.
  9. Utilizzare una pipetta P1000 per pipettare il contenuto di ciascun pozzetto su e giù 6-8 volte per rompere i grumi cellulari e creare campioni unicellulari per la citometria a flusso49.
  10. Trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto (~500 μL) ai tubi etichettati con il filtro.
  11. Portare le cellule allo strumento di citometria a flusso appropriato con laser delle lunghezze d'onda corrette (può portare tubi con cellule su o fuori dal ghiaccio).
    NOTA: Il citometro a flusso utilizzato in questo lavoro faceva parte di una struttura centrale situata presso l'ospedale universitario.
  12. Creare un gate a dispersione diretta e laterale (FSC e SSC, rispettivamente) per catturare le singole cellule delle dimensioni e della granularità appropriate per escludere detriti e grumi cellulari sul software di citometria a flusso.
  13. Una volta impostato il cancello, cattura circa 10.000 celle con il cancello appropriato. Regola questo numero in base alla quantità di dati cellulari che gli utenti stanno cercando. Ripetere per ogni tubo contenente le cellule dell'esperimento.
  14. Una volta completato l'esperimento, importare i dati nel software di dati di citometria a flusso disponibile per l'analisi.
  15. Creare un gate FSC-SSC (come prima durante l'acquisizione) e applicarlo a ciascun batch di dati sperimentali. Un pozzo di riferimento della popolazione cellulare non indotta viene utilizzato per creare questo gate in questo manoscritto, ma esistono altre metriche per la creazione di gate, come le porte basate sulla densità.
  16. Con le condizioni sperimentali chiuse con un gate FSC-SSC, tracciare i dati della citometria a flusso come istogrammi o rappresentare in altri modi per illustrare i modelli di espressione ottenuti. In questo esperimento, la fluorescenza è stata catturata dai canali GFP/FITC o PE/TexasRed.

6. Estrazione dell'RNA e PCR quantitativa dei componenti del circuito genico

  1. 24-72 ore dopo l'induzione, rimuovere le cellule dall'LPA nell'incubatore o dal microscopio dopo l'imaging e posizionarle nella cappa di coltura tissutale.
  2. Se rimosso direttamente dall'LPA, rimuovere la striscia di alluminio e lasciare riposare la piastra per un minuto o due.
  3. Aspirare il supporto da ciascun pozzo (dell'intera piastra a 24 pozzetti se vengono utilizzati tutti i pozzetti).
  4. Procedere all'estrazione dell'RNA dalle cellule utilizzando l'apposito kit di estrazione dell'RNA.
  5. Una volta completata l'estrazione dell'RNA, eseguire una reazione di trascrizione inversa di ciascun campione (Tabella 3).
  6. Inoltre, eseguire la PCR quantitativa di ciascun campione (Tabella 4). Utilizzare una DNA polimerasi e un protocollo associato per impostare le reazioni PCR. Per questo passaggio, impostare una reazione multiplexata con un gene di pulizia e un gene di interesse o creare reazioni separate. In questo esempio, sono stati sondati i livelli di GFP, KRAS e gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH). Dopo aver completato l'esperimento qRT-PCR, procedere con l'analisi tramite il software disponibile per illustrare il cambiamento di piega del circuito genico a livello di RNA.

7. Immunofluorescenza dei componenti del circuito genico

  1. Utilizzare un bagno di ghiaccio o un congelatore per raffreddare il metanolo.
  2. 24-72 ore dopo l'induzione, rimuovere le cellule dall'LPA nell'incubatore o dal microscopio dopo l'imaging e posizionarle nella cappa di coltura tissutale.
  3. Se rimosso direttamente dall'LPA, rimuovere la striscia di alluminio e lasciare riposare la piastra per 1-2 minuti.
  4. Aspirare il supporto da ciascun pozzo (dell'intera piastra a 24 pozzetti se vengono utilizzati tutti i pozzetti).
  5. Aggiungere 100 μL di tripsina allo 0,25% a ciascun pozzetto, coprire la piastra con un coperchio di plastica e riposizionarla nell'incubatrice.
  6. Lasciare le cellule indisturbate nell'incubatrice per 5 minuti.
  7. Dopo 5 minuti, rimuovere la piastra e restituirla al cappuccio della coltura del tessuto.
  8. Neutralizzare bene ogni tripsinizzato con 400 μL di DMEM.
  9. Etichettare i tubi mini-centrifuga con i nomi corrispondenti a ciascun pozzetto.
  10. Utilizzare una pipetta P1000 e pipetta il contenuto di ciascun pozzetto su e giù 6-8 volte per rompere i grumi cellulari.
