Questo articolo introduce passaggi essenziali di immunosomodulazione e immunoprecipitazione della cromatina. Questi protocolli sono comunemente usati per studiare i processi cellulari legati ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA.
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Articolo metodologico
Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule sono continuamente esposte a vari agenti dannosi per il DNA, inducendo diverse risposte cellulari. L'applicazione di approcci biochimici e genetici è essenziale per rivelare eventi cellulari associati al reclutamento e all'assemblaggio di complessi di riparazione del DNA nel sito di danni al DNA. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati diversi potenti strumenti per indurre danni al DNA specifici del sito. Inoltre, le nuove tecniche seminali ci permettono di studiare questi processi a livello di risoluzione a cella singola utilizzando cellule fisse e viventi. Sebbene queste tecniche siano state utilizzate per studiare vari processi biologici, qui presentiamo i protocolli più utilizzati nel campo della riparazione del DNA, dell'immunosomodulazione della fluorescenza (IF) e dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), che in combinazione con danni al DNA site-specific basati sull'endonucleasi rendono possibile visualizzare e quantificare l'occupazione genomica dei fattori di riparazione del DNA in modo diretto e regolamentato, rispettivamente. Queste tecniche forniscono potenti strumenti per i ricercatori per identificare nuove proteine legate al locus genomico danneggiato e le loro modifiche post-tras traslazione necessarie per la loro regolazione accurata durante la riparazione del DNA.
Introduzione
Il nostro genoma è costantemente sfidato da vari agenti dannosi per il DNA. Questi assalti possono derivare da fonti ambientali, come la luce UV o l'irradiazione, nonché da fonti endogene, come i prodotti chimici metabolici causati da stress ossidativo o errori direplicazione 1,2. Queste lesioni possono influenzare l'integrità di uno o entrambi i filamenti di DNA e, se gli errori generati diventano persistenti, spesso porta a traslocazioni e instabilità del genoma, che possono causare tumorigenesi3,4. Per mantenere l'integrità del genoma, sono stati sv....
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Protocollo
1. Immunodetezione di proteine specifiche
- Preparazione della coltura cellulare e configurazione sperimentale
- Mantenere le cellule U2OS in monostrati in mezzo di coltura DMEM integrato con il 10% di siero fetale di vitello, 2 mM di glutammina e soluzione antibiotico-antimicotica all'1%.
NOTA: Per l'induzione di danni al DNA a base di endonucleasi, utilizzare un mezzo trattato con carbone o privo di steroidi per evitare perdite di sistema. - Far crescere le cellule in un ambiente umidificato 5% CO2 a 37 °C fino all'80% di confluenza, rinnovando il mezzo ogni 2-3 giorni.
- Aspirare il mezzo e lavare le ....
- Mantenere le cellule U2OS in monostrati in mezzo di coltura DMEM integrato con il 10% di siero fetale di vitello, 2 mM di glutammina e soluzione antibiotico-antimicotica all'1%.
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Risultati
Lo studio dei processi di riparazione indotti dal DSB diretti in loco nelle cellule può essere ottenuto tramite trasfezione stabile o transitoria. Tuttavia, va notato che la trasfezione stabile garantisce una popolazione cellulare omogenea, che fornisce una risposta cellulare unificata e quindi più affidabile. Nel caso della transitoria transitoria, solo una piccola parte della popolazione cellulare occupa e mantiene il plasmide, che introduce la diversità nell'esperimento. La creazione di sistemi cellulari basati sull'e.......
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Discussione
Sebbene la riparazione del DNA sia un campo di ricerca relativamente recente, le nostre conoscenze si stanno rapidamente espandendo con l'aiuto di vari metodi biochimici e microscopici. Preservare le informazioni genetiche è fondamentale per le cellule poiché le mutazioni che si verificano nei geni coinvolti nei processi di riparazione sono tra le principali cause di tumorigenesi e quindi è essenziale chiarire le fasi chiave delle vie di riparazione del DNA.
Le tecniche biochimiche (ad esempio.......
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Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata dall'Ufficio Nazionale Ricerca, Sviluppo e Innovazione che ha concesso a GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, la borsa di studio János Bolyai Research dell'Accademia ungherese delle scienze BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, la borsa di studio a breve termine EMBO 8513 e la Fondazione Tempus.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarosio | Lonza | 50004 | |
| Soluzione antibiotico-antimicotica (100&volte;), Stabilizzato | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A. X (fosfo S139) anticorpo | Abcam | ab26350 | |
| Frazione sierica bovina V albumina | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Ciano/Giallo Tampone di Carico | Thermo Fisher Scientific | 10482035 DMEM | |
| con 1,0 g/L di Glucosio, senza L-Glutammina | Lonza | 12-707F | |
| Doxiciclina | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads&commercio; M-280 Pecora Anti-Topo IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads&commercio; M-280 Ovino Anti-Coniglio | IgG Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Etanolo | Molare Sostanze chimiche | 02910-101-340 | |
| Siero fetale bovino (origine sudamericana), | Gibco | approvato | |
| Soluzione di formaldeide al 37% priva di acido | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX&commercio; Integratore | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glicina | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Alcool isoamilico | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatina da Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Polvere senza Ca2+, Mg2+Sigma | Aldrich | L182-50-BC | |
| Fenolo | Sigma Aldrich | P4557 | |
| TUBI | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polisorbato 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Mountant antisbiadimento d'oro con DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Iniettore della proteasi Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| proteinasi K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 Anticorpo DNAPKcs | Abcam | ab18192 | |
| RNasi A Roche | 10109169001 | ||
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetato-EDTA tampone | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Tripsina dal pancreas suino | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Tripsina-EDTA (0,5%), senza rosso fenolo | Gibco | 15400054 |
Riferimenti
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.<....
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Ristampe e permessi
