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Articolo metodologico

Valutazione della dispersione del biofilm nelle ferite murine

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DOI:

10.3791/62136

⸱

7 agosto 2021

 ,  , 
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo metodi ex vivo e in vivo per valutare la dispersione batterica da un'infezione da ferita nei topi. Questo protocollo può essere utilizzato per testare l'efficacia delle terapie topiche antimicrobiche e anti-biofilm, o per valutare la capacità di dispersione di diversi ceppi batterici o specie.

Abstract

Le infezioni correlate al biofilm sono implicate in una vasta gamma di condizioni croniche come ulcere del piede diabetiche non curative, sinusite cronica, media di otite che si verificano e molti altri. Le cellule microbiche all'interno di queste infezioni sono protette da una sostanza polimerica extracellulare (EPS), che può impedire agli antibiotici e alle cellule immunitarie ospiti di eliminare l'infezione. Per superare questo ostacolo, gli investigatori hanno iniziato a sviluppare agenti di dispersione come potenziali terapie. Questi agenti prendono di mira vari componenti all'interno del biofilm EPS, indebolendo la struttura e avviando la dispersione dei batteri, che può teoricamente migliorare la potenza antibiotica e la clearance immunitaria. Per determinare l'efficacia degli agenti di dispersione per le infezioni delle ferite, abbiamo sviluppato protocolli che misurano la dispersione del biofilm sia ex vivo che in vivo. Usiamo un modello di escissione chirurgica del topo che è stato ben descritto per creare infezioni croniche delle ferite associate al biofilm. Per monitorare la dispersione in vivo,infettiamo le ferite con ceppi batterici che esprimono luciferasi. Una volta accertate le infezioni mature, irrigamo le ferite con una soluzione contenente enzimi che degradano i componenti del biofilm EPS. Monitoriamo quindi la posizione e l'intensità del segnale luminescente nella ferita e negli organi filtranti per fornire informazioni sul livello di dispersione raggiunto. Per l'analisi ex vivo della dispersione del biofilm, il tessuto della ferita infetta viene immerso in una soluzione enzimatica degradante per biofilm, dopo di che viene valutata la carica batterica rimanente nel tessuto, rispetto alla carica batterica in soluzione. Entrambi i protocolli hanno punti di forza e di debolezza e possono essere ottimizzati per aiutare a determinare con precisione l'efficacia dei trattamenti di dispersione.

Introduzione

L'aumento della resistenza agli antibiotici in tutto il mondo sta portando alla mancanza di opzioni antibiotiche per trattare una varietà di infezioni batteriche1. Oltre alla resistenza agli antibiotici, i batteri possono ottenere tolleranza agli antibiotici adottando uno stile di vita associato al biofilm2. Un biofilm è una comunità di microrganismi che sono protetti da una matrice di polisaccaridi, DNA extracellulare, lipidi e proteine 3 ,collettivamente chiamatasostanza polimerica extracellulare (EPS). Mentre la crisi di resistenza agli antibiotici continua, sono estremamente necessarie nuove strategie che prolungano l'uso o potenziano l'efficacia degli antibiotici. Gli agenti anti-biofilm sono una soluzione promettente4.

Tra le diverse strategie anti-biofilm che sono state proposte, l'utilizzo di agenti di dispersione, che si rivolgono a diversi componenti del biofilm EPS, sono in prima linea nello sviluppo terapeutico5. Le idrolasi glicosidi (GH) sono una di queste classi di agente dispersivo. I GH sono una grande classe di enzimi che catalizzano la scissione di diversi legami all'interno dei polisaccaridi che forniscono integrità strutturale all'EPS. Il nostro gruppo, così come altri, hanno dimostrato che gh può degradare efficacemente i biofilm, indurre dispersione e migliorare l'efficacia antibiotica per una serie di diverse specie batteriche, sia in vitro che in vivo6,7,8,9,10,11.

Con un crescente interesse per la dispersione del biofilm, è importante sviluppare metodi efficaci che valutazioneno l'efficacia della dispersione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per il trattamento delle infezioni della ferita associate al biofilm con un agente di dispersione nei topi e la valutazione dell'efficacia della dispersione, in vivo ed ex vivo. L'obiettivo generale è quello di fornire metodi efficaci che possano essere utilizzati con modelli preclinici per misurare la dispersione del biofilm in modo efficace ed efficiente.