  11. Trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto (~500 μL) ai tubi etichettati.
  12. Centrifugare le celle per 5 min a 400 x g.
  13. Una volta completato, scartare il surnatante e spostare i campioni in una cappa aspirante chimica.
  14. Risospesso le cellule (utilizzare una pipetta P1000 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari) in 750-1000 μL di paraformaldeide al 4% (diluita in soluzione salina tamponata con fosfato, PBS).
  15. Lasciare riposare le celle per 15 minuti a temperatura ambiente.
  16. Dopo l'incubazione, aggiungere 750-1000 μL di PBS. Pipetta su e giù più volte.
  17. Centrifugare le celle per 5 min a 400 x g.
  18. Una volta completato, scartare il surnatante e spostare i campioni in una cappa aspirante chimica.
  19. Risospesciare le celle (utilizzare una pipetta P1000 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari) in 750-1000 μL di metanolo ghiacciato.
  20. Lasciare riposare le celle per 30 minuti sul ghiaccio o in un congelatore a -20 °C.
  21. Dopo l'incubazione, aggiungere 750-1000 μL di PBS. Pipetta su e giù più volte.
  22. Centrifugare le celle per 5 min a 400 x g.
  23. Una volta completato, scartare il surnatante e spostare i campioni in una cappa aspirante chimica.
  24. A seconda del tipo di anticorpi utilizzati, modificare il protocollo da questo punto in avanti. Seguire i passaggi 7.24.1-7.24.14 o 7.24.15-7.24.22.
    1. Se si utilizza un anticorpo primario e secondario, risospesciare le cellule utilizzando una pipetta P1000 / P200 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari in 100 μL di anticorpo primario. In questo caso, è stata effettuata una diluizione di 1:800 per gli anticorpi di riserva, tra cui l'anticorpo KRAS o l'anticorpo ERK, ed è stato permesso di rimanere seduto per 1 ora a temperatura ambiente. Gli anticorpi sono stati diluiti in un tampone di incubazione costituito da 1x PBS con 0,5 g di BSA.
      NOTA: Determinare empiricamente l'esatta diluizione dell'anticorpo creando una curva standard di diluizioni anticorpali rispetto all'antigene di interesse.
    2. Dopo aver aggiunto gli anticorpi, coprire i tubi con un foglio per evitare effetti di luce sugli anticorpi marcati.
    3. Dopo l'incubazione, aggiungere 750-1000 μL del tampone di incubazione. Pipetta su e giù più volte.
    4. Centrifugare le celle per 5 min a 400 x g.
    5. Una volta completato, scartare il surnatante e spostare i campioni in una cappa aspirante chimica.
    6. Risospese le cellule usando una pipetta P1000 / P200 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari in 100 μL di anticorpi secondari. In questo caso, le cellule sono state risospese in anticorpi secondari da 100 μL ad una diluizione di 1:800 per l'anticorpo KRAS o 1:2000 per l'anticorpo ERK e lasciate riposare per 30 minuti a temperatura ambiente. Simile agli anticorpi primari, diluire gli anticorpi secondari nel tampone di incubazione come descritto sopra. Determinare le diluizioni degli anticorpi secondari sulla base dei risultati empirici di una curva standard.
    7. Dopo aver aggiunto gli anticorpi, coprire i tubi con un foglio per evitare effetti di luce sugli anticorpi etichettati.
    8. Dopo l'incubazione, aggiungere 750-1000 μL del tampone di incubazione. Pipetta su e giù più volte.
    9. Centrifugare le celle per 5 min a 400 x g.
    10. Una volta completato, scartare il surnatante e spostare i campioni in una cappa aspirante chimica.
    11. Risospesciare le celle usando una pipetta P1000 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari in 500 μL di PBS.
    12. Trasferire l'intero contenuto di ciascun tubo (~500 μL) ai tubi etichettati con filtri.
    13. Portare le cellule a strumenti di citometria a flusso appropriati con laser delle lunghezze d'onda corrette (può portare tubi con cellule su o fuori dal ghiaccio).
      NOTA: Va notato che avere diversi controlli è importante per progredire con la misurazione della citometria a flusso e l'analisi dell'espressione genica delle cellule ingegnerizzate. Ad esempio, avere cellule completamente non macchiate, cellule colorate con solo anticorpi primari e cellule colorate con anticorpi secondari da soli può essere utile per confrontare i risultati con i segnali di fondo degli anticorpi.
