Imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in Arabidopsis

Takuya Uemura; Jiaqi Wang; Yuri Aratani; Simon Gilroy; Masatsugu Toyota

doi:10.3791/62114

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in Arabidopsis

4.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/62114

⸱

4 giugno 2021

Takuya Uemura¹ , Jiaqi Wang¹ , Yuri Aratani¹ , Simon Gilroy² , Masatsugu Toyota¹^,²

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, ²Department of Botany, University of Wisconsin

In questo articolo

Sommario

La segnalazione sistemica del calcio extracellulare innescata dal glutammato è fondamentale per l'induzione delle risposte della difesa delle piante al mento meccanico e all'attacco di erbivoro nelle piante. Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la dinamica spaziale e temporale di entrambi questi fattori utilizzando piante di thaliana arabidopsis che esprimono biosensori fluorescenti sensibili al calcio e al glutammato.

Abstract

Gli impianti rispondono a sollecitazioni meccaniche come ferite ed erbivori inducendo risposte di difesa sia nelle parti danneggiate che in quelle non danneggiate. Al momento del mento di una foglia, si verifica un aumento della concentrazione citosolica di ioni di calcio (segnale Ca^{2 +)} nel sito della ferita. Questo segnale viene rapidamente trasmesso a foglie non danneggiate, dove vengono attivate le risposte della difesa. La nostra recente ricerca ha rivelato che il glutammato che fuorie' dalle cellule ferite della foglia nell'apoplasto che li circonda serve come segnale di ferita. Questo glutammato attiva canali permeabili Ca²⁺ simili al recettore del glutammato, che quindi porta alla propagazione del segnale Ca²⁺ a lunga distanza in tutta la pianta. Le caratteristiche spaziali e temporali di questi eventi possono essere catturate con l'imaging in tempo reale di piante viventi che esprimono biosensori fluorescenti geneticamente codificati. Qui introduciamo un metodo di imaging in tempo reale a livello vegetale per monitorare la dinamica dei segnali Ca^{2 +} e i cambiamenti nel glutammato apoplastico che si verificano in risposta al mento. Questo approccio utilizza un microscopio a fluorescenza a campo ampio e piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono biosensori Ca²⁺ a base di proteina fluorescente verde (GFP) e biosensori glutammati. Inoltre, presentiamo una metodologia per suscitare facilmente la propagazione del segnale Ca²⁺ indotta da ferite, innescata dal glutammato e rapida e a lunga distanza. Questo protocollo può anche essere applicato a studi su altre sollecitazioni dell'impianto per aiutare a studiare come la segnalazione sistemica degli impianti potrebbe essere coinvolta nelle loro reti di segnalazione e risposta.

Introduzione

Le piante non possono sfuggire agli stress biotici, ad esempio gli insetti che si nutrono di loro, quindi hanno sviluppato sofisticati sistemi di rilevamento dello stress e trasduzione del segnale per rilevare e quindi proteggersi da sfide come l'erbivoro¹. Al momento del mento o dell'attacco di erbivoro, le piante avviano risposte rapide di difesa tra cui l'accumulo dell'acido jasmonico fitoormone (JA) non solo nel sito ferito ma anche negli organi distale non danneggiati². Questo JA quindi innesca risposte di difesa nei tessuti direttamente danneggiati e induce preemptive difese nelle parti non danneggiate della pianta. In Arabidopsis, l'accumulo di JA indotto dal mento è stato rilevato in foglie distale e intatte entro pochi minuti dai danni altrove nella pianta suggerendo che un segnale rapido e a lunga distanza viene trasmesso dalla foglia^{ferita 3}. Diversi candidati, come Ca^2+,specie reattive dell'ossigeno (ROS) e segnali elettrici, sono stati proposti per servire come questi segnali di ferita a lunga distanza nelle^{piante 4,}⁵.