Un modello di infezione da escissione chirurgica murina è stato utilizzato in questi studi per stabilire un'infezione associata al biofilm. Abbiamo utilizzato questo modello per oltre 15 anni e pubblicato ampiamente le nostre osservazioni7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. In generale, questo è un modello di infezione non letale in cui i batteri rimangono localizzati nel letto della ferita e sono associati al biofilm (batteri visti in aggregati circondati da EPS), creando un'infezione cronica che dura fino a 3 settimane. Tuttavia, se i topi sono immunocompro compromessi (ad esempio con diabete di tipo 1), possono diventare più suscettibili allo sviluppo di un'infezione sistemica fatale in questo modello.

In questa relazione, forniamo protocolli per valutare la dispersione dei batteri da una ferita, sia in vivo che ex vivo. Entrambi i protocolli possono essere utilizzati per esaminare l'efficacia di un agente di dispersione e avere i propri punti di forza e di debolezza. Ad esempio, valutare la dispersione in vivo può fornire informazioni importanti e in tempo reale sulla diffusione dei batteri in altre parti del corpo dopo la dispersione e su come l'ospite risponde. D'altra parte, valutare la dispersione ex vivo può essere più desiderabile per lo screening di più agenti, dosi o formulazioni, in quanto il tessuto può essere diviso in più sezioni che possono essere testate separatamente, riducendo così il numero di topi richiesti. Quando valutiamo più agenti, in genere misuriamo la dispersione prima in vitro come descritto in precedenza 6,9,22. Testiamo quindi l'ex vivo più efficace e riserviamo test in vivo per un numero limitato di agenti molto promettenti.

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Protocollo

Questo protocollo sugli animali è stato esaminato e approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Texas Tech University Health Sciences Center (protocollo numero 07044). Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute.

1. Preparare i batteri per le infezioni del topo

NOTA: Qui descriviamo infettare i topi solo con Pseudomonas aeruginosa. Tuttavia, altre specie batteriche possono essere utilizzate per causare infezioni. Ceppi e materiali batterici sono dettagliati nella tabella dei materiali.

  1. Utilizzare pseudomonas aeruginosa ceppo di tipo selvatico PAO1 che trasporta la luminescenza plasmide pQF50-lux23 per questi esperimenti come descritto in precedenza7.
  2. Coltivare ceppi di P. aeruginosa in fiasche Sconcertate di Erlenmeyer, con scuotimento a 200 giri/min, in brodo Luria-Bertani (LB) a 37 °C per 16-20 ore. Aggiungere una concentrazione finale di 100 μg/mL di ampicillina alla coltura notturna di PAO1(pQF50-lux) per il mantenimento del plasmide.
  3. Sottocultura P. aeruginosa aggiungendo 100 μL della coltura notturna ad un pallone Erlenmeyer contenente 10 ml di brodo LB con una concentrazione finale di 100 μg/mL di ampicillina. Quindi crescere per 2-2,5 h a 37 °C con scuotimento, a un OD600 nm di 0,4, quindi diluire serialmente (1:10) tre volte per una dose infettante di circa 104 cellule.

2. Preparazione dell'enzima di dispersione del biofilm

NOTA: Per questo studio utilizziamo una soluzione al 10% di amilasi e cellulasi delle parti uguali (5% di ciascuna), che sarà definita "GH", per il trattamento di dispersione.

  1. Utilizzare una soluzione di GH al 10% (w/v) di amilasi (da Bacillus subtilis)e cellulasi fungina (da Aspergillus niger)diluita in 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS). Utilizzare PBS come trattamento di controllo del veicolo.
  2. Riscaldare tutti i trattamenti a 37 °C per 30 minuti per l'attivazione enzimatica.

