Articolo metodologico

Impalcatura composita collagene-chitosano caricata di doxiciclina per la guarigione accelerata delle ferite diabetiche

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DOI:

10.3791/62184

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21 agosto 2021

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1Department of Pharmaceutics, JSS College of Pharmacy, JSS Academy of Higher Education & Research, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, North Dakota state university, 3Department of Pharmacology, JSS College of Pharmacy, JSS Academy of Higher Education & Research

In questo articolo

Sommario

L'impalcatura DOX-CL preparata soddisfaceva i prerequisiti di una medicazione DW ideale in resistenza meccanica, porosità, assorbimento dell'acqua, tasso di degradazione, rilascio prolungato, proprietà antibatteriche, biocompatibilità e antinfiammatorie, che sono considerate essenziali per il recupero del tessuto danneggiato nei DW.

Abstract

Una delle principali complicanze del diabete mellito sono le ferite diabetiche (DW). La fase prolungata dell'infiammazione del diabete ostruisce le ulteriori fasi di una lesione che porta a una guarigione ritardata delle ferite. Abbiamo selezionato la doxciclina (DOX), come potenziale farmaco preferito, grazie alle sue proprietà antibatteriche insieme alle sue proprietà antinfiammatorie riportate. L'attuale studio mira a formulare impalcature dox caricate collagene-chitosano non retiche (NCL) e retille (CL) e valutare la loro capacità curativa in condizioni diabetiche. Il risultato della caratterizzazione delle impalcature rivela che l'impalcatura DOX-CL ha una porosità ideale, un basso tasso di gonfiore e degradazione e un rilascio prolungato di DOX rispetto all'impalcatura DOX-NCL. Gli studi in vitro rivelano che l'impalcatura DOX-CL era biocompatibile e ha migliorato la crescita cellulare rispetto ai gruppi di impalcatura e controllo CL. Gli studi antibatterici hanno dimostrato che l'impalcatura DOX-CL era più efficace dell'impalcatura CL contro i batteri più comuni trovati in DW. Utilizzando il modello di DW indotto dalla dieta streptozotocina e ad alto contenuto di grassi, è stato osservato un tasso significativamente (p≤0,05) più veloce di contrazione della ferita nel gruppo trattato con impalcature DOX-CL rispetto a quelli nei gruppi di impalcatura e controllo CL. L'uso dell'impalcatura DOX-CL può rivelarsi un approccio promettente per il trattamento locale per le DW.

Introduzione

Il diabete mellito (DM) è una condizione in cui l'incapacità del corpo di fornire insulina o reagire ai suoi esiti nella digestione anomala di zuccheri semplici porta a un aumento della glicemia 1. L'intreccio più consecutivo e schiacciante del DM è la ferita diabetica (DW). Circa il 25% dei pazienti con DM ha l'opportunità di costruire un DW nella loro vita 1. La guarigione ostacolata della DW è accreditata a una triopatia di DM: immunopatia, vasculopatia e neuropatia. Ogni volta che la DW non viene trattata, può provocare lo sviluppo della cancrena, provocando quindi la rimozione dell'organo interessato 2.

Molti trattamenti, come istruire i pazienti (ispezionare la ferita ogni giorno, pulire la ferita, evitare attività che creano pressione sulla ferita, monitoraggio periodico del glucosio, ecc.), controllare la glicemia, debridement delle ferite, scarico della pressione, procedura medica, ossigenoterapia iperbarica e terapie avanzate sono in pratica 3,4. La maggior parte di questi farmaci non affronta tutti i prerequisiti vitali per la cura della DW alla luce delle condizioni patofisiotiche multifattoriali e delle spese impreviste relative a questi farmaci 5. Anche se la patogenesi DW è multifattoriale, l'infiammazione persistente con gestione inappropriata dei tessuti è dichiarata come la vera ragione della guarigione ritardata in DWs 5,6.

I livelli aumentati di mediatori infiammatori e pro-infiammatori in DW si traducono in una diminuzione dei fattori di crescita responsabili della guarigione ritardata delle ferite 2,6. La formazione impropria di matrice extracellulare (ECM) nelle DW è accreditata per l'aumento dei livelli di metalloproteinasi matriciali (MMP) responsabili della rapida degradazione dell'ECM formato. Negli MMP, MMP-9 è segnalato come uno dei principali intermediari responsabili dell'infiammazione prolungata e della rapida degradazione dell'ECM 7. Si afferma che il trattamento locale con un farmaco antinfiammatorio che diminuisce i livelli elevati di MMP-9 rieche stabilisce l'omeostasi cutanea, la disposizione del quadro e richiede una migliore guarigione dei DWs 8,9.

La doxiciclina (DOX), un inibitore dell'MMP-9, è stata scelta per sopprimere i livelli elevati di MMP-9, un importante mediatore infiammatorio responsabile dell'infiammazione persistente in DWs 10,11,12. Inoltre, dox possiede antiossidanti (producono radicali idrossi e fenossidici liberi in grado di legarsi con specie reattive dell'ossigeno) 13 e anti-apoptotico (inibire l'espressione della caspasi e la stabilizzazione mitocondriale) 14 attività essenziali per il trattamento della DW. È stata scelta la disposizione di quadri contenenti DOX, collagene (COL) e chitosano (CS). La scelta del COL dipende dal modo in cui aiuta a fornire il quadro necessario responsabile della resistenza meccanica e della rigenerazione tissutale 15. D'altra parte, CS è strutturalmente omologo al glicosaminoglicano, associato a diverse fasi di guarigione delle ferite. È anche riportato che CS detiene una significativa proprietà antibatterica 15. Pertanto, l'impalcatura COL / CS di DOX è formulata per sopprimere l'infiammazione prolungata, seguita dal supporto della formazione della matrice per una guarigione efficace delle ferite in condizioni di DM.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali eseguite sono state approvate dal comitato etico istituzionale per gli animali del JSS College of Pharmacy, Ooty, India.

1. Preparazione di impalcature porose caricate con DOX con metodo di liofilizzazione

  1. Aggiungere 1,2 g di COL a 100 mL di acqua (ad esempio Millipore) e tenere da parte per il gonfiore.
  2. Mescolare la dispersione gonfia del COL a 2000 giri/min durante la notte per garantire la completa dissoluzione del COL.
  3. Preparare la soluzione CS sciogliendo circa 0,8 g di CS in 100 mL di acido acetico all'1%.
  4. Mescolare la soluzione CS durante la notte a 2000 giri/min per garantire una dispersione uniforme.
  5. Mescolare DOX (1% w/v), seguito dalla soluzione CS, alla soluzione COL e mescolare per 30 min.
  6. Filtrare la miscela fisica ottenuta utilizzando un panno di mussola per rimuovere il particolato.
  7. Congelare in profondità il filtrato ottenuto a -85 °C ± 4 °C per circa 24 ore.
  8. Liofilizzare la miscela di congelamento profondo a -85 °C ± 4 °C per 72 h.
  9. Conservare le impalcature ottenute in un essiccatore per ulteriori analisi 16,17.

2. Collegamento incrociato di impalcature

  1. Sciogliere mes (0,488 g) in 50 mL di acqua.
  2. Immergere 50 mg dell'impalcatura caricata dox in 20 mL del tampone MES per 30 minuti.
  3. Mescolare 19,5 mL di buffer MES con 0,1264 g di EDC e 0,014 g di NHS in un becher separato.
  4. Immergere l'impalcatura nella miscela tampone per 4 ore per ottenere il crosslinking 16.
  5. Conservare le impalcature a reti incrociate (CL) e non retiche DOX (NCL) per un'ulteriore valutazione.

3. Caratterizzazione delle impalcature

  1. Esame morfologico mediante microscopia elettronica a scansione (SEM)
    1. Caratterizzare le impalcature per l'analisi morfologica utilizzando SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
    2. Macchiare la sezione trasversale e la superficie esterna dell'impalcatura con il delicato strato d'oro (~ 150 Å).
    3. Cattura l'immagine fotografica alla tensione di eccitazione di 5 kV e 10 kV.
    4. Posizionare i campioni in stub di alluminio e racchiuderli con l'oro a circa 9 V.
    5. Misurare l'impalcatura utilizzando SEM con una risoluzione aumentata a 10 kV.
  2. Determinazione della porosità
    1. Misurare la porosità delle impalcature utilizzando il metodo di spostamento del liquido (etanolo) 18.
    2. Calcolare la porosità delle impalcature utilizzando le formule seguenti.
      figure-protocol-1
      Ww = Peso umido dell'impalcatura
      Wd = Peso secco dell'impalcatura
      Wv = Volume dell'impalcatura
  3. Determinazione della capacità di assorbimento dell'acqua
    1. Misurare il peso secco dell'impalcatura.
    2. Incubare l'impalcatura pesata a 37 °C per 24 ore in tampone fosfato saline (PBS) pH 7.4.
    3. Rimuovere il PBS in eccesso sull'impalcatura utilizzando carta da filtro.
    4. Misurare la capacità di assorbimento dell'acqua utilizzando le formule seguenti 17.
      figure-protocol-2
      WS = Percentuale di assorbimento d'acqua
      W1=Peso umido dell'impalcatura
      W0= Peso secco dell'impalcatura
  4. Degradazione dell'impalcatura
    1. Incubare l'impalcatura (1 cm x 1 cm) a 37 °C per 7 giorni in un PBS di pH 7.4 contenente lisozima.
    2. Lavare l'impalcatura per rimuovere eventuali ioni aderenti sulla superficie.
    3. Congelare asciugare l'impalcatura lavata 17.
    4. Calcolare la velocità di degradazione utilizzando le formule.
      figure-protocol-3
      Ww = Peso iniziale dell'impalcatura
      Wd = Peso dell'impalcatura dopo la liofilizzazione
  5. Studi sul rilascio in vitro
    1. Determinare il comportamento di rilascio del DOX dall'impalcatura utilizzando il metodo del sacco dialisi.
    2. Disperdere l'impalcatura in alcuni millilitri di liquido avvolto simulato (pH 7.4) e trasferirla in un sacchetto di dialisi.
    3. Chiudere saldamente le estremità del sacchetto a membrana e immergersi nei 500 mL della soluzione di fluido avvolto simulato.
    4. Mescolare la soluzione di fluido avvolto contenente il sacchetto di dialisi a 200-250 giri/min.
    5. Raccogliere la soluzione supernatante e sostituirla con una quantità uguale di soluzione tampone fresco a intervalli di tempo definiti.
    6. Determinare la percentuale di rilascio DOX dalle impalcature nella soluzione supernatante utilizzando uno spettrometro visibile ai raggi UV a 240 nm.

4. Studi antibatterici in vitro

  1. Determinare la concentrazione inibitoria minima (MIC) delle impalcature CL e DOX-CL contro il S. aureus, S. epidermide, E. coli, P. aeruginosa utilizzando il metodo di diluizione del micro-brodo.
  2. Preparare le colture batteriche usando brodo di Mueller-Hinton con un rapporto di 1:1000 per ottenere 0,5 torbidità McFarland.
  3. Aggiungere D-glucosio (800 mg/dL) alle colture batteriche per l'iperglicazione 19,20.
  4. Tritare e solubilizzare cl e DOX-CL in DMSO (controllo negativo).
  5. Diluire in serie la sospensione batterica iperglicata (100 μL) e i campioni di prova (100 μL di soluzione di impalcature) in 96 piastre di pozzo.
  6. Incubare la piastra a 37 °C per 20-24 ore.
  7. Registrare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 600 nm 21.

5. Studi di biocompatibilità in vitro

  1. Valutate la biocompatibilità delle impalcature preparate utilizzando il saggio MTT [(3-(4, 5 dimetil tiazolo-2 yl) -2, 5-difenil tetrazolo bromuro)]
  2. Sterilizzare le impalcature di dimensioni standard e posizionarle in 24 piastre di pozzo.
  3. Aggiungere 3T3-L1 cellule alla piastra del pozzo 24 e incubare per 72 ore.

6. Studi sugli animali in vivo

  1. Induzione di DM e ferita da escissione
    1. Nutrire l'animale con una dieta ricca di grassi per due settimane e somministrare una singola dose di streptozotocina (STZ) (50 mg/kg di peso corporeo) in soluzione tampone di citrato intraperitonealmente ai ratti albini Wistar (180-200 g) per l'induzione del diabete di tipo 2.
    2. Scegli gli animali con una glicemia costante di 250 mg / dL per lo studio.
    3. Randomizzare gli animali selezionati per l'induzione delle ferite da escissione.
    4. Anestetizzare i ratti diabetici usando etere dietile (5 mL sono stati aggiunti alla camera di anestesia precedentemente satura) e confermare l'uso del metodo del dito del piede e del colore della mucosa.
    5. Radere l'area dorsale (toracico dorsale, regione lombare) usando un trimmer asettico e lame (A40).
    6. Sterilizzare l'area rasata con un tampone alcolico.
    7. Asportare la pelle (2 x 2 cm2 e una profondità di 1 mm) con una lama chirurgica asettica A40 sulla zona rasata per creare una ferita aperta.
    8. Dividere gli animali in tre gruppi (Gruppo 1- Controllo malattie (Controllo), Ponteggio Gruppo 2- CL (Placebo), Gruppo 3- PONTE CL DOX), ogni gruppo composto da 6 ratti.
    9. Apporre le impalcature CL e DOX CL utilizzando nastro chirurgico e coprire il gruppo di controllo con garza sterile per 21 giorni.
    10. Tracciare l'area della ferita su un foglio OHP sterile e misurare la riduzione percentuale della ferita utilizzando il metodo della griglia nei giorni 0, 7, 14 e 21 per tutti i gruppi.
    11. Calcola la percentuale di riduzione della ferita usando le formule seguenti.
      figure-protocol-4

7. Studi istopatologici

  1. Isolare l'area ferita guarita nei giorni 7, 14 e 21, conservare in soluzione di formalina (10%).
  2. Se sezionere i tessuti utilizzando un microtomo per ottenere uno spessore di 6 μm.
  3. Montare le sezioni su uno scivolo di vetro e macchia utilizzando ematossilina ed eosina 17.
  4. Cattura le immagini con ingrandimento 40x utilizzando un microscopio digitale.

8. Stima dell'idrossiprolina

  1. Isolare l'area ferita guarita nei giorni 0, 7, 14 e 21 per la valutazione.
  2. Stimare il contenuto di idrossiprolina secondo la procedura descritta da Reddy G et al., 1996 22.

9. Test di Elisa

  1. Stimare i livelli MMP-9 utilizzando il kit Elisa secondo le istruzioni del produttore.
  2. Isolare i campioni di tessuto dall'area della ferita guarita il giorno 21 e tritare utilizzando un omogeneizzatore tissutale.
  3. Centrifugare l'omogeneato ottenuto e raccogliere il supernatante.
  4. Diluire il supernatante a 100 volte utilizzando il tampone di dosaggio.
  5. Scansionare la piastra utilizzando un lettore di lastre multiple.

10. Analisi statistica

  1. Rappresentare i risultati ottenuti come SD ± media.
  2. Eseguire l'analisi statistica utilizzando il prisma del pad Graph v5.01.
  3. Raggiungi la significatività statistica usando l'analisi a senso unico della varianza (ANOVA) e il test post hoc di Dunnet.
  4. Considerare significativi i valori con p≤0.05.

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Risultati

Caratterizzazione dell'impalcatura NCL e CL caricata da DOX
All'esame visivo, l'impalcatura NCL e CL è stata trovata di colore crema. Inoltre, entrambe le impalcature sembrano essere come una spugna, rigida e anelastica se esaminate fisicamente. Le immagini SEM delle impalcature NCL e CL sono mostrate nella figura 1. Dalla figura, era chiaro che c'era una diminuzione delle dimensioni dei pori dopo il collegamento incrociato formando collegamenti intermolecolari. Inoltre, ...

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Discussione

L'obiettivo principale di questo studio era determinare l'effetto dell'impalcatura COL-CS caricata da DOX sulla guarigione della DW nei ratti. CL e NCL sono stati preparati e valutati in termini di morfologia, indice di gonfiore, cinetica di rilascio in vitro e biocompatibilità.

Caratterizzazione dell'impalcatura NCL e CL caricata da DOX
Le impalcature preparate sono state trovate porose con pori interconnessi. Questi pori interconnessi assicurano la natura porosa e spugnos...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Dr. Ashish D Wadhwani. (Professore assistente e capo, Dipartimento di biotecnologie farmaceutiche, JSS College of Pharmacy, Ooty, India) per l'assistenza negli studi di vitalità cellulare in vitro.

Gli autori ringraziano il Dipartimento di Scienza e Tecnologia - Fondo per il miglioramento delle infrastrutture scientifiche e tecnologiche nelle università e nelle istituzioni educative superiori (DST-FIST), Nuova Delhi, per aver supportato il nostro dipartimento.

Gli autori ringraziano anche il Sig. Sanju. S e il signor Sriram. Narukulla M. Pharm studenti per il loro supporto nelle riprese video.

Questa ricerca è stata supportata dalla JSS Academy of Higher Education & Research (JSSAHER).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-etil-(3-3-dimetilamminopropil) cloridrato di carbodiimmide (EDC)Merck Millipore, Mumbai, IndiaE7750
2-(N-morfolino) acido solfonico (MES)Merck Millipore, Mumbai, India137074
3-(4,5 dimetiltiazolo-2 il) -2, 5-difenile tetrazolio bromuro (MTT)Thermo Fisher, Mumbai, IndiaM6494
Congelatore verticaleLabline Instruments, Kochi, India
Sacco per dialisiMerck Millipore, Mumbai, IndiaD6191-Larghezza media piana 25 mm (1,0 pollici), MWCO 12.000 Da
DoxiciclinaSigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, IndiaD9891
Kit ElisaR& D SystemsRMP900
Escherichia coli (E. coli)National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 2567
EthanolMerck Millipore, Mumbai, India100983
Lyophilizer-SZ042Strumenti da laboratorio Sub-Zero, Chennai, India
Agitatore meccanico-RQ-122/DStrumenti di laboratorio Remi, Mumbai, India
Chitosano SiscoResearch Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India18824
Microtome-RM2135Leica, Regno Unito
Cellule di fibroblasti embrionali di topo (3T3-L1)Centro nazionale per le scienze cellulari, Pune, India
Lettore di piastre multiple -Inifinte M200 ProTecan Strumenti, Svizzera
N-idrossi succinimide (NHS)Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)Collezionenazionale di microrganismi industriali, Pune, IndiaNCIM 2036
Microscopia elettronica a scansione (SEM)-S-4800Hitachi, India
Pellet di idrossido di sodio (NaOH)Qualigen fine chemicals, Mumbai, IndiaQ27815
Staphylococcus aureus (S. aureus)NationalCollection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis)Collezionenazionale di microrganismi industriali, Pune, IndiaNCIM 5270
Streptozotocina (STZ)Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India14653
Sigma chemicals Co. Ltdper ratto di tipo 1C7661
Ultravioletto... spettroscopia visibile-1700Shimadzu
Collagene , Mumbai, India

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