Ca²⁺ è uno dei secondi elementi messaggeri più versatili e onnipresenti negli organismi eucarioti. Nelle piante, la masticazione del bruco e il mento meccanico causano drastici aumenti della concentrazione citosolica di Ca^{2 +} ([Ca²⁺]_cyt) sia nella foglia ferita che nelle foglie lontane non liche^6,⁷. Questo segnale ca^{2+ sistemico} viene ricevuto dalle proteine intracellulari ca^2+,che portano all'attivazione di vie di segnalazione della difesa a valle, tra cui biosintesi JA^8,⁹. Nonostante numerosi rapporti di questo tipo supportano l'importanza dei segnali Ca²⁺ nelle risposte delle ferite delle piante, le informazioni sulle caratteristiche spaziali e temporali dei segnali Ca²⁺ indotti dal ferimento sono limitate.

L'imaging in tempo reale utilizzando indicatori Ca²⁺ geneticamente codificati è un potente strumento per monitorare e quantificare la dinamica spaziale e temporale dei segnali Ca^2+. Ad oggi, sono state sviluppate versioni di tali sensori che consentono la visualizzazione di segnali Ca^{2 +} a livello di una singola cellula, a tessuti, organi e persino piante intere¹⁰. Il primo biosensore geneticamente codificato per Ca²⁺ utilizzato nelle piante è stata l'aequorina proteica bioluminescente derivata dalla medusa Aequorea victoria¹¹. Sebbene questa proteina chemiluminescente sia stata utilizzata per rilevare cambiamenti Ca²⁺ in risposta a varie sollecitazioni nelle piante^12,^13,^14,^15,^16,^17,¹⁸, non è adatta per l'imaging in tempo reale a causa del segnale luminescente estremamente basso che produce. Gli indicatori Ca²⁺ basati su Förster Resonance Energy Transfer (FRET), come i camelioni gialli, sono stati utilizzati con successo anche per indagare la dinamica di una serie di eventi^{di segnalazione} Ca 2 + negli^{impianti 19,}^20,^21,^22,^23,²⁴. Questi sensori sono compatibili con gli approcci di imaging e più comunemente sono composti dalla calmodulina proteica legante Ca²⁺ (CaM) e da un peptide legante CaM (M13) da una chinasi della catena leggera della miosina, tutti fusi tra due proteine fluorofori, generalmente una proteina fluorescente ciano (CFP) e una variante della proteina fluorescente gialla (YFP)¹⁰. L'associazione Ca²⁺ a CaM favorisce l'interazione tra CaM e M13 portando a un cambiamento conformazionale del sensore. Questo cambiamento promuove il trasferimento di energia tra la PCP e l'YFP, il che aumenta l'intensità di fluorescenza dell'YFP riducendo al contempo le emissioni di fluorescenza della PCP. Il monitoraggio di questo passaggio dalla PCP alla fluorescenza YFP fornisce quindi una misura dell'aumento del livello Ca^2+. Oltre a questi sensori FRET, i biosensori Ca²⁺ a base di proteine fluorescenti singole (FP), come GCaMP e R-GECO, sono anche compatibili con gli approcci di imaging vegetale e sono ampiamente utilizzati per studiare [Ca²⁺]_{cambiamenti del cito} a causa della loro elevata sensibilità e facilità d'uso^25,^26,^27,^28,^29,³⁰. I GCAMP contengono un singolo GFP permutato circolare (cp), nuovamente fuso a CaM e al peptide M13. L'interazione dipendente da Ca²⁺tra CaM e M13 provoca un cambiamento conformazionale nel sensore che promuove uno spostamento dello stato di protonazione del cpGFP, migliorando il suo segnale fluorescente. Pertanto, con^{l'aumento dei livelli di} Ca 2+, il segnale cpGFP aumenta.

