Questo protocollo illustra un sistema di dimerizzazione proteica indotto chimicamente per creare condensati sulla cromatina. Viene dimostrata la formazione del corpo nucleare della leucemia promielocitica (PML) sui telomeri con dimerizzatori chimici. La crescita, la dissoluzione, la localizzazione e la composizione delle goccioline sono monitorate con imaging di cellule vive, immunofluorescenza (IF) e ibridazione fluorescente in situ (FISH).
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Articolo metodologico
Condensati proteici indotti da dimerizzazione chimica sui telomeri
In questo articolo
Sommario
Abstract
I condensati associati alla cromatina sono implicati in molti processi nucleari, ma i meccanismi sottostanti rimangono sfuggenti. Questo protocollo descrive un sistema di dimerizzazione proteica indotto chimicamente per creare condensati sui telomeri. Il dimerizzatore chimico è costituito da due ligandi collegati che possono legarsi ciascuno a una proteina: il ligando Halo all'enzima Halo e il trimetoprim (TMP) all'E. coli diidrofolato reduttasi (eDHFR), rispettivamente. La fusione dell'enzima Halo in una proteina telomerica ancora i dimerizzatori ai telomeri attraverso il legame covalente legante-enzima Halo. Il legame del TMP all'eDHFR recluta proteine di fase fuse con eDHFR in telomeri e induce la formazione di condensa. Poiché l'interazione TMP-eDHFR non è covalente, la condensazione può essere invertita utilizzando TMP libero in eccesso per competere con il dimerizzatore per il legame eDHFR. Viene mostrato un esempio di induzione della formazione del corpo nucleare della leucemia promielocitica (PML) sui telomeri e determinazione della crescita, della dissoluzione, della localizzazione e della composizione del condensato. Questo metodo può essere facilmente adattato per indurre condensati in altre posizioni genomiche fondendo Halo con una proteina che si lega direttamente alla cromatina locale o a dCas9 che è mirato al locus genomico con un RNA guida. Offrendo la risoluzione temporale richiesta per l'imaging live di singole cellule mantenendo la separazione di fase in una popolazione di cellule per saggi biochimici, questo metodo è adatto per sondare sia la formazione che la funzione dei condensati associati alla cromatina.
Introduzione
Molte proteine e acidi nucleici subiscono la separazione di fase liquido-liquido (LLPS) e si auto-assemblano in condensati biomolecolari per organizzare la biochimica nelle cellule1,2. LLPS delle proteine leganti la cromatina porta alla formazione di condensati associati a specifici loci genomici e implicati in varie funzioni locali della cromatina3. Ad esempio, LLPS della proteina HP1 è alla base della formazione di domini eterocromatici per organizzare il genoma4,5, LLPS di fattori di trascrizione forma centri di trascrizione ....
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Protocollo
1. Produzione di linee cellulari transitorie
- Cellule accettori U2OS di coltura su coperchi di vetro 22 x 22 mm (per imaging dal vivo) o coverslip circolari di 12 mm di diametro (per IF o FISH) rivestiti con poli-D-lisina in piastra a 6 pozzetti con mezzo di crescita (10% di siero bovino fetale e 1% di soluzione di penicillina-streptomicina in DMEM) fino a raggiungere il 60-70% di confluenza.
- Sostituire il mezzo di crescita con 1 mL di mezzo di trasfezione (terreno di crescita senza soluzione di penicillina-streptomicina) prima della trasfezione.
- Per ogni pozzo di trasfezione, aggiungere 4 μL di reagente di trasfezione a 1....
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Risultati
Immagini rappresentative della localizzazione telomerica di SUMO identificate dal TELomero DNA FISH e dalla proteina SUMO IF sono mostrate in Figura 2. Le cellule con reclutamento SIM hanno arricchito SUMO1 e SUMO 2/3 sui telomeri rispetto alle cellule con reclutamento di mutanti SIM. Ciò indica che l'arricchimento SUMO indotto dalla dimerizzazione della SIM sui telomeri dipende dalle interazioni SUMO-SIM.
Un filmato time lapse rappresentativo di TRF1 e SIM dopo l.......
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Discussione
Questo protocollo ha dimostrato la formazione e la dissoluzione di condensati sui telomeri con un sistema di dimerizzazione chimica. La cinetica della separazione di fase e del clustering dei telomeri indotto dalla fusione di goccioline viene monitorata con immagini dal vivo. La localizzazione e la composizione della condensa sono determinate con DNA FISH e proteina IF.
Ci sono due passaggi critici in questo protocollo. Il primo è determinare la concentrazione di proteine e dimerizzatori. Il s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (1K22CA23763201 a H.Z., GM118510 a D.M.C.) e dalla fondazione Charles E. Kaufman a H.Z. Gli autori desiderano ringraziare Jason Tones per aver corretto il manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina, 0,1% EDTA in HBSS senza calcio, magnesio e bicarbonato di sodio | Corning | MT25053CI | |
| 16% formaldeide (p/v), senza metanolo | Thermo Scientific | 28906 | Preparare l'1% in 1x piastra di coltura PBS |
| a 6 pozzetti VWR | 10861-554 | ||
| Foglio di alluminio | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anticorpo anti-mCherry | Abcam | Ab183628 | |
| Anticorpo anti-PML | Santa Cruz | sc966 | |
| Anticorpo anti-SUMO1 | Abcam | Ab32058 | |
| Anticorpo anti-SUMO2/3 | Citoscheletro | Asm23 | |
| Reagente bloccante | Roche | 11096176001 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| Tubo BTX micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Vetrini coprioggetti circolari | Thermo Scientific | 3350 | |
| Microscopio confocale | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimetil solfossido | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM con L-glutammina, 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio | Corning | MT10017CV | |
| fotocamera EMCCD | iXon Life. | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Siero fetale bovino, regioni qualificate e approvate dall'USDA | Gibco | A4766801 | |
| formammide, Millipori deionizzatiSigma | 46-101-00ML | ||
| IgG anti-topo di capra (H+L), anticorpo secondario ricombinante, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| IgG anti-coniglio di capra (H + L), anticorpo secondario ricombinante, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Pinzette/pinze a punta ultra fine diritte affusolate ad alta precisione | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Modulo di fusione laser | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Reagente di trasfezione | Invitrogen | 11668027 | |
| Software di tracciatura di figure, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Smalto per unghie | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Software di imaging, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Siero ridotto Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina, 100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Punte per pipette | VWR | 10017 | |
| Vetrini per microscopio angolari ritagliati lisci e smerigliati | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Soluzione di poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Aziduro di sodio | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Disco rotante | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Vetrini di copertura quadrati | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x soluzione | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Sintetizzato dal laboratorio | Disponibile su richiesta | |
| TNH | sintetizzato dal laboratorio | Disponibile su richiesta | |
| Soluzione Tris | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 Soluzione al 10% | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Preparare lo 0,5% in 1x linea |
| cellulare PBS U2Os | Dal laboratorio E.V. Makayev (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Montaggio Medio Vettoriale | NC9524612 |
Riferimenti
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology<....
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Ristampe e permessi
