Valutazione della dispersione del biofilm nelle ferite murine

Sommario

Qui descriviamo metodi ex vivo e in vivo per valutare la dispersione batterica da un'infezione da ferita nei topi. Questo protocollo può essere utilizzato per testare l'efficacia delle terapie topiche antimicrobiche e anti-biofilm, o per valutare la capacità di dispersione di diversi ceppi batterici o specie.

Abstract

Le infezioni correlate al biofilm sono implicate in una vasta gamma di condizioni croniche come ulcere del piede diabetiche non curative, sinusite cronica, media di otite che si verificano e molti altri. Le cellule microbiche all'interno di queste infezioni sono protette da una sostanza polimerica extracellulare (EPS), che può impedire agli antibiotici e alle cellule immunitarie ospiti di eliminare l'infezione. Per superare questo ostacolo, gli investigatori hanno iniziato a sviluppare agenti di dispersione come potenziali terapie. Questi agenti prendono di mira vari componenti all'interno del biofilm EPS, indebolendo la struttura e avviando la dispersione dei batteri, che può teoricamente migliorare la potenza antibiotica e la clearance immunitaria. Per determinare l'efficacia degli agenti di dispersione per le infezioni delle ferite, abbiamo sviluppato protocolli che misurano la dispersione del biofilm sia ex vivo che in vivo. Usiamo un modello di escissione chirurgica del topo che è stato ben descritto per creare infezioni croniche delle ferite associate al biofilm. Per monitorare la dispersione in vivo,infettiamo le ferite con ceppi batterici che esprimono luciferasi. Una volta accertate le infezioni mature, irrigamo le ferite con una soluzione contenente enzimi che degradano i componenti del biofilm EPS. Monitoriamo quindi la posizione e l'intensità del segnale luminescente nella ferita e negli organi filtranti per fornire informazioni sul livello di dispersione raggiunto. Per l'analisi ex vivo della dispersione del biofilm, il tessuto della ferita infetta viene immerso in una soluzione enzimatica degradante per biofilm, dopo di che viene valutata la carica batterica rimanente nel tessuto, rispetto alla carica batterica in soluzione. Entrambi i protocolli hanno punti di forza e di debolezza e possono essere ottimizzati per aiutare a determinare con precisione l'efficacia dei trattamenti di dispersione.

Introduzione

L'aumento della resistenza agli antibiotici in tutto il mondo sta portando alla mancanza di opzioni antibiotiche per trattare una varietà di infezioni batteriche¹. Oltre alla resistenza agli antibiotici, i batteri possono ottenere tolleranza agli antibiotici adottando uno stile di vita associato al biofilm². Un biofilm è una comunità di microrganismi che sono protetti da una matrice di polisaccaridi, DNA extracellulare, lipidi e proteine 3 ,^{collettivamente chiamata}sostanza polimerica extracellulare (EPS). Mentre la crisi di resistenza agli antibiotici continua, sono estremamente necessarie nuove s....

Protocollo

Questo protocollo sugli animali è stato esaminato e approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Texas Tech University Health Sciences Center (protocollo numero 07044). Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute.

1. Preparare i batteri per le infezioni del topo

NOTA: Qui descriviamo infettare i topi solo con Pseudomonas aeruginosa. Tuttavia, altre specie batteriche possono essere utilizzate per causare infezioni. Ceppi e materiali batterici sono dettag....

Risultati

In questo esperimento, topi Webster svizzeri di 8-10 settimane sono stati infettati da 10⁴ CFU di PAO1 che trasportavano il pQF50-lux plasmide a luminescenza. Come descritto sopra, è stato permesso di stabilire un'infezione per 48 ore prima di somministrare trattamenti 3 x 30 minuti di PBS (controllo del veicolo) o 10% GH (trattamento) per digerire il biofilm EPS. I topi sono stati fotofazione pre-trattamento, direttamente dopo il trattamento (0 h) e a 10 h e 20 h dopo il trattamento. La f.......

