Preparazione rapida della griglia per la microscopia crioeletletnica risolta nel tempo

Sommario

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'uso di un dispositivo di creazione rapida della griglia sia per la creazione rapida della griglia che per la miscelazione e il congelamento rapidi per condurre esperimenti risolti nel tempo.

Abstract

Il campo della microscopia crioeletletnica (cryo-EM) si sta rapidamente sviluppando con nuovi hardware e algoritmi di elaborazione, producendo strutture a risoluzione più elevata e informazioni su sistemi più impegnativi. La preparazione dei campioni per la crio-EM sta subendo una rivoluzione simile con nuovi approcci in fase di sviluppo per sostituire i tradizionali sistemi di blotting. Questi includono l'uso di distributori piezoelettrici, la stampa a spillo e la spruzzatura diretta. Come risultato di questi sviluppi, la velocità di preparazione della griglia sta passando da secondi a millisecondi, offrendo nuove opportunità, specialmente nel campo della crio-EM risolta nel tempo in cui proteine e substrati possono essere rapidamente miscelati prima del congelamento a immersione, intrappolando stati intermedi di breve durata. Qui descriviamo, in dettaglio, un protocollo standard per la realizzazione di griglie sul nostro dispositivo EM interno con risoluzione temporale sia per la preparazione della griglia veloce standard che per gli esperimenti risolti nel tempo. Il protocollo richiede un minimo di circa 50 μL di campione a concentrazioni di ≥ 2 mg/mL per la preparazione di 4 griglie. Il ritardo tra l'applicazione del campione e il congelamento può essere di appena 10 ms. Una limitazione è l'aumento dello spessore del ghiaccio a velocità più elevate e rispetto al metodo di blotting. Speriamo che questo protocollo aiuti gli altri a progettare i propri dispositivi per la creazione di griglie e coloro che sono interessati a progettare esperimenti risolti nel tempo.

Introduzione

Sfondo
I recenti sviluppi della microscopia crioeletletnica (cryo-EM) hanno permesso studi strutturali di sistemi sempre più complessi ad alta risoluzione. Con poche eccezioni, tali studi sono stati limitati a macromolecole biologiche all'equilibrio¹ o reazioni relativamente lente². Molti processi in vivo avvengono su una scala temporale più veloce (millisecondi) e c'è un crescente interesse per la crio-EM risolta nel tempo (TrEM) su queste scale temporali³. Tuttavia, la preparazione convenzionale del campione crio-EM con il metodo di blotting è troppo lenta per il mil....

Protocollo

1. Preparazione del sistema

Nota : il protocollo seguente descrive come preparare le griglie di un singolo campione. Di solito, vengono preparate almeno 2 griglie di replica per ogni campione o condizione. Per velocità di immersione più elevate (meno di ~ 20 ms di ritardo), 3 o 4 griglie di replica sono in genere preparate per tenere conto di un numero ridotto di aree di ghiaccio sottile.

1. Diluire il campione proteico alla concentrazione target nel tampone desiderato. Tipicamente, le concentrazioni finali ≥ 2 mg / mL funzionano bene per la preparazione della griglia con il TED. Si noti che il campione può essere tenuto sul ghiaccio....

Risultati

Preparazione rapida della griglia con il TED
Come campione di prova per la preparazione rapida della griglia, abbiamo utilizzato apofertitina dalla milza equina a 20 μM in 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. Una ricostruzione con risoluzione di 3,5 Å è stata ottenuta da 690 micrografie come descritto nel rif.¹⁵ (Figura 7A). La gamma di sfocatura è stata scelta in modo che le particelle possano essere facilmente identificate nelle immagini grezze (

Discussione

I protocolli in questo lavoro possono essere utilizzati per la preparazione rapida della griglia mediante spruzzatura diretta ed esperimenti TrEM. La preparazione rapida della griglia può essere utilizzata per ridurre le interazioni delle particelle con l'interfaccia aria-acqua⁵. Le principali limitazioni sono la concentrazione del campione disponibile e lo spessore del ghiaccio sulla griglia. Entro questi limiti e a condizione che la qualità del campione sia buona, il protocollo produce griglie a.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dispositivo risolto nel tempo
scatola di vetro acrilico Regolatore	di
umidità/temperatura scientifico USA Regolatore			digitale di umidità/temperatura THE20
Cilindro pneumatico a doppio stelo Cilindro pneumatico	a doppio stelo Tubo
FEP	Upchurch Scientific 1/16" O.D., 0,01'' Ø 0.01'' Tubi
senza flangia	Upchurch Scientific Raccordi
tubi flessibili in PVC rinforzato Ø	12 mm Tubo flessibile in PVC rinforzato siringhe
in vetro	Kloehn 250 &; Pompa umidificatore a volume
	Interpret Aqua Air AP3
	di Thermo/FEI VitrobotTM Regolatore multistadio Mark IV
	Regolatore
Pinzetta
a pressione negativa Dumont N5 Inox Boscilloscopio	Hantek 6022BE oscilloscopio
tubo PE	Scientific Commodities Inc. 0.043" Diametro esterno, 0,015" Alimentatore per tubi
	Mean Well GSM160A24-R7B
Alimentatore	per KPS305D
Tubo in PU	SMC TU0425 4 mm O.D., 2,5 mm Regolatore per tubi
	Norgren R72G-2GK-RMN
Potenziometro
elettrovalvola	SMC NVJ314M elettrovalvola
pompe azionamento a siringa	Kloehn V6 48K modello
Reagenti & Materiali
apoferritina da milza equina	Sigma-Aldrich, A3660
ATP	Sigma-Aldrich, A2383
griglie crio-EM	Quantifoil 300 mesh Cu, R 1,2/1,3
EGTA	Sigma Aldrich E3889
F-actina	Fornito da H.D. White (per la procedura di preparazione, vedere il rif. < sup>1)
scaricatore di bagliore	Cressington 208 con unità
HEPES	Sigma-Aldrich, H7006
KAc	Sigma-Aldrich, P1190
MgCl2	Sigma-Aldrich, M8266
MOPS	Sigma-Aldrich, M1254
NaCl	Sigma-Aldrich, S9888
Miosina muscolare scheletrica S1	Fornito da H.D. White (per la procedura di preparazione, vedi rif. 2)
Ref 1	Spudich, J. A. & Watt, S. La regolazione della contrazione del muscolo scheletrico del coniglio I. Studi biochimici dell'interazione del complesso tropomiosina-troponina con l'actina e i frammenti proteolitici della miosina. Giornale di chimica biologica 246, 4866-4871 (1971).
Rif. 2	Bianco, H. & Taylor, E. Energetica e meccanismo dell'actomiosina adenosina trifosfatasi. Biochimica 15, 5818-5826 (1976).