Qui viene presentato un protocollo per l'etichettatura metabolica del lievito con acido 14C-acetico, che è accoppiato con cromatografia a strato sottile per la separazione dei lipidi neutri.
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Articolo metodologico
Analisi della sintesi lipidica neutra in Saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica e cromatografia su strato sottile
In questo articolo
Sommario
Abstract
I lipidi neutri (NL) sono una classe di biomolecole idrofobiche e senza carica che svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi energetica e lipidica. I NT sono sintetizzati de novo dall'acetil-CoA e sono presenti principalmente negli eucarioti sotto forma di trigliceridi (TG) e esteri di sterolo (SE). Gli enzimi responsabili della sintesi dei NL sono altamente conservati da Saccharomyces cerevisiae (lievito) all'uomo, rendendo il lievito un organismo modello utile per sezionare la funzione e la regolazione degli enzimi del metabolismo NL. Mentre si sa molto su come l'acetil-CoA viene convertito in un insieme diversificato di specie NL, i meccanismi per regolare gli enzimi del metabolismo NL e come la cattiva regolazione può contribuire alle patologie cellulari, sono ancora in fase di scoperta. Numerosi metodi per l'isolamento e la caratterizzazione delle specie NL sono stati sviluppati e utilizzati nel corso di decenni di ricerca; tuttavia, non è stato discusso un protocollo quantitativo e semplice per la caratterizzazione completa delle principali specie nl. Qui viene presentato un metodo semplice e adattabile per quantificare la sintesi de novo delle principali specie di NL nel lievito. Applichiamo l'etichettatura metabolica dell'acido C-acetico 14accoppiata con la cromatografia a strato sottile per separare e quantificare una vasta gamma di NL fisiologicamente importanti. Inoltre, questo metodo può essere facilmente applicato per studiare i tassi di reazione in vivo degli enzimi NL o la degradazione delle specie NL nel tempo.
Introduzione
L'acetil-CoA è l'elemento fondamentale di diverse biomolecole, compresi i lipidi neutri (NL), che fungono da valuta biomolecolare versatile per la costruzione di membrane, la generazione di ATP e la regolazione della segnalazione cellulare1,2. La disponibilità di NL da deviare in uno qualsiasi di questi rispettivi percorsi è, in parte, regolata dal loro stoccaggio. Le goccioline lipidiche (LD), organelli citoplasmatici composti da nuclei idrofobici di trigliceridi (TG) ed esteri di sterolo (SE), sono i principali compartimenti di stoccaggio della maggior parte dei NL cellulari. Come tali, i LD sequestrano e re....
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Protocollo
1. Crescita ed etichettatura delle cellule di lievito con acido 14C-acetico
- Inoculare una coltura di lievito raccogliendo una colonia da un piatto ed erogandola in 20 ml di mezzi sintetici completi (SC) contenenti il 2% di destrosio (vedere File supplementare per la ricetta dei mezzi SC). Incubare a 30 °C per la notte con agitazione a 200 giri/min.
NOTA: le condizioni di crescita, il volume del campione e il trattamento differiranno in base ai lipidi di interesse. Prima di eseguire esperimenti completi, le condizioni di crescita ottimali e i volumi di coltura dovrebbero essere determinati empiricamente. Questo protocollo discut....
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Risultati
In questo protocollo, abbiamo dimostrato che l'etichettatura, il rilevamento e la quantificazione delle specie NL possono essere realizzati mediante l'etichettatura metabolica dell'acido C-acetico 14. Le principali specie di NL possono essere separate in un sistema solvente di 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Esano:Etere di petrolio:Etere etilico:Acido acetico (Figura 1A,B). L'imaging al fosforo consente la visualizzazione di acidi grassi liberi etichettati (FFA), triacilgli.......