Discussione

Qui descriviamo protocolli che possono essere utilizzati per studiare l'efficacia degli agenti di dispersione del biofilm. Questi protocolli possono essere facilmente adattati all'uso con diversi tipi di agenti dispersivi, specie batteriche o campioni ex vivo, inclusi campioni clinici di debridement. Questo protocollo fornisce anche un modello clinicamente rilevante per raccogliere e studiare cellule batteriche disperse. I fenotipi delle cellule batteriche disperse si sono dimostrati distinti da quelli delle cel.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL	Fisher	14823434	Utilizzare per completare diluizioni seriali di campioni
25G 58 in ago	Fisher	14823434	Si attacca a una siringa da 1 mL
Ampicillina Sale di sodio	Fisher	BP1760-5	Preparare una soluzione madre da 50 mg/mL e aggiungere 100 µ L a 10 ml di brodo LB sia per la notte che per la sottocoltura
Amilasi	MP Biomedicals	2100447	Preparare una soluzione al 5% p/v, vortice- altri agenti di dispersione possono essere utilizzati
Buprenorfina SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Utilizzare come supporto del dolore- può utilizzare altre opzioni
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Aggiungere il 5% p/v alla soluzione di amilasi al 5% p/v, vortice, attivare a 37 ° C per 30 min- possono essere utilizzati altri agenti di dispersione
Crema depilatoria	Walmart	287746	Utilizzare una piccola quantità per massaggiare i follicoli piliferi sul dorso dell'animale e dedicare 10 minuti per rimuovere i peli
Pinze per medicazione, punte seghettate	Fisher	12-460-536	Può utilizzare altre forme di pinze
Palloni di Erlenmeyer deflettori 125 ml	Fisher	101406	Utilizzare per crescere durante la notte e sottocolture di batteri
FastPrep-24 Omogeneizzatore da banco	MP Biomedicals	6VFV9	Utilizzare 5 m/s per 60 s due volte per omogeneizzare i tessuti
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Iniettare 0,2 mL per intraperitanea per ogni topo
Provette omogeneizzanti (Bead Tube 2 mL 2,4 mm Metal)	Fisher	15340151	Utilizzato per omogeneizzare i campioni per la placcatura
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Soluzione di cloridrato di ketamina / xilazina cloridrato C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Utilizzare come anasethia- altre opzioni possono anche essere utilizzate per ottenere un campo chirurgico di brodo di anasethia
LB, Miller	Fisher	BP1426-2	aggiungere 25 g / L e autoclave
Lidocaina 2% iniettabile	Diamond Back Drugs	2468	Iniettare 0,05 mL attraverso il lato dell'area del letto della ferita contrassegnata in modo che si depositi al centro del segno. Assumere 10 minuti prima del taglio
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Produrre 5 mg/mL da aggiungere alla soluzione di GH da applicare localmente e una soluzione da 15 mg/mL da iniettare per via intraperiteanea 4 ore prima e 6 ore dopo il trattamento
Spugne di garza di cotone non sterili	Fisher	13-761-52	Utilizzare per rimuovere la crema depilatoria
PAO1 pQF50-lux ceppo batterico	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux è stato utilizzato come ceppo di P. aeruginosa di interesse nei risultati rappresentativi di questo articolo
Piastre di Petri	Fisher	PHR1772-500MG
Soluzione salina tampone fosfato 10x	Fisher	BP3991	Diluire da 10x a 1x prima dell'uso
Medicazione poliuretanica	Mckesson	66024007	Tagliare il bordo arrotondato e tagliare il quadrato rimanente in 4 sezioni uguali
Pseudomonas agar di isolamento	VWR	90004-394	Aggiungere 20 mL/L di glicerolo e 45 g/mL all'acqua, in autoclave e versare 20 mL in piastre di Petri
Refresh P.M.	Walmart		Utilizzare sugli occhi per ridurre la secchezza durante la procedura.
Tamponi sterili per la preparazione dell'alcol	Fisher	22-363-750	Utilizzare per pulire la pelle immediatamente prima della ferita per disinfettare l'area
Forbici dritte e delicate	Fisher	89515	Può anche usare le forbici curve
Mouse Swiss Webster	Charles River	551NCISWWEB	È possibile utilizzare altri ceppi di topi
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Utilizzato per somministrare farmaci e trattamento enzimatico