    14. Successivamente, procedere con l'analisi come descritto nella sezione 5.
    15. Se si utilizza solo un anticorpo primario, risospesare le cellule utilizzando una pipetta P1000 / P200 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari in 100 μL di anticorpo primario marcato. Determinare la diluizione anticorpale appropriata e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Determinare empiricamente la diluizione anticorpale dalla curva standard.
    16. Dopo aver aggiunto gli anticorpi, coprire i tubi con un foglio per evitare effetti di luce sugli anticorpi marcati.
    17. Dopo l'incubazione, aggiungere 750-1000 μL del tampone di incubazione. Pipetta su e giù più volte.
    18. Centrifugare le celle per 5 min a 400 x g.
    19. Risospesciare le celle usando una pipetta P1000 e una pipetta su e giù 6-8 volte in ciascun tubo per rompere i grumi cellulari in 500 μL di PBS.
    20. Trasferire l'intero contenuto di ciascun tubo (~500 μL) in tubi etichettati con filtri.
    21. Portare le cellule a strumenti di citometria a flusso appropriati con laser delle lunghezze d'onda corrette (può portare tubi con cellule su o fuori dal ghiaccio).
      NOTA: Va notato che avere diversi controlli è importante per progredire con la misurazione della citometria a flusso e l'analisi dell'espressione genica delle cellule ingegnerizzate. Avere cellule completamente non macchiate e cellule macchiate con anticorpi primari da soli sono utili per confrontare i risultati con i segnali di fondo degli anticorpi.
    22. Da questo punto, procedere con l'analisi come descritto nella sezione 5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'assemblaggio del circuito genico e la generazione di linee cellulari stabili all'interno di questo articolo erano basati su cellule HEK-293 modificate commerciali contenenti un sito FRT trascrizionalmente attivo e singolo stabile (Figura 1). I circuiti genici sono stati costruiti in vettori che avevano siti FRT all'interno del plasmide, consentendo l'integrazione Flp-FRT nel genoma cellulare HEK-293. Questo approccio non è limitato alle cellule Flp-In, poiché i siti FRT possono essere aggi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I lettori di questo articolo possono ottenere informazioni sui passaggi vitali per caratterizzare i circuiti genici optogenetici (così come altri sistemi di espressione genica), tra cui 1) progettazione, costruzione e convalida del circuito genico; 2) ingegneria cellulare per l'introduzione di circuiti genici in linee cellulari stabili (ad esempio, ricombinazione Flp-FRT); 3) induzione delle celle ingegnerizzate con una piattaforma light-based come l'LPA; 4) caratterizzazione iniziale di saggi di induzione della luce med...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare il laboratorio Balázsi per commenti e suggerimenti, il Dr. Karl P. Gerhardt e il Dr. Jeffrey J. Tabor per averci aiutato a costruire il primo LPA e il Dr. Wilfried Weber per aver condiviso i plasmidi LOV2-degron. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health [R35 GM122561 e T32 GM008444]; Il Centro Laufer per la Biologia Fisica e Quantitativa; e una National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship. Finanziamento per la tariffa di accesso aperto: NIH [R35 GM122561].

