Articolo metodologico

Isolamento e imaging time-lapse di cellule mesenchimiche palatali embrionali di topo primarie per analizzare gli attributi del movimento collettivo

DOI:

10.3791/62151

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13 febbraio 2021

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1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali primarie di topo per l'imaging time-lapse di test di crescita bidimensionale (2D) e di riparazione delle ferite. Forniamo anche la metodologia per l'analisi dei dati di imaging time-lapse per determinare la formazione del flusso cellulare e la motilità direzionale.

Abstract

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Lo sviluppo del palato è un processo dinamico, che comporta la crescita verticale di ripiani palatali bilaterali accanto alla lingua seguita da elevazione e fusione sopra la lingua. I difetti in questo processo portano alla palatoschisi, un difetto di nascita comune. Recenti studi hanno dimostrato che l'elevazione della mensola palatale comporta un processo di rimodellamento che trasforma l'orientamento della mensola da uno verticale a uno orizzontale. Il ruolo delle cellule mesenchimali della mensola palatale in questo rimodellamento dinamico è stato difficile da studiare. L'analisi quantitativa basata sull'imaging time-lapse è stata recentemente utilizzata per dimostrare che le cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali primarie di topo (MEPM) possono auto-organizzarsi in un movimento collettivo. Le analisi quantitative potrebbero identificare differenze nelle cellule MEPM mutanti da un modello murino con difetti di elevazione del palato. Questo documento descrive i metodi per isolare e colturare cellule MEPM da embrioni E13.5, in particolare per l'imaging time-lapse, e per determinare vari attributi cellulari del movimento collettivo, comprese le misure per la formazione del flusso, l'allineamento della forma e la persistenza della direzione. Ipotizza che le cellule MEPM possano servire come modello proxy per studiare il ruolo del mesenchima della mensola palatale durante il processo dinamico di elevazione. Questi metodi quantitativi consentiranno ai ricercatori nel campo craniofacciale di valutare e confrontare gli attributi di movimento collettivo nelle cellule di controllo e mutanti, il che aumenterà la comprensione del rimodellamento mesenchimale durante l'elevazione della mensola palatale. Inoltre, le cellule MEPM forniscono un raro modello cellulare mesenchimale per lo studio del movimento cellulare collettivo in generale.

Introduzione

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Lo sviluppo del palato è stato ampiamente studiato in quanto i difetti della palatogenesi portano alla palatoschisi, un difetto di nascita comune che si verifica in casi isolati o come parte di centinaia di sindromi1,2. Lo sviluppo del palato embrionale è un processo dinamico che coinvolge il movimento e la fusione del tessuto embrionale. Questo processo può essere suddiviso in quattro fasi principali: 1) induzione di ripiani palatali, 2) crescita verticale dei ripiani palatali accanto alla lingua, 3) elevazione dei ripiani palatali sopra la lingua e 4) fusione dei ripiani palatali alla linea mediana

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali sono stati condotti con un protocollo approvato dal KUMC Institutional Animal Care and Use Committee, in conformità con le loro linee guida e regolamenti (numero di protocollo: 2018-2447).

1. Raccogli embrioni E13.5

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Risultati

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La dissezione degli scaffali palatali è illustrata nella Figura 1. La sequenza di incisioni è progettata per ridurre al minimo lo slittamento del tessuto. Dopo la rimozione della testa (Figura 1A,B), la mascella inferiore viene rimossa (Figura 1B,C). L'incisione della parte superiore della testa (Figura 1C, D) viene eseguita per stabilizzare il tessuto .......

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Discussione

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L'elevazione della mensola palatale costituisce un evento di rimodellamento da verticale a orizzontale1,3,4,9,11. Si ipotizza che questo processo di rimodellamento richieda che le cellule mesenchimali della mensola palatale si comportino in modo coordinato. Le analisi con cellule MEPM wildtype mostrano che questo comportamento cellulare è intrinseco e può esse.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo progetto è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni del National Institutes of Health DE026172 (I.S.) e GM102801 (A.C.). I.S. è stato anche sostenuto in parte dalla sovvenzione del Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), dalla sovvenzione Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) e dalla sovvenzione del Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Becher, 250 mL (x2)Fisher ScientificFB-100-250
CO2Matheson GasUN1013
Provette coniche, 15 mL (x1)
di immagini time-lapse
L-glutammina e piruvato di sodioCytiva Life SciencesSH30243.01
EtOH, 100%Decon Laboratories2701
EVOS FL AutoThermoFisher ScientificAMAFD1000
EVOS Incubatore a tavolinoThermoFisher ScientificAMC1000
EVOS Portarecipienti a tavolino, piastre a più pozzettiThermoFisher ScientificAMEPVH028
Siero fetale bovinoCorning35-010-CV
Punta fine #5 Pinze in acciaio inossidabile (x2)Fine Science Tools11295-10Strumento di dissezione
sterilizzatore bagno di perlineFine Science Tools18000-45
Provette per microcetrifugo, 1,5 ml Avant2925
Forbici in acciaio inossidabile per micro-dissezione, dritteRobozRS-5910Dissezione
NucBlue (Hoechst) Sonde Live ReadyThermoFisher ScientificR37605
Soluzione di penicillina streptomicina, 100xCorning30-002-CI
Inserto in silicone, 2 pozzettiIbidi80209
Cucchiaio piccolo perforato in acciaio inossidabileFine Science ToolsMC17Cdissezione
Forbici, 4 mmFine Science Tools15018-10
Sterile 10 cm dishe(s)Corning430293
Piastra sterile a 12 pozzettiPR1MA667512
Piastra sterile a 6 pozzettiThermoFisher Scientific140675
Sterile PBSCorning21-031-CV
Pipettasterile per trasferimento a bulbo in plasticaThermoFisher Scientific202-1S
Tripsina, 0,25%ThermoFisher Scientific25200056
Analisi computazionale del sistema operativo Debian Midwest Scientific C15B Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose con 4 mM Molla di

Riferimenti

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  1. Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
  2. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374 (9703), 1773-1785 (2009).
  3. La....

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Palatal Mesenchyme CellsCollective Cell MovementTime Lapse ImagingPalatal Shelf ElevationMouse Embryo DissectionCell Migration AssayWound Repair AssayMesenchymal RemodelingCraniofacial DevelopmentCell Motility Analysis

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