3. Animali da esperimento e allestimento preoperatorio

  1. Topi domestici, 5 cucciolate per gabbia, in condizioni controllate dall'ambiente, con cicli di luce / buio di 12 ore e un corretto accesso a cibo e acqua.
  2. Preferibilmente, utilizzare topi Webster svizzeri femminili, di età compresa tra 8 e 10 settimane.
  3. Pesare i topi per determinare la giusta quantità di anestesia da somministrare.
  4. Somministrare anestesia mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di chetamina 10 mg/kg di xiazina.
  5. Applicare con cura la crema per gli occhi (ad esempio, Refresh P.M.) sull'occhio utilizzando un batuffolo di cotone per ridurre la secchezza.
  6. Monitorare i parametri fisiologici tra cui la frequenza respiratoria, la colorazione della pelle e la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico.

4. Chirurgia dell'escissione dorsale a pieno spessore

  1. Valutare il piano chirurgico dell'anestesia con il pizzico e il monitoraggio della frequenza respiratoria e dello sforzo. Radere la superficie dorsale e applicare una crema depilatoria per 10 min (o secondo le istruzioni del prodotto), dopo di che rimuovere delicatamente, assicurandosi che la pelle fosse asciutta.
  2. Per la gestione del dolore, somministrare 0,05 mL di lidocaina per via sottocutanea nell'area da asportare e iniettare 0,02 mL di buprenorfina per via sottocutanea nella tracolla del collo. Attendere 10 minuti per assicurarsi che la gestione del dolore sia stata raggiunta.
  3. Prima dell'escissione, disinfettare la superficie dorsale usando un tampone alcolico e disegnare un cerchio di 1,5 cm di diametro verso la porzione posteriore della schiena. Mantenere un campo chirurgico sterile durante tutta la procedura e ha utilizzato strumenti autoclavati e guanti sterili. Per limitare la contaminazione, condurre l'intervento chirurgico da un bruciatore Bunsen acceso e utilizzare strumenti puliti per ogni animale.
  4. Somministrare una ferita cutanea a pieno spessore e incisionale al livello del muscolo panniculo con forbici chirurgiche.
  5. Dopo l'escissione, coprire immediatamente le ferite con una medicazione semipermeabile in poliuretano.
  6. Iniettare circa10 4 CFU di batteri in 100 μL PBS sotto la medicazione, sul letto della ferita, per stabilire un'infezione.
    NOTA: Le ferite possono anche essere infettate contemporaneamente da più specie di batteri e/o funghi, o posizionando biofilm pre-formati12, o anche tessuto di debridemento estrattodai pazienti 19, sul letto della ferita.
  7. Dopo l'infezione, mettere i topi in gabbia con pastiglie riscaldanti e monitorare fino a quando non hanno riacquistato il loro riflesso di destra.
    NOTA: Assicurarsi che i topi non si raffreddori in quanto ciò può portare alla morte.
  8. Stabilire infezioni da ferite per 48 ore.
  9. Ispezionare quotidianamente le medicazioni adesive per verificare lacerazioni e aree di non aderenza e sostituirle se necessario.

5. Trattamento di dispersione in vivo

NOTA: Qui descriviamo la somministrazione degli agenti di dispersione applicando una serie di 3 soluzioni di irrigazione a carica topica(Figura 1). Tuttavia, il protocollo può essere adattato per altri tipi di consegna come l'applicazione di gel, creme o condimenti.

  1. Posizionare i topi sotto anestesia isoflurana (al 3% e 1 L al minuto di ossigeno) durante la somministrazione dei trattamenti.
  2. Preparare tre siringhe da 1 ml, con aghi da 25 G, contenenti 200 μL di trattamento per ogni topo.
  3. Iniettare 200 μL di soluzione enzimatica o controllo PBS sulla ferita sollevando e pizzicando con cura la pelle con le forcep, leggermente sopra la ferita verso la testa dell'animale. Perforare con cura la siringa attraverso la pelle sollevata e iniettare lentamente la soluzione tra la medicazione e il letto della ferita. La medicazione utilizzata in questo studio spesso aderisce sia al letto della ferita che al tessuto circostante.
    1. Per assicurarsi che l'intero letto avvolto sia coperto da soluzione, sollevare delicatamente la medicazione con le forcep, allontanandolo dal letto della ferita, mentre si inietta lentamente la soluzione.
  4. Dopo il trattamento, riposizionare i topi nelle loro gabbie per 30 minuti.
  5. Dopo 30 minuti di esposizione al trattamento, riaestestizzare i topi con isoflurane e aspirare la soluzione con una siringa, assicurandosi di forare nella stessa area di prima.
    NOTA: Questa soluzione aspirata contiene cellule batteriche disperse, che possono essere salvate per varie analisi a valle.
  6. Somministrare il secondo e il terzo trattamento di irrigazione come primo, utilizzando ogni volta una nuova siringa.