Per indagare la dinamica dei segnali Ca²⁺ generati in risposta a ferite meccaniche o alimentazione di erbivori, abbiamo utilizzato piante transgeniche arabidopsis thaliana che esprimono una variante GCaMP, GCaMP3, e un microscopio a fluorescenza a campo^{largo 6}. Questo approccio è riuscito a visualizzare la trasmissione rapida di un segnale Ca²⁺ a lunga distanza dal sito della ferita su una foglia a tutta la pianta. Pertanto, un aumento del cito [Ca²⁺]_è stato immediatamente rilevato nel sito della ferita, ma questo segnale Ca^{2 +} è stato poi propagato alle foglie vicine attraverso la vascucolatura entro pochi minuti dal mento. Inoltre, abbiamo scoperto che la trasmissione di questo rapido segnale di ferita sistemica è abolita nelle piante arabidopsis con mutazioni in due geni simili al recettore del glutammato, Glutammato Recettore Like (GLR), GLR3.3 e GLR3.6⁶. I GLR sembrano funzionare come canali Ca²⁺ recintati da amminoacidi coinvolti in diversi processi fisiologici, tra cui risposta^{alle ferite 3,}crescita del tubo di polline^31,sviluppo delle radici^32,risposta al^{freddo 33}e immunità innata³⁴. Nonostante questa ben compresa, ampia funzione fisiologica dei GLR, le informazioni sulle loro proprietà funzionali, come la loro specificità ligando, la selettività ioniche e la localizzazione subcellulare, sono^{limitate 35}. Tuttavia, studi recenti hanno riferito che GLR3.3 e GLR3.6 sono localizzati rispettivamente nel phloem e nello xilema. I GLR vegetali hanno somiglianze con i recettori del glutammato ionotropico (iGluRs)³⁶ nei mammiferi, che vengono attivati dagli amminoacidi, come glutammato, glicina e D-serina nel sistema nervoso dei mammiferi³⁷. Infatti, abbiamo dimostrato che l'applicazione di glutammato di 100 mM, ma non di altri amminoacidi, nel sito della ferita induce un segnale Ca^{2 +} rapido e a lunga distanza in Arabidopsis, indicando che il glutammato extracellulare agisce probabilmente come un segnale di ferita nelle piante⁶. Questa risposta è abolita nel mutante glr3.3/glr3.6 suggerendo che il glutammato possa agire attraverso uno o entrambi questi canali simili a recettori e, in effetti, AtGLR3.6 è stato recentemente dimostrato essere gated da questi livelli di glutammato³⁸.

Nelle piante, oltre al suo ruolo di amminoacido strutturale, il glutammato è stato proposto anche come regolatore chiave dello sviluppo^39; tuttavia, le sue dinamiche spaziali e temporali sono poco comprese. Proprio come per Ca^2+,sono stati sviluppati diversi indicatori geneticamente codificati per il glutammato per monitorare la dinamica di questo amminoacido nelle cellule^{viventi 40,}⁴¹. iGluSnFR è un biosensore glutammato single-FP basato su GFP composto da cpGFP e una proteina legante il glutammato (GltI) di Escherichia coli⁴²^,⁴³. Il cambiamento conformazionale di iGluSnFR, indotto dal legame del glutammato con GltI, si traduce in una maggiore emissione di fluorescenza GFP. Per indagare se il glutammato extracellulare agisce come una molecola di segnalazione nella risposta della ferita vegetale, abbiamo collegato la sequenza iGluSnFR con la sequenza di secrezione peptidica del segnale chitinasio di base (CHIB-iGluSnFR) per localizzare questo biosensore nello spazio apoplastico⁶. Questo approccio ha permesso di imaging di eventuali cambiamenti nella concentrazione di glutammato apoplastico ([Glu]_apo) utilizzando piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono questo sensore. Abbiamo rilevato rapidi aumenti del segnale iGluSnFR nel sito di wounding. Questi dati supportano l'idea che il glutammato fuoriesi dalle cellule / tessuti danneggiati all'apoplasto al momento del mento e agisce come un segnale di danno attivando i GLR e portando al segnale Ca^{2 +} a lunga distanza nelle piante⁶.

