Questo protocollo presenta uno strumento rapido e utile per valutare il ruolo di una proteina con funzione insolita nella regolazione dello splicing alternativo dopo il trattamento chemioterapico.
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Articolo metodologico
Utilizzo dello strumento Minigene E1A per studiare le modifiche allo splicing dell'mRNA
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'elaborazione dell'mRNA prevede più passaggi simultanei per preparare l'mRNA per la traduzione, come 5'capping, aggiunta poli-A e splicing. Oltre allo splicing costitutivo, lo splicing alternativo dell'mRNA consente l'espressione di proteine multifunzionali da un unico gene. Poiché gli studi interactome sono generalmente la prima analisi per proteine nuove o sconosciute, l'associazione della proteina esca con fattori di splicing è un'indicazione che può partecipare al processo di splicing dell'mRNA, ma determinare in quale contesto o quali geni sono regolati è un processo empirico. Un buon punto di partenza per valutare questa funzione è l'utilizzo dello strumento minigene classico. Qui presentiamo l'uso del minigene Adenovirale E1A per valutare i cambiamenti di splicing alternativi dopo diversi stimoli di stress cellulare. Abbiamo valutato lo splicing del minigene E1A nella proteina Nek4 stabilmente sovraespressiva di HEK293 dopo diversi trattamenti stressanti. Il protocollo include la trasfezione minigene E1A, il trattamento cellulare, l'estrazione dell'RNA e la sintesi cDNA, seguita dall'analisi PCR e gel e dalla quantificazione delle varianti spliced E1A. L'uso di questo metodo semplice e consolidato combinato con trattamenti specifici è un punto di partenza affidabile per far luce sui processi cellulari o su quali geni possono essere regolati dallo splicing dell'mRNA.
Introduzione
Lo splicing è tra i passaggi più importanti nell'elaborazione dell'mRNA eucariotico che avviene simultaneamente alla tappatura a 5 mRNA e alla poliadenylazione di 3'mRNA, che comprende la rimozione dell'introne seguita dalla giunzione dell'esonero. Il riconoscimento dei siti di giunzione (SS) da parte dello spliceosoma, un complesso di ribonucleoproteine contenente piccole ribonucleoproteine (snRNP U1, U2, U4 e U6), piccoli RRNA (snRNA) e diverse proteineregolatorie 1 è necessario per la giunzione.
Oltre alla rimozione dell'introne (splicing costitutivo), negli eucarioti, gli introni possono essere conservati e gli e....
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Protocollo
1. Cellule placcanti
NOTA: In questo protocollo descritto, le linee cellulari stabili HEK293, precedentemente generate per l'espressione induttibile stabile di Nek4, sono stateutilizzate 21, tuttavia, lo stesso protocollo è adatto a molte altre linee cellulari, come HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, SH-SY5Y29. Il modello di espressione delle isoforme minigene E1A in condizioni basali var....
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Risultati
Un test di siti di giunzione da 5' utilizzando il minigene E1A è stato eseguito per valutare i cambiamenti nel profilo di giunzione nelle cellule dopo l'esposizione della chemioterapia. Il ruolo di Nek4 - isoforma 1 nella regolazione AS nelle cellule stabili HEK293 dopo il trattamento con paclitaxel o cisplatino è stato valutato.
La regione Adenovirale E1A è responsabile della produzione di tre mRNA principali da un precursore d.......
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Discussione
I minigeni sono strumenti importanti per determinare gli effetti nello splicing alternativo globale in vivo. Il minigene adenovirale E1A è stato utilizzato con successo per decenni per valutare il ruolo delle proteine aumentando la quantità di queste nella cellula13,14. Qui, proponiamo l'uso minigene E1A per valutare lo splicing alternativo dopo l'esposizione chemioterapeutica. Fu utilizzata una linea cellulare stabile che esprimeva l'isoforma 1 di Nek4, evitando.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, attraverso Grant Temático 2017/03489-1 a JK e borsa di studio a FLB 2018/05350-3) e con il Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) per il finanziamento di questa ricerca. Vorremmo ringraziare il Dott. Adrian Krainer per aver fornito il plasmide pMTE1A e Zerler e colleghi per il loro lavoro nella clonazione E1A. Ringraziamo anche la Dott.ssa Patrícia Moriel, la Dott.ssa Wanda Pereira Almeida, il Prof.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| a 6 pozzetti | Sarstedt | 833920 | |
| Agarosio | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatino | Sigma | P4394 | |
| DEPC acqua | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Siero Fetale Bovino - FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Microscopio Fluorescente | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Sistema di acquisizione immagini su gel - ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 cellule stabili - HEK293 Flp-In | Generato da Flp-In™ T-REx&commercio; 293 - Invitrogen e descritto nel ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Utilizzato per la manutenzione delle cellule Flp-In |
| elaborazione e analisi delle immagini - Software | ref. 32 | ||
| Reagente di trasfezione a base di lipidi - jetOPTIMUS Polyplus Reagente | Polyplus Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Lettore di piastre/ assorbanza UV | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 | |
| adattatore pMTE1A plasmide | Fornito dal Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3' | |
| Centrifuga refrigerata | Eppendorf | F5810R | |
| Trascrittasi inversa - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Trascrittasi inversa - Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Inibitore della ribunucleasi RNAsi OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| Reagente a base di fenolo-cloroformio per estrazione di RNA - Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel colorante | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Utilizzato per Flag vuoto o Nek4- Flag induzione di espressione |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Tripsina | Sigma | T4799 |
Riferimenti
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of....
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Ristampe e permessi