6. Imaging e analisi di dispersione in vivo

NOTA: Se un ceppo luminescente di batteri viene utilizzato per avviare l'infezione, è possibile utilizzare un sistema di imaging In Vivo (IVIS) per visualizzare la dispersione dal letto della ferita.

  1. Immagini topi immediatamente prima e dopo il trattamento e a 10 e 20 ore dopo il trattamento(figura 2 e figura supplementare 1).
  2. Eseguire immagini mentre i topi sono in anestesia posizionandoli singolarmente nell'IVIS e imaging ciascuno per 5 s a una lunghezza d'onda di 560 nm. Salvare le immagini per ulteriori analisi.
    NOTA: La lunghezza d'onda ottimale e il tempo di esposizione dipenderanno dal reporter utilizzato e dallo strumento IVIS e dal software di imaging.
  3. Per l'analisi, aprire le immagini nel software IVIS e selezionare l'area da analizzare nella tavolozza degli strumenti.
  4. Per tenere conto dello sfondo, posizionare un cerchio sullo sfondo di una foto e quindi posizionare lo stesso cerchio di dimensioni sopra il letto della ferita per ogni mouse.
  5. Per caricare i valori di misurazione, selezionare Visualizza misurazioni > regione di interesse (ROI) e caricare la tabella delle misurazioni in un foglio di calcolo. Sottrarre la lettura del cerchio di sfondo da ciascuna delle misurazioni del letto della ferita per calcolare la luminescenza per ogni campione. Calcolare la luminescenza percentuale modificata da:
    ROI pre-trattamento-ROI post-trattamento/ roi pretrattamento) x 100.
    NOTA: I topi di controllo e trattati devono essere analizzati contemporaneamente per normalizzarsi per le variabili che possono influire sull'acquisizione o sulla luminosità dell'immagine.

7. Valutazione della dispersione determinando la CFU

  1. Eutanasia umana dei topi mediante iniezione intraperitoneale di 0,2 mL di sodio pentobarbitale (ad esempio Fatal Plus) in anestesia con 100 mg/kg di ketamina 10 mg/kg di xiazina.
  2. Raccogliere il tessuto del letto avvolto rimuovendo prima delicatamente la medicazione con forcelle sterili, quindi tagliare intorno al perimetro del letto della ferita con forbici chirurgiche sterili. Sollevare delicatamente un'estremità del letto della ferita con le forcep mentre si usano le forbici per tagliare / stuzzicare il campione lontano dallo strato muscolare.
  3. Posizionare il tessuto dal letto della ferita in un tubo di omogeneizzazione da 2 ml preetitolato e pre-pesato contenente 1 ml di PBS. Pesare nuovamente i tubi dopo aver inserito i campioni, quindi invertire delicatamente 3-5 volte per risciacquare eventuali batteri dispersi o vagamente aderenti e rimuovere il PBS. Aggiungere 1 mL di PBS fresco.
  4. Per raccogliere le milza, posizionare i topi in una posizione anatomica supina e fissare fissando le estremità a una superficie di dissezione. Immergere l'area da sezionare con il 70% di etanolo per disinfettare l'area e evitare che la pelliccia contamini il campione.
  5. Fare con cura una piccola incisione perpendicolare alla linea mediana con forbici chirurgiche nel derma dell'addome inferiore, assicurandosi di tirare la pelle su e lontano dagli organi interni. Proseguire l'incisione interiormente, lungo la linea mediana, fino a raggiungere lo sterno. Una volta esposta la cavità peritoneale e visibili gli organi interni, separare delicatamente la milza dal tessuto connettivo e posizionarla in un tubo di omogeneizzazione separato.
  6. Pesare milza e risciacquare con PBS, come descritto per il tessuto del letto della ferita.
    NOTA: Altri organi di interesse possono essere raccolti in modo simile.
    1. Quando si effettua l'incisione iniziale, fare attenzione a evitare di forare l'intestino o altri organi.
  7. Omogeneizzare i campioni in tubi di mulino di perline preriempito da 2 ml utilizzando un omogeneizzatore da banco a 5 m/s per 60 s, due volte.
  8. Per enumerare la CFU, diluire in serie campioni e spot-plate su agar selettivo. Per la diluizione seriale, pipettare 100 μL del campione in 900 μL di PBS in un tubo, vortice e ripetere 5 volte 1,5 ml. Pipetta 10 μL di ogni diluizione su una piastra di agar, come illustrato nella figura 3.
    NOTA: Se è richiesta una quantificazione CFU più precisa, distribuire 100 μL di ogni diluizione del campione su piastre di agar separate.

