Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

Summary

Questo articolo introduce passaggi essenziali di immunosomodulazione e immunoprecipitazione della cromatina. Questi protocolli sono comunemente usati per studiare i processi cellulari legati ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA.

Abstract

Le cellule sono continuamente esposte a vari agenti dannosi per il DNA, inducendo diverse risposte cellulari. L'applicazione di approcci biochimici e genetici è essenziale per rivelare eventi cellulari associati al reclutamento e all'assemblaggio di complessi di riparazione del DNA nel sito di danni al DNA. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati diversi potenti strumenti per indurre danni al DNA specifici del sito. Inoltre, le nuove tecniche seminali ci permettono di studiare questi processi a livello di risoluzione a cella singola utilizzando cellule fisse e viventi. Sebbene queste tecniche siano state utilizzate per studiare vari processi biologici, qui presentiamo i protocolli più utilizzati nel campo della riparazione del DNA, dell'immunosomodulazione della fluorescenza (IF) e dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), che in combinazione con danni al DNA site-specific basati sull'endonucleasi rendono possibile visualizzare e quantificare l'occupazione genomica dei fattori di riparazione del DNA in modo diretto e regolamentato, rispettivamente. Queste tecniche forniscono potenti strumenti per i ricercatori per identificare nuove proteine legate al locus genomico danneggiato e le loro modifiche post-tras traslazione necessarie per la loro regolazione accurata durante la riparazione del DNA.

Introduction

Il nostro genoma è costantemente sfidato da vari agenti dannosi per il DNA. Questi assalti possono derivare da fonti ambientali, come la luce UV o l'irradiazione, nonché da fonti endogene, come i prodotti chimici metabolici causati da stress ossidativo o errori di^{replicazione 1,2}. Queste lesioni possono influenzare l'integrità di uno o entrambi i filamenti di DNA e, se gli errori generati diventano persistenti, spesso porta a traslocazioni e instabilità del genoma, che possono causare tumorigenesi^3,4. Per mantenere l'integrità del genoma, sono stati sv....

Protocol

1. Immunodetezione di proteine specifiche

1. Preparazione della coltura cellulare e configurazione sperimentale
   1. Mantenere le cellule U2OS in monostrati in mezzo di coltura DMEM integrato con il 10% di siero fetale di vitello, 2 mM di glutammina e soluzione antibiotico-antimicotica all'1%.
      NOTA: Per l'induzione di danni al DNA a base di endonucleasi, utilizzare un mezzo trattato con carbone o privo di steroidi per evitare perdite di sistema.
   2. Far crescere le cellule in un ambiente umidificato 5% CO₂ a 37 °C fino all'80% di confluenza, rinnovando il mezzo ogni 2-3 giorni.
   3. Aspirare il mezzo e lavare le ....

Results

Lo studio dei processi di riparazione indotti dal DSB diretti in loco nelle cellule può essere ottenuto tramite trasfezione stabile o transitoria. Tuttavia, va notato che la trasfezione stabile garantisce una popolazione cellulare omogenea, che fornisce una risposta cellulare unificata e quindi più affidabile. Nel caso della transitoria transitoria, solo una piccola parte della popolazione cellulare occupa e mantiene il plasmide, che introduce la diversità nell'esperimento. La creazione di sistemi cellulari basati sull'e.......

Discussion

Sebbene la riparazione del DNA sia un campo di ricerca relativamente recente, le nostre conoscenze si stanno rapidamente espandendo con l'aiuto di vari metodi biochimici e microscopici. Preservare le informazioni genetiche è fondamentale per le cellule poiché le mutazioni che si verificano nei geni coinvolti nei processi di riparazione sono tra le principali cause di tumorigenesi e quindi è essenziale chiarire le fasi chiave delle vie di riparazione del DNA.

Le tecniche biochimiche (ad esempio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-OHT	Sigma Aldrich	H7904
Agarosio	Lonza	50004
Soluzione antibiotico-antimicotica (100&volte;), Stabilizzato	Sigma Aldrich	A5955
Anti-gamma H2A. X (fosfo S139) anticorpo	Abcam	ab26350
Frazione sierica bovina V albumina	Biosera	PM-T1725
TrackIt™ Ciano/Giallo Tampone di Carico	Thermo Fisher Scientific	10482035 DMEM
con 1,0 g/L di Glucosio, senza L-Glutammina	Lonza	12-707F
Doxiciclina	Sigma Aldrich	D9891
Dynabeads&commercio; M-280 Pecora Anti-Topo IgG	Invitrogen	11202D
Dynabeads&commercio; M-280 Ovino Anti-Coniglio	IgG Invitrogen	11204D
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Etanolo	Molare Sostanze chimiche	02910-101-340
Siero fetale bovino (origine sudamericana),	Gibco	approvato
Soluzione di formaldeide al 37% priva di acido	Sigma Aldrich	1.03999
GlutaMAX&commercio; Integratore	Thermo Fisher Scientific	35050038
Glicina	Sigma Aldrich	50046
IPure kit v2	Diagenode	C03010015
Alcool isoamilico	Sigma Aldrich	W205702
LiCl	Sigma Aldrich	L9650
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
Na-DOC	Sigma Aldrich	D6750
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Neocarzinostatina da Streptomyces carzinostaticus	Sigma Aldrich	N9162
NP-40	Sigma Aldrich	I8896
PBS Polvere senza Ca2+, Mg2+Sigma	Aldrich	L182-50-BC
Fenolo	Sigma Aldrich	P4557
TUBI	Sigma Aldrich	P1851
Polisorbato 20 (Tween 20)	Molar Chemicals	09400-203-190
KCl	Sigma Aldrich	P5405
ProLong™ Mountant antisbiadimento d'oro con DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36935
Iniettore della proteasi Cocktail Set I	Roche	11873580001
proteinasi K	Sigma Aldrich	P2308
P-S2056 Anticorpo DNAPKcs	Abcam	ab18192
RNasi A Roche		10109169001
CH3COONa	Sigma Aldrich	S2889
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Tris Acetato-EDTA tampone	Sigma Aldrich	T6025
Tris-HCl	Sigma Aldrich	91228
TRITON X-100	Molar Chemicals	09370-006-340
Tripsina dal pancreas suino	Sigma Aldrich	T4799
Tripsina-EDTA (0,5%), senza rosso fenolo	Gibco	15400054