Articolo metodologico

Immunofluorescenza a doppia marcatura utilizzando anticorpi della stessa specie per studiare le interazioni ospite-patogeno

DOI:

10.3791/62219

⸱

10 luglio 2021

 ,  , 
1Laboratory of Cell and Molecular Biology of Trypanosomatids, Department of Cellular and Molecular Biology and Pathogenic Bioagents, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, il protocollo descrive come eseguire l'immunofluorescenza a doppia marcatura utilizzando anticorpi primari allevati nella stessa specie per studiare le interazioni ospite-patogeno. Inoltre, può includere il terzo anticorpo di un ospite diverso in questo protocollo. Questo approccio può essere fatto in qualsiasi tipo di cellula e agenti patogeni.

Abstract

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Al giorno d'oggi, è possibile trovare una vasta gamma di strumenti molecolari disponibili per studiare le interazioni parassita-cellula ospite. Tuttavia, esistono alcune limitazioni per ottenere anticorpi commerciali monoclonali o policlonali che riconoscono specifiche strutture cellulari e proteine nei parassiti. Inoltre, ci sono pochi anticorpi commerciali disponibili per etichettare i tripanosomatidi. Di solito, gli anticorpi policlonali contro i parassiti sono preparati internamente e potrebbero essere più difficili da usare in combinazione con altri anticorpi prodotti nella stessa specie. Qui, il protocollo dimostra come utilizzare anticorpi policlonali e monoclonali allevati nella stessa specie per eseguire l'immunofluorescenza a doppia etichettatura per studiare le interazioni tra cellule ospiti e patogeni. Per ottenere la doppia marcatura immunofluorescenza, è fondamentale incubare prima l'anticorpo policlonale di topo e poi seguire l'incubazione con l'anticorpo secondario IgG di topo coniugato a qualsiasi fluorocromo. Successivamente, è necessaria un'ulteriore fase di blocco per evitare che qualsiasi traccia dell'anticorpo primario venga riconosciuta dall'anticorpo secondario successivo. Quindi, un anticorpo monoclonale di topo e il suo specifico anticorpo secondario della sottoclasse IgG coniugato a un fluorocromo diverso vengono aggiunti al campione nei momenti appropriati. Inoltre, è possibile eseguire l'immunofluorescenza a tripla marcatura utilizzando un terzo anticorpo allevato in una specie