Questo protocollo descrive un metodo per generare grandi volumi di microbolle di decafluorobutano incapsulate lipidiche utilizzando la sonicazione a punta di sonda e successivamente condensarle in nanogoccioline a sfasamento utilizzando l'estrusione ad alta pressione e la filtrazione meccanica.
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Articolo metodologico
Produzione di nanogoccia di decafluorobutano a spostamento di fase filtrate a membrana da microbolle preformate
In questo articolo
Sommario
Abstract
Esistono molti metodi che possono essere utilizzati per la produzione di goccioline a sfasamento vaporizzabili per l'imaging e la terapia. Ogni metodo utilizza tecniche diverse e varia nel prezzo, nei materiali e nello scopo. Molti di questi metodi di fabbricazione si traducono in popolazioni polidisperse con soglie di attivazione non uniformi. Inoltre, il controllo delle dimensioni delle goccioline richiede in genere liquidi perfluorocarburi stabili con soglie di attivazione elevate che non sono pratiche in vivo. Produrre goccioline di dimensioni uniformi utilizzando gas a basso punto di ebollizione sarebbe utile per gli esperimenti di imaging e terapia in vivo. Questo articolo descrive un metodo semplice ed economico per la formazione di nanogoccioline a sfasamento stabilizzate con lipidi filtrati con defluorobutano a basso punto di ebollizione (DFB). Viene descritto un metodo comune per generare microbolle lipidiche, oltre a un nuovo metodo per condensarle con estrusione ad alta pressione in un unico passaggio. Questo metodo è progettato per risparmiare tempo, massimizzare l'efficienza e generare volumi maggiori di soluzioni di microbolle e nanogoccioline per un'ampia varietà di applicazioni utilizzando apparecchiature di laboratorio comuni presenti in molti laboratori biologici.
Introduzione
Gli agenti di contrasto ad ultrasuoni (UCA) stanno rapidamente crescendo in popolarità per le applicazioni di imaging e terapia. Le microbolle, gli UCA originali, sono attualmente gli agenti principali utilizzati nelle applicazioni diagnostiche cliniche. Le microbolle sono sfere piene di gas, tipicamente di 1-10 μm di diametro, circondate da gusci lipidici, proteici o polimerici1. Tuttavia, le loro dimensioni e la stabilità in vivo possono limitare la loro funzionalità in molte applicazioni. Le nanogoccioline a sfasamento, che contengono un nucleo liquido surriscaldato, possono superare alcune di queste limitazioni a causa delle loro dimensioni....
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Protocollo
1. Fare film lipidici
- Preparare i film lipidici per la generazione di microbolle utilizzando il 90% di DSPC e il 10% di DSPE-PEG2K mescolando i lipidi al rapporto corretto utilizzando le seguenti indicazioni:
- Produrre lipidi di riserva di DSPC e DSPE-PEG2K in cloroformio. Pesare 50 mg di ogni polvere lipidica in flaconcini separati. Aggiungere 1 mL di cloroformio a ciascun flaconcino utilizzando una siringa di vetro da 1 mL.
- Aggiungere 287 μL di DSPC stock e 113 μL di DSPE-PEG2K stock (entrambi 50 mg/mL) in un flaconcino a scintillazione da 20 mL utilizzando una siringa di vetro.
- Asciugare i lipidi misti per rimuovere il clorofo....
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Risultati
I risultati rappresentativi della distribuzione dimensionale sono inclusi utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS) e l'analisi TRSP (Tunable Resistive Pulse Sensing). La Figura 5 mostra la distribuzione dimensionale delle soluzioni a bolle condensate con e senza estrusione. Senza estrusione, il protocollo termina al passaggio 5.3. Le bolle refrigerate vengono condensate sfogando il campione alla pressione atmosferica mentre è freddo. Il campione condensato ha una distribuzione mol.......
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Discussione
È disponibile un corpus completo di letteratura che discute la formulazione, la fisica e le potenziali applicazioni di microbolle e goccioline a sfasamento per l'imaging e la terapia in vivo. Questa discussione riguarda esplicitamente la generazione di microbolle lipidiche e la loro conversione in goccioline a sfasamento sub-micron utilizzando un gas DFB a basso punto di ebollizione ed estrusione ad alta pressione. Il metodo qui delineato ha lo scopo di fornire un metodo relativamente semplice per produrre grandi quantit.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Dominique James nel laboratorio del Dr. Ken Hoyt per aver fornito l'analisi TRSP di nanogoccioline a sfasamento vaporizzabili
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da centrifuga da 15 mL Falcon | 352095 | Raccolta e centrifugazione delle goccioline | |
| Filtro in policarbonato da 200 nm | Whatman | 110606 | Filtri per estrusori |
| 2-metilbutano | Fisher Chemical | 03551-4 | Preraffreddamento rapido della soluzione di microbolle prima dell'estrusione |
| Morsetti a 3 poli X2 | Fisher | 02-217-002 | Mantenimento in posizione delle fiale di scintilazione per sonicazione della punta della sonda |
| Sonicatore analogico della punta della sonda da 400 W con corno | Branson | 101-063-198R | Utilizzato per generare microbolle lipidiche dalla soluzione lipidica |
| Sonicatore da bagno | Fisher Scientific | 15337402 | Utilizzato per aiutare a scomporre i liposomi in vescicole unilamellari |
| Cloroformio | Fisher Bioreagenti | C298-4 | Utilizzato per produrre film lipidici per la preparazione di microbolle |
| Decafluorobutano (Perfluorobutano) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | che genera microbolle tramite sonicazione della punta della sonda |
| Ghiaccio secco | - | Preraffreddamento rapido della soluzione di microbolle prima dell'estrusione | |
| DSPC Polvere lipidica | NOF America | COATSOME MC-8080 | Componente del film lipidico |
| DSPE-PEG-2K Polvere lipidica | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Componente del film lipidico |
| Termometro generale | - | - | Utilizzato per misurare la temperatura del bagno di ghiaccio e la temperatura del 2-metilbutano (deve adattarsi a temperature di -20°C) |
| Siringhe di vetro | Hamilton | 81139 | Utilizzato per miscelare i lipidi nel cloroformio |
| Glicerolo | Fisher Bioreagenti | BP229-1 | Riduce la temperatura di congelamento della soluzione PBS |
| Blocco riscaldante | VWR Scientific Products | Riscaldamento di film lipidici e goccioline di vaporizzazione | |
| Lipex 10 Estrusore mL | Evonik | Sistema di estrusione commerciale ad alta pressione | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher marca | 14-955-151 | Utilizzato per rimuovere il cloroformio in eccesso dai film lipidici |
| Serbatoio di azoto | - | Utilizzato per far funzionare l'estrusore | |
| Tampone fosfato Soluzione salina | Fisher Scientific Hydrate | film lipidici e goccioline di lavaggio | |
| Disco | di scarico in poliestereWhatman | 230600 | Fornisce supporto per filtro in policarbonato |
| Tappi in polipropilene | Fisher Scientific | 298417 | Utilizzato per la conservazione della soluzione |
| Glicole propilenico | Fisher Chemical | P355-1 | Riduce la temperatura di congelamento della soluzione PBS |
| Fiale di scintilazione | DWK Life Sciences | Wheaton 986532 | Utilizzato per film lipidici e generazione di microbolle |
| Piccolo martello | - | Utilizzato per rompere il ghiaccio secco per il raffreddamento del metilbutano | |
| Sonicatore Attacco per micropunte | Branson | 101148070 | Utilizzato per generare microbolle dalla soluzione lipidica |
| Contenitore in acciaio | Medegen | 79310 | Preraffreddamento rapido della soluzione di microbolle prima dell'estrusione (qualsiasi contenitore valutato a -20C funzionerà) |
| Essiccatore sottovuoto | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Rimuove l'eccesso di cloroformio dai film lipidici |
| Provetta da centrifuga da 2 ml | Fisher | 02682004 | Utilizzato per concentrare le nanogoccioline |
Riferimenti
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current ....
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Ristampe e permessi