8. Valutazione ex vivo della dispersione(figura 4)

  1. Ferire i topi e infettare con circa 104 PAO1 come descritto sopra, quindi eutanasiare 48 ore dopo l'infezione.
  2. Rimuovere con cura la medicazione con le alessa, utilizzando una tecnica sterile e senza disturbare il letto della ferita.
  3. Utilizzare forbici chirurgiche sterili per tagliare il perimetro del letto della ferita lontano dalla pelle non infetta utilizzando le forcelle per sollevare un'estremità del letto della ferita e delle forbici per asportare il tessuto della ferita infetto dallo strato muscolare sottostante e dal tessuto non infetto circostante. Dividere i campioni del letto avvolto in parti uguali o utilizzare interi.
  4. Posizionare il tessuto avvolto in tubi omogeneizzanti di mulino perline da 2 ml pre pesati e pre-pesati. Quindi pesare di nuovo i tubi dopo aver aggiunto il campione. Calcolare il peso del campione:
    peso dopo l'aggiunta del campione - peso prima di aggiungere il campione.
  5. Aggiungere 1 ml di PBS e invertire delicatamente il tubo 3-5 volte per risciacquare il campione e rimuovere eventuali cellule planctoniche. Rimuovere ed eliminare il PBS.
  6. Aggiungere 1 mL di trattamento gh (o PBS come controllo negativo) al campione e incubare per 2 ore a 37 °C con scuotimento a 80 giri/min.
  7. Rimuovere la soluzione di dispersione del biofilm e posizionarsi in un tubo separato da 1,5 ml. Contiene le celle disperse.
  8. Aggiungere 1 mL di PBS al campione di tessuto rimanente e invertire delicatamente 3-5 volte per risciacquare eventuali cellule disperse rimanenti. Rimuovere ed eliminare il PBS.
  9. Aggiungere 1 mL di PBS al tessuto rimanente e omogeneizzare a 5 m/s per 60 s utilizzando un omogeneizzatore da banco.
  10. Diluire serialmente la soluzione di cellule disperse e il campione di tessuto omogeneizzato posizionando 100 μL di campione in 900 μL di PBS in un tubo da 1,5 ml e ripetendo cinque volte per un totale di 6 diluizioni.
  11. La piastra spot 10 μL di ogni diluizione su agar selettivo multimediale (ad esempio, Pseudomonas Isolation Agar per P. aeruginosa)e incubare le piastre a 37 °C durante la notte.
  12. Contare il CFU e calcolare la 'percentuale dispersa' come (CFU in supernatante/ (CFU in supernatante+ CFU nel tessuto biofilm)) x 100.

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Risultati

In questo esperimento, topi Webster svizzeri di 8-10 settimane sono stati infettati da 104 CFU di PAO1 che trasportavano il pQF50-lux plasmide a luminescenza. Come descritto sopra, è stato permesso di stabilire un'infezione per 48 ore prima di somministrare trattamenti 3 x 30 minuti di PBS (controllo del veicolo) o 10% GH (trattamento) per digerire il biofilm EPS. I topi sono stati fotofazione pre-trattamento, direttamente dopo il trattamento (0 h) e a 10 h e 20 h dopo il trattamento. La f...