Qui, descriviamo un metodo di imaging in tempo reale a livello vegetale utilizzando biosensori geneticamente codificati per monitorare e analizzare la dinamica dei segnali ca²⁺ a lunga distanza e glutammato extracellulare in risposta al^{mento 6}. La disponibilità di microscopia a fluorescenza a campo largo e piante transgeniche che esprimono biosensori geneticamente codificati fornisce un approccio potente ma facilmente implementato per rilevare segnali a lunga distanza trasmessi rapidamente, come le onde Ca^2+.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Preparazione del materiale vegetale

In un microtubo da 1,5 mL, sterilizzare in superficie i semi della pianta arabidopsis thaliana (adesione Col-0) esprimendo GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR tremando con il 20% (v/v) NaClO per 3 minuti e quindi lavare 5 volte con acqua distillata sterile.
NOTA: Le linee transgeniche di Arabidopsis che esprimono GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR sono state descritte in precedenza⁶.
In un cappuccio sterile, seminare 13 semi sterilizzati in superficie su una piastra di Petri di plastica quadrata di 10 cm riempita con 30 mL sterile (autoclavato) Murashige e Skoog (MS) medium [1x SALI MS, 1% (w/v) saccarosio, 0,01% (w/v) mioinositolo, 0,05% (w/v) MES e 0,5% (w/v) gomma gellan; pH 5,7 regolato con 1N KOH]. Sostituire il coperchio e avvolgere con nastro chirurgico.
Dopo l'incubazione al buio a 4 °C per 2 giorni, posizionare le piastre orizzontalmente a 22 °C in una camera di crescita sotto luce continua (90-100 μmol m^-2 s^-1)per circa 2 settimane prima dell'uso. Dopo 2 settimane, conta il numero di foglie di Arabidopsis dal più vecchio al più giovane⁴⁴ (Figura 1). Le risposte alle ferite si spostano preferenzialmente dalla foglia danneggiata (n) alle foglie numerate n ± 3 e n ± 5⁶.
NOTA: In questo protocollo, la piastra di Petri sarà aperta per l'imaging degli effetti della ferita e del glutammato al microscopio a fluorescenza. Pertanto, le fasi successive di questo esperimento devono essere condotte in condizioni di ambiente controllate da temperatura e umidità. Questo perché i segnali Ca²⁺ sono anche provocati da cambiamenti in queste condizioni ambientali. È anche noto che la luce blu, emessa dal microscopio durante la registrazione per l'eccitazione della fluorescenza della proteina biosensore, può provocare un aumento della concentrazione citosolica di Ca^{2 +} ⁴⁵ e quindi la pianta deve essere acclimatata all'irradiazione della luce blu per diversi minuti prima di iniziare l'esperimento.

2. Preparazione chimica

Sciogliere L-glutammato in un mezzo di crescita liquido [1/2x MS sali, 1% (w/v) saccarosio e 0,05% (w/v) MES; pH 5.1 regolato con 1N KOH] per fare una soluzione di lavoro da 100 mM.
NOTA: Evitare l'uso di sali di glutammato come il glutammato di sodio per prevenire potenziali effetti correlati al catione sulla dinamica Ca^2+.

3. Impostazione del microscopio e conduzione di immagini in tempo reale

Accendere lo stereomicroscopio a fluorescenza motorizzata dotato di un obiettivo 1x (NA = 0,156) e di una fotocamera sCMOS (Figura 2) e configurare le impostazioni del dispositivo per irradiare con una luce di eccitazione di 470/40 nm e acquisire una luce di emissione che passa attraverso un filtro da 535/50 nm.
NOTA: Qualsiasi microscopio a fluorescenza sensibile alla GFP può essere utilizzato per rilevare segnali GCaMP3 e iGluSnFR in tempo reale, ma si consiglia un obiettivo a bassa potenza e una fotocamera altamente sensibile con un ampio chip sCMOS per acquisire segnali dall'intero impianto. L'obiettivo a bassa potenza consente di imaging della risposta di un intero impianto arabidopsis e l'uso di una telecamera altamente sensibile consente la rapida acquisizione dei dati necessaria per catturare il rapido decorso del tempo dell'onda Ca^{2 + innescata dalla} ferita. Per il microscopio a fluorescenza utilizzato in questo studio, i valori massimi del campo visivo e della risoluzione temporale sono rispettivamente di 3 cm x 3 cm e 30 fotogrammi al secondo (fps).
Rimuovere il coperchio e posizionare il piatto sotto l'obiettivo.
Controllare il segnale di fluorescenza dalla pianta e quindi attendere circa 30 minuti al buio fino a quando le piante non vengono adattate alle nuove condizioni ambientali. Questo passaggio di adattamento è necessario perché i cambiamenti nell'umidità provocano [Ca²⁺]_{elevazione del cito} nelle piante che possono interferire con qualsiasi evento correlato alla ferita.
Regolare la messa a fuoco e l'ingrandimento per vedere l'intera pianta nel campo visivo. Nel protocollo corrente è stato utilizzato un ingrandimento 0,63x.
Prima di iniziare l'imaging in tempo reale, impostare i parametri di acquisizione per rilevare i segnali di fluorescenza utilizzando il software di imaging al microscopio. Le impostazioni per l'imaging nel protocollo corrente sono: tempi di esposizione e intervallo impostati rispettivamente su 1,8 s e 2 s (cioè 0,5 fps). Impostare il tempo di registrazione su 11 min.
Immagine per 5 minuti prima di iniziare l'esperimento per acclimatare la pianta all'irradiazione della luce blu dal microscopio,quindi iniziare a registrare facendo clic su Run Now o sul comando equivalente nel software del microscopio utilizzato. Per determinare la fluorescenza media di base, registrare almeno 10 fotogrammi (cioè almeno 20 s nel protocollo corrente) prima di ferire o applicazione di glutammato (vedere sezione 4).
1. Per l'imaging in tempo reale del_cito indotto dalla ferita [Ca²⁺] e [Glu]_apo cambia, tagliare il picciolo o la regione centrale della foglia L1 con le forbici(Figura 3 e Figura 4).
2. Per l'imaging in tempo reale dei cambi di_cit innescati dal glutammato [Ca²⁺], tagliare il bordo (circa 1 mm dalla punta) della foglia 1 attraverso la vena principale con le forbici. Dopo almeno 20 minuti di recupero, applicare 10 μL di glutammato da 100 mM sulla superficie tagliata della foglia (Figura 5).
  NOTA: Questo pre-taglio era necessario per consentire l'accesso del glutammato all'apoplasto fogliare al fine di innescare risposte. Inoltre, l'applicazione di una goccia di acqua distillata sulla superficie tagliata della foglia L1 è stata trovata fondamentale per evitare che i campioni si desiccano durante il recupero prima di applicare il glutammato.
Dopo aver terminato la registrazione di 11 minuti, salvare i dati.

4. Analisi dei dati

Per l'analisi dell'intensità della fluorescenza nel tempo, definire una regione di interesse (ROI) nel luogo in cui deve essere analizzata l'intensità della fluorescenza(Figura 6 e Figura 7). Per il calcolo della velocità dell'onda Ca^2+, definire 2 ROI (ROI1 e ROI2) per l'analisi. Nel software di imaging, fare clic su Misurazione del tempo | Definisci | Cerchio. Misurare la distanza tra ROI1 e ROI2 facendo clic su Annotazioni e misure | Lunghezza | Linea semplice (figura 6).
Misurare i valori di fluorescenza grezza (F) in ogni ROI nel tempo facendo clic su Misura. Esportare i dati grezzi in un software per fogli di calcolo per convertire il segnale di fluorescenza in numeri in ogni momento facendo clic su Tutti in Excel | Esportazione.
Determinare il valore di fluorescenza di base, definito come F₀, calcolando la media di F sui primi 10 fotogrammi (cioè prima del trattamento) nei dati registrati.
Normalizzare i dati F (calcolando ΔF/F) usando l'equazione ΔF/F = (F−F₀)/F₀, dove ΔF è la variazione di fluorescenza dipendente dal tempo.
Per l'analisi dell'onda di velocità d'onda Ca^2+, definire un significativo punto di aumento del segnale al di sopra dei valori pre-stimolati come^{rappresentazione del rilevamento} di un aumento ca 2+ in ogni ROI (t₁ e t₂) usando il criterio di un aumento a 2× la deviazione standard (2x SD) che viene calcolata dai dati F₀ utilizzando software statistico. Il 95% dei dati F₀ rientra in 2x SD dalla media, indicando che un aumento del segnale al di sopra di questo livello per caso è ≤5%. Calcolare la differenza di tempo dell'aumento ca²⁺ tra ROI1 e ROI2 [t₂- t₁ time-lag (Δt)] e misurare la distanza tra ROI1 e ROI2, quindi determinare le velocità di qualsiasi onda Ca^2+.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

La propagazione del segnale di [Ca²⁺]_cyt e [Glu]_apo in risposta al collare è presentata nella Figura 3, Figura 4, Filmato S1e Filmato S2. Il taglio del picciolo della foglia 1 nelle piante che esprimono GCaMP3 (a 0 s) ha portato a un aumento significativo del_cit [Ca²⁺] che è stato rapidamente indotto localmente attraverso la vascucolatura (a ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

La segnalazione sistemica è importante per le piante per rispondere agli stimoli ambientali esterni localizzati e quindi per mantenere la loro omeostasi a un intero livello di impianto. Sebbene non siano dotati di un sistema nervoso avanzato come gli animali, impiegano una comunicazione rapida sia all'interno che tra gli organi sulla base di fattori come segnali elettrici mobili (ed eventualmente idraulici) e onde di propagazione di ROS e Ca^{2 +}^46,⁴⁷. I...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni della Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 e 18H05491) a MT, dalla National Science Foundation (IOS1557899 e MCB2016177) e dalla National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G e 80NSSC19K0126) a SG.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Arabidopsis esprime GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis esprime CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-glutammato	FUJIFILM Wako	072-00501	Disciolto in un terreno di coltura liquido [1/2x sali MS, 1% (p/v) di saccarosio e 0,05% (p/v) MES; pH 5,1 regolato con 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composizione: 1x sali MS, 1% (p/v) saccarosio, 0,01% (p/v) mioinositolo, 0,05% (p/v) MES e 0,5% (p/v) gomma di gellano; pH 5,7 regolato con 1N KOH.
Stereomicroscopio Nikon SMZ25	Analisi AR Nikon
NIS-Elements	Obiettivo Nikon
1x (P2-SHR PLAN APO)Fotocamera	Nikon
sCMOS (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Piastra di Petri quadrata in plastica	Simport	D210-16

Riferimenti

Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32 (9), 1161-1174 (2009).
Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 387-415 (2018).
Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 287-307 (2016).
Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361 (6407), 1112-1115 (2018).
Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10178-10183 (2018).
Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171 (2), 249-269 (2006).
Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227 (4), 1037-1050 (2020).
Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29 (2), 229-234 (1967).
Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23 (2), 267-278 (2000).
Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440 (3), 355-373 (2011).
Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93 (12), 2095-2101 (2011).
Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163 (2), 543-554 (2013).
Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5242-5249 (2016).
Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (17), 6497-6502 (2014).
Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171 (3), 1771-1784 (2016).
Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18849-18857 (2020).
Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216 (4), 1161-1169 (2017).
Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142(2017).
DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58 (7), 1173-1184 (2017).
Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67 (6), 1853-1869 (2016).
Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42 (12), 3326-3339 (2019).
Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1497-1509 (2013).
Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69 (17), 4151-4163 (2018).
De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2 (1), 232(2011).
Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13 (640), (2020).
Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58 (9), 2339-2358 (2007).
Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8740-8745 (2005).
Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4411-4416 (2008).
Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. , (2013).
Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83 (1), 102-111 (2007).
Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67 (7), 2063-2079 (2016).
Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90 (4), 698-707 (2017).
Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (12), 4753-4758 (2006).
Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29 (6), 1460-1479 (2017).
Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31 (7), 1539-1562 (2019).
Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15 (8), 1833-1845 (2003).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Segnalazione del calcio glutammato apoplastico ferimento di Arabidopsis segnalazione sistemica biosensori fluorescenti microscopia a campo largo propagazione dell onda di calcio risposta di difesa delle piante canali dei recettori del glutammato

Imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in Arabidopsis