Contributi dell'autore: M.T.G. e G.B. hanno ideato il progetto. M.T.G., D.C. e L.G., eseguirono gli esperimenti. M.T.G., D.C., L.G. e G.B. analizzarono i dati e prepararono il manoscritto. G.B. e M.T.G. hanno supervisionato il progetto.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provette per PCR da 0,2 mLEppendorf951010006per l'esecuzione della PCR
0,25% Tripsina EDTA 1XMT25053CIThermo Fisher Scientificper la scissione e la raccolta di cellule di mammifero
0,5-10 &; L Pipetta a volume regolabileEppendorf3123000020strumento utilizzato per le reazioni di pipettaggio
100-1000 μ L Pipetta a volume regolabileEppendorf3123000039strumento utilizzato per le reazioni di pipettaggio
20-200 μ L Pipetta a volume regolabileEppendorf3123000055strumento utilizzato per le reazioni di pipettaggio
2-20 μ L Pipetta a volume regolabileEppendorf3123000039strumento utilizzato per le reazioni di pipettaggio
Tubo a fondo tondo in polistirene da 5 mL con tappo per filtro cellulare ReagenteCorning352235per citometria a flusso
Centrifuga 5702R, con 4 rotori da 100, adattatori da 15 e 50 mL, apparecchiature da 120 VEppendorf22628113per il lavoro di coltura dei mammiferi
AgaroseDenville ScientificGR140-500reagente per elettroforesi su gel
Fogli di alluminio per piastre a 96 pozzettiVWR®60941-126strumento utilizzato per coprire le piastre negli esperimenti di induzione della luce
Reagente AmpicillinaSigma AldrichA9518-5Gper la selezione di batteri con plasmide corretto
Miscelatore a vortice analogicoThermo Fisher Scientific02215365PRstrumento per eseguire reazioni di PCR, trasformazione o estrazione di gel
Bacto Agar disidratatoFisher ReagenteDF0140010scientifico per batteri in crescita
BD LSRAriaBD656700strumento per lo smistamento di linee cellulari ingegnerizzate in popolazioni monoclonali
BD LSRFortessaBD649225strumento per la caratterizzazione di linee cellulari ingegnerizzate
BSA, Bovine Serum AlbumineGovernment Scientific SourceSIGA4919-1Greagente per tampone
di incubazione IFPiastra per colture cellulari Piastra a 12 pozzetti, trasparente, a fondo piatto con coperchio, in polistirene, apirogena, standard-TCPiastra per 353043 Corningutilizzata per la crescita di cellule monoclonali
CentrifugaVWR22628113strumento per la coltura cellulare di mammiferi
Cappa chimicaN/A/Aper l'esecuzione di reazioni IF
Piastra per colture cellulari trasparenti a 24 pozzetti a fondo piatto con coperchioBD353047piastra utilizzata per la crescita di cellule monoclonali
Tappo filtro CytoOne T25 Pallone TCUSA ScientificCC7682-4825contenitore per la crescita di cellule di mammifero
Dimetil solfossido (DMSO)Fischer ScientificBP231-100utilizzato per il congelamento di cellule di mammifero ingegnerizzate
Bromuro di etidioReagente Thermo Fisher Scientific15-585-011per elettroforesi
su gelMicropiastra per colture con TC a fondo piatto trasparente Falcon 96, con coperchioCorning353072contenitore per la crescita di cellule monoclonali selezionate
FCS ExpressDe Novo Software:software N/Aper la caratterizzazione dei dati di citometria a flusso
Siero fetale bovino, regolare, USDA 500 mLCorning35-010-CVper la crescita di cellule
di mammiferoFisherbrand Piastre di Petri con coperchio trasparente - Colmo rialzato; 100 x 15 mmFisher Scientific FB0875712attrezzature per la coltivazione di batteri
Gibco  DMEM, reagente ad alto contenuto di glucosioThermo Fisher Scientific11-965-092per la crescita di cellule di mammifero
Hs00932330_m1 l'isoforma KRAS a Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182sonda qPCR
Igromicina B (50 mg/mL), 20 mLTechnologies10687-010reagente per la selezione di cellule con una corretta integrazione del circuito genico
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad Laboratories1708890reagente per la conversione dell'RNA in cDNA
Congelatore da laboratorio -20 gradi CVWR76210-392attrezzatura per la conservazione dei reagenti sperimentali
Congelatore da laboratorio -80 gradi CAttrezzatura PanasonicMDF-U74VCper la conservazione dei reagenti sperimentali
Frigorifero da laboratorio +4 gradi CVWR76359-220apparecchiatura per la conservazione dei reagenti
sperimentali LB Broth (Lennox) , 1 kgSigma-AldrichL3022-250Gper la crescita di batteri
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008 reagemt per la trasfetzione di circuiti genici in cellule di mammifero
MATLAB 2019Software MathWorksN/Aper l'analisi dei dati sperimentali
MetanoloAcros Organics413775000reagente per reazioni di immunofluorescenza
Provette per microcentrifuga, polipropilene 1,7 mLVWR20170-333contenitore per plastica
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182qPCR Probe
MultiTherm ShakerBenchmark ScientificH5000-HCapparecchiature per batterio
Spettrofotometro di trasformazione NanoDrop LiteThermo Fisher ScientificApparecchiatura ND-NDL-US-CANper la misurazione della concentrazione di DNA/RNA
NEB Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà 2x Master MixNEBM0492Sreagente per la PCR di frammenti di circuito genico
NEB10-beta E. coli competente (alta efficienza)New England Biolabs (NEB)C3019Hcellule batteriche per l'amplificazione del circuito genico di interesse
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621Lreagente per la combinazione di frammenti di circuito genico
Nikon Eclipse Ti-E microscopio invertito con una fotocamera DS-Qi2Nikon Instruments Inc.N/Astrumento per quantificare l'espressione genica
NIS-ElementsNikon Instruments Inc.Software N/Aper la caratterizzazione degli oligonucleotidi dei dati di microscopia a fluorescenza
ReagenteN/AIDT utilizzato per la PCR dei componenti del circuito genico
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubatore con UV e H2O2 ControlloPanasonicMCO-170AICUVHL-PAStrumento per la crescita di cellule
di mammiferoParaformaldeide, 16% microscopia elettronica Microscopiaelettronica Microscopia elettronica Sciences15710-Sreagente
PBS, soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS) (1x)Invitrogen14190144reagente per colture cellulari di mammifero, reagente per tampone di incubazione IF
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL), 100xFisher Scientific15140-122reagente per la crescita di cellule
di mammiferoanticorpo primario ERKTecnologia di segnalazione cellulare4370Santicorpo primario ERK per l'immunifluorescenza
anticorpo primario KRASSigma-AldrichWH0003845M1anticorpo primario KRAS per l'immunifluorescenza
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106per la purificazione dei plasmidi del circuito genico Kit
estrazione del gel QIAquick (50)Qiagen28704kit di reagenti per la purificazione di frammenti di circuiti genici Sistema
di PCR in tempo reale QuantStudio 3Apparecchiatura EppendorfA28137per qRT-PCR
App di quantificazione relativaThermo Fisher ScientificSoftware N/Aper la quantificazione dell'amplificazione di RNA/cDNA
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134per l'estrazione di RNA da cellule di mammifero ingegnerizzate
AnticorpoERK secondarioTecnologia di segnalazione cellulare8889Santicorpo ERK secondario per l'immunifluorescenza
anticorpo KRAS secondarioInvitrogenA11005anticorpo KRAS secondario per l'immunifluorescenza
Pipette sierologiche 5,0 mLOlympus Plastics12-102reagenti utilizzati per l'impostazione di una varietà di reazioni chimiche
Sistema di imaging SmartView ProMajor ScienceUVCI-1200strumento per l'imaging di bande PCR corrette
SnapGene Viewer (gratuito) o software SnapGeneSnapGeneN/AProgettazione e analisi della sequenza del DNA Incubatore
a tavolinoTokai HitINU-TIZstrumento per il trasporto di reazioni di PCR, trasformazione o estrazione di gel
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557 reagente per la PCR di frammenti di circuiti genici
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (sonda VIC/MGB), primer limitato, 2500 rxnLife Technologies4326317EqPCR Probe
ThermocyclerBio-Rad1851148strumento per il trasporto di reazioni di PCR, trasformazione o estrazione di gel
VisiPlate-24 Micropiastra a 24 pozzetti nera e nera con fondo trasparente, sterile e trattata con coltura tissutale PiastraPerkinElmer1450-605utilizzata per l'induzione della luce esperimenti
Pipette Pasteur monouso VWR, vetro, pipetta in vetro borosilicato, punta corta, capacità=2 mL, lunghezza totale=14,6 cmReagente VWR14673-010per colture cellulari di mammiferi
Sistemi di elettroforesi orizzontale Mini VWR, sistema di gel Mini10Apparecchiatura VWR89032-290per elettroforesi su gel di DNA
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007Linea cellulare ingegnerizzata con FRT sito
Reagente Reagente Strumento N Reagente Reagente Life di reagente Kit di reagenti di

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822(2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247(2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451(2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670(2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), New York, N.Y. 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18(2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131(2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521(2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547(2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314(2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546(2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111(2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363(2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887(2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128(2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591(2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , Stockton Press. New York. (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. TaborLab IRIS. TaborLab IRIS Software. , Available from: http://taborlab.github.io/Iris/index.html (2021).
  48. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849(2017).
  49. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  50. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  51. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002(2019).
  52. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  53. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436(2020).
  54. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  55. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , Ann Arbor. Ph.D (2020).
  56. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766(2019).
  57. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  58. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726(2020).
  59. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  60. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  61. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic Gene CircuitsMammalian CellsGene Expression ControlLight Inducible ExpressionStable Cell LinesFlow CytometryFluorescence MicroscopyNegative Feedback CircuitGene Expression NoiseProtein Expression Quantification

Related Articles