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Discussione
Qui viene presentato un versatile protocollo di radioelabazione per monitorare quantitativamente la sintesi delle specie NL nel lievito. Questo protocollo è molto modulare, il che consente di terminare la procedura entro 3-6 giorni. Inoltre, esiste una vasta letteratura sull'uso di TLC per separare specie lipidiche e metaboliti, che dovrebbe consentire all'utente di rilevare diverse specie lipidiche di interesse con un semplice cambiamento dei sistemi solventi TLC16,19.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non ci sono interessi concorrenti nella preparazione di questo manoscritto.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Henne per l'aiuto e la consulenza concettuale nel completamento di questo studio. W.M.H. è sostenuta da fondi della Welch Foundation (I-1873), del NIH NIGMS (GM119768), dell'Ara Paresghian Medical Research Fund e dell'UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R è stata supportata da una sovvenzione del programma T32 (5T32GM008297).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| [1-C14] Acido acetico sale sodico attività specifica: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof etanolo | assoluto Sigma | 459836 | |
| Perle di vetro lavate con acido 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Bulbi ambrati per pipette Pastuer | Fisher | 03-448-24 | |
| Solfato di ammonio >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 Contatore a scintillazione | PerkinElmer | A481000 | |
| Cloroformio (grado HPLC) | Fisher | C607SK | |
| Colesterolo >99% | Sigma | C8667 | |
| Colesteril-linoleato >98% | Sigma | C0289 | |
| Acido solforico concentrato | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL provette coniche, polipropilene con tappo centristar | Sigma | CLS430829 | |
| Destrosio, grado anidro | Sigma | D9434 | |
| Etere dietilico grado anidro | Sigma | 296082 | |
| Forno di essiccazione | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuga | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Schermo al fosforo di stoccaggio | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Acido acetico glaciale, grado | ACS Sigma | 695092 | |
| Fiale di scintillazione in vetro da 6 ml | Sigma | M1901 | |
| Tappi per provette da centrifuga in vetro | Fisher | 14-595-36A | |
| Provette per centrifuga in vetro | Fisher | 14-595-35A | |
| Pipetta Pasteur in vetro | Fisher | 13-678-20C | |
| Esano, grado anidro | Sigma | 296090 | |
| L-Adenina >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanina >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginina >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagina >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartato >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cisteina >97% | Sigma | W326305 | |
| Acido L-glutammico sale monosodico monoidrato >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutammina >99% | Sigma | G3126 | |
| L-glicina >99% | Sigma | G8898 | |
| L-istidina >99% | Sigma | H8000 | |
| L-isoleucina >98% | Sigma | I2752 | |
| L-leucina >98% | Sigma | L8000 | |
| L-lisina >98% | Sigma | L5501 | |
| L-metionina, grado HPLC | Sigma | M9625 | |
| L-Fenilalanina, grado reattivo | Sigma | P2126 | |
| L-Prolina >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serina >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Teronina, grado reagente | Sigma | T8625 | |
| L-Triptofano >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tirosina >98% | Sigma | T3754 | |
| L-uracile >99% | Sigma | U0750 | |
| L-valina >98% | Sigma | V0500 | |
| Metanolo, grado ACS Fisher | A412 | ||
| Acido oleico >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldeide | Sigma | A88107 | |
| Etere di petrolio, grado ACS | Sigma | 184519 | |
| Fosfatidilcolina, dipalmitoil >99% | Pipette Sigma | P1652 | |
| Eppendorf | 2231000713 | ||
| Sigma | P3911 | di grado ACS | |
| , certificato ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Acido | S3626 | |
| cristallino/certificato | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC tampone di saturazione | Sigma | Z265225 | |
| TLC gel di silice 60G piastra canalizzata in vetro | Fisher | NC9825743 Nessun indicatore fluorescente | |
| Film plastico trasparente | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Trioleina >99% | Sigma | T7140 | |
| Miscelatore a vortice | Fisher | 02-215-414 | |
| Cassetta di esposizione Whatman | Sigma | WHA29175523 | |
| Lievito a base azotata senza solfato di ammonio e aminoacidi | Sigma | Y1251 |
Riferimenti
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L.
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Ristampe e permessi