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Discussione

Qui descriviamo protocolli che possono essere utilizzati per studiare l'efficacia degli agenti di dispersione del biofilm. Questi protocolli possono essere facilmente adattati all'uso con diversi tipi di agenti dispersivi, specie batteriche o campioni ex vivo, inclusi campioni clinici di debridement. Questo protocollo fornisce anche un modello clinicamente rilevante per raccogliere e studiare cellule batteriche disperse. I fenotipi delle cellule batteriche disperse si sono dimostrati distinti da quelli delle cel...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), della Ted Nash Long Life Foundation, della Jasper L. and Jack Denton Wilson Foundation e del Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mLFisher14823434Utilizzare per completare diluizioni seriali di campioni
25G 58 in agoFisher14823434Si attacca a una siringa da 1 mL
Ampicillina Sale di sodioFisherBP1760-5Preparare una soluzione madre da 50 mg/mL e aggiungere 100 µ L a 10 ml di brodo LB sia per la notte che per la sottocoltura
AmilasiMP Biomedicals2100447Preparare una soluzione al 5% p/v, vortice- altri agenti di dispersione possono essere utilizzati
Buprenorfina SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)ZooPharmRX216118Utilizzare come supporto del dolore- può utilizzare altre opzioni
CellulaseMP Biomedicals2150583Aggiungere il 5% p/v alla soluzione di amilasi al 5% p/v, vortice, attivare a 37 ° C per 30 min- possono essere utilizzati altri agenti di dispersione
Crema depilatoriaWalmart287746Utilizzare una piccola quantità per massaggiare i follicoli piliferi sul dorso dell'animale e dedicare 10 minuti per rimuovere i peli
Pinze per medicazione, punte seghettateFisher12-460-536Può utilizzare altre forme di pinze
Palloni di Erlenmeyer deflettori 125 mlFisher101406Utilizzare per crescere durante la notte e sottocolture di batteri
FastPrep-24 Omogeneizzatore da bancoMP Biomedicals6VFV9Utilizzare 5 m/s per 60 s due volte per omogeneizzare i tessuti
Fatal PlusVortech Pharmaceuticals0298-9373-68Iniettare 0,2 mL per intraperitanea per ogni topo
Provette omogeneizzanti (Bead Tube 2 mL 2,4 mm Metal)Fisher15340151Utilizzato per omogeneizzare i campioni per la placcatura
IsofluraneDiamond Back Drugs
Soluzione di cloridrato di ketamina / xilazina cloridrato C-IIINSigma AldrichK4138Utilizzare come anasethia- altre opzioni possono anche essere utilizzate per ottenere un campo chirurgico di brodo di anasethia
LB, MillerFisherBP1426-2aggiungere 25 g / L e autoclave
Lidocaina 2% iniettabileDiamond Back Drugs2468Iniettare 0,05 mL attraverso il lato dell'area del letto della ferita contrassegnata in modo che si depositi al centro del segno. Assumere 10 minuti prima del taglio
MeropenemSigma AldrichPHR1772-500MGProdurre 5 mg/mL da aggiungere alla soluzione di GH da applicare localmente e una soluzione da 15 mg/mL da iniettare per via intraperiteanea 4 ore prima e 6 ore dopo il trattamento
Spugne di garza di cotone non steriliFisher13-761-52Utilizzare per rimuovere la crema depilatoria
PAO1 pQF50-lux ceppo battericoRef [13]N/APAO1 pgF50-lux è stato utilizzato come ceppo di P. aeruginosa di interesse nei risultati rappresentativi di questo articolo
Piastre di PetriFisherPHR1772-500MG
Soluzione salina tampone fosfato 10xFisherBP3991Diluire da 10x a 1x prima dell'uso
Medicazione poliuretanicaMckesson66024007Tagliare il bordo arrotondato e tagliare il quadrato rimanente in 4 sezioni uguali
Pseudomonas agar di isolamentoVWR90004-394Aggiungere 20 mL/L di glicerolo e 45 g/mL all'acqua, in autoclave e versare 20 mL in piastre di Petri
Refresh P.M.WalmartUtilizzare sugli occhi per ridurre la secchezza durante la procedura.
Tamponi sterili per la preparazione dell'alcolFisher22-363-750Utilizzare per pulire la pelle immediatamente prima della ferita per disinfettare l'area
Forbici dritte e delicateFisher89515Può anche usare le forbici curve
Mouse Swiss WebsterCharles River551NCISWWEBÈ possibile utilizzare altri ceppi di topi
Syring Slip Tip 1 mLFisher14823434Utilizzato per somministrare farmaci e trattamento enzimatico

Riferimenti

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