Questo studio presenta l'applicazione di fette di tessuto pancreatico vivo allo studio della fisiologia delle isole e delle interazioni isolotto-cellula immunitaria.
Articolo metodologico
Questo studio presenta l'applicazione di fette di tessuto pancreatico vivo allo studio della fisiologia delle isole e delle interazioni isolotto-cellula immunitaria.
Le fette di tessuto pancreatico vivo consentono lo studio della fisiologia e della funzione delle isole nel contesto di un microambiente di isole intatte. Le fette sono preparate da tessuto pancreatico umano e di topo vivo incorporato nell'agarosio e tagliate usando un vibratoma. Questo metodo consente al tessuto di mantenere la vitalità e la funzione oltre a preservare patologie sottostanti come il diabete di tipo 1 (T1D) e di tipo 2 (T2D). Il metodo slice consente nuove direzioni nello studio del pancreas attraverso il mantenimento delle strutture complesse e delle varie interazioni intercellulari che comprendono i tessuti endocrini ed esocrini del pancreas. Questo protocollo dimostra come eseguire la colorazione e la microscopia time-lapse di cellule immunitarie endogene vive all'interno di fette pancreatiche insieme a valutazioni della fisiologia delle isole. Inoltre, questo approccio può essere perfezionato per discernere le popolazioni di cellule immunitarie specifiche per gli antigeni delle cellule insulari utilizzando i principali reagenti multimero complesso di istocompatibilità.
Il coinvolgimento del pancreas è patognomonico a malattie come pancreatite, T1D e T2D1,2,3. Lo studio della funzione in isole isolate di solito comporta la rimozione delle isole dal loro ambiente circostante4. Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo è stato sviluppato per consentire lo studio del tessuto pancreatico mantenendo intatti i microambienti delle isole ed evitando l'uso di stressanti procedure di isolamento delle isole5,6,7. Le fette di tes....
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NOTE: Tutti i protocolli sperimentali che utilizzano topi sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Florida (201808642). Sezioni pancreatiche umane da donatori di tessuti di entrambi i sessi sono state ottenute tramite la banca dei tessuti Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD), Università della Florida. I pancreati umani sono stati prelevati da donatori di organi cadaverici da organizzazioni certificate di approvvigionamento di organi che collaborano con nPOD in conformità con le leggi e i regolamenti sulla donazione di organi e classificati come "soggetti non umani" dall'Università della Florida Insti....
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Questo protocollo produrrà fette di tessuto pancreatico vivo adatte sia per studi di funzionalità che per registrazioni di cellule immunitarie. L'aspetto delle sezioni sia in campo luminoso che sotto la luce riflessa è mostrato nella Figura 1A,B. Come discusso, le isole possono essere trovate in fette usando la luce riflessa a causa della loro maggiore granularità che si verifica a causa del loro contenuto di insulina (Figura 1C) e sono chiarame.......
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L'obiettivo di questo protocollo è quello di spiegare la generazione di fette di pancreas e le procedure necessarie per impiegare le fette in studi funzionali e immunologici. Ci sono molti vantaggi nell'uso di fette pancreatiche vive. Tuttavia, ci sono diversi passaggi critici che sono essenziali affinché il tessuto rimanga vitale e utile durante i protocolli di esperimento descritti. È imperativo lavorare rapidamente. Il periodo di tempo tra l'iniezione del pancreas e la generazione delle fette sul vibratoma dovrebbe es.......
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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Questo lavoro è stato finanziato dalle sovvenzioni NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 e P01 AI042288. Questa ricerca è stata condotta con il supporto del Network for Pancreatic Organ donors with Diabetes (nPOD; RRID: SCR_014641), un progetto collaborativo di ricerca sul diabete di tipo 1 sponsorizzato da JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) e The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Il contenuto e le opinioni espresse sono responsabilità degli autori e non riflettono necessariamente il punto di vista ufficiale di nPOD. Le organizzazioni di approvvigionamento di organi (OPO) che collaborano con nPOD per fornire risors....
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| #3 Manico per bisturi stile | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | Tampone HEPES, soluzione 1M |
| Piatto di coltura non trattato 10 cm | Corning | 430591 | |
| Siringa Luer-Lok da 10 ml Siringa | BD | 301029 | BD con punte Luer-Lok |
| Ago da 27 g | BD | BD 305109 | Aghi ipodermici BD per uso generale e PrecisionGlide |
| Piastra di Petri da 35 mm con fondo in vetro | Ibidi | 81156 | µ-Piastra da 35 mm, alta |
| 50 mL Siringa | BD | 309653 | |
| Coverglass a 8 pozzetti | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-topo CD8a anticorpo | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Cloruro di calcio | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Cloruro di calcio diidrato | Sigma | C7902 | CaCl2 (diidrato) |
| Rocker digitale compatto | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Microscopio confocale a scansione laser | Leica | SP8 | Pinhole = 1,5-2 unità ariose; acquisito con apertura numerica 10x/0,40 HC PL APO CS2 dry e 20x/0,75 con apertura numerica HC PL APO CS2 dry a 512 &volte; &sottile; Risoluzione 512 pixel |
| D-(+)-Glucosio | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Ditizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimetilsolfossido |
| Etanolo | Decon Laboratories | 2805 | |
| Piatto per coltura tissutale Falcon da 35 mm | Corning | 353001 | Piastre per coltura tissutale Falcon Easy-Grip FBS |
| Gibco | |||
| Feather No. 10 Surgical Blade | Microscopia elettronica | Scienze 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | Indicatore Ca2+ permeabile |
| alle cellule Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forcipe | Strumenti per la scienza fine | 11049-10 | |
| Forbici fini temprate | Strumenti per la scienza fine | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco 14025092 | Matasse Soluzione salina bilanciata | |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Secchiello per il ghiaccio | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurano | Patterson Veterinario | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Morsetto | Roboz Negozio chirurgico | RS-7440 | Diritto; 500-900 grammi di pressione; 1,5" di lunghezza |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes&commercio; Tergicristalli per attività delicate, |
| kit di vitalità/citotossicità a 2 strati LIVE/DEAD | Invitrogen | L3224 | Questo kit contiene il colorante per cellule vive calcein-AM. |
| DMEM a basso contenuto di glucosio | Corning | 10-014-CV | |
| Cloruro di magnesio esaidrato | Sigma | M9272 | MgCl2 (esaidrato) |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Sigma | M2773 | MgSO4 (eptaidrato) |
| Piattaforma riscaldata magnetica | Warner Instruments | PM-1 | Piattaforma per camera di imaging per stimolazione dinamica registrazioni |
| Microonde | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Filtro per siringa | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Camera di imaging a bagno di diamante aperto | Warner Instruments | RC-26 | Camera di imaging per registrazioni di stimolazione dinamica |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | Indicatore | Ca2+ permeabile alle cellule |
| Okolab | H201-LG | ||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | Per produrre agarosio per la generazione di |
| fette Tetramero insulina marcato con PE | Emory Tetramer Research | YAIENYLEL | |
| Penicillina Streptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Cloruro di potassio | Sigma | P5405 | KCl |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades Scienze | microscopia elettronica | 71998 | per vibratomo; Acciaio inossidabile a doppio bordo, non rivestito |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque agarosio a basso punto di fusione | Lonza | 50101 | Per produrre agarosio per la generazione di fette |
| Ancoraggio a fette | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Ancoraggio a fette (imaging dinamico) | Warner Instruments | 640253 | Ancoraggio a fette per camera |
| di imaging dinamicoBicarbonato di sodio | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Cloruro di sodio | Sigma | S5886 | NaCl |
| Fosfato di sodio monoidrato | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monoidrato) |
| Inibitore della tripsina di soia | Sigma | T6522-1G | Inibitore della tripsina da Glycine max (soia) |
| Stadio Adattatore | Warner Instruments | SA-20MW-AL | Per adattarsi alla camera di imaging per le registrazioni di stimolazione dinamica sul tavolino del microscopio |
| Incubatore da palco | Stereoscopio Okolab | H201 | |
| Leica | IC90 E MSV266 | ||
| SYTOX Colorazione blu a cellule morte | Invitrogen | S34857 | colorazione fluorescente blu per acido nucleico |
| Trasferimento Pipet | Falcon | 357575 | Falco & commercio; Pipette di trasferimento monouso in plastica |
| Sistema di controllo della valvola | Warner Instruments | VCS-8 | Sistema per registrazioni di stimolazione dinamica |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S Bagnomaria | |
| Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp Bagnomaria Deluxe per uso generico GPD 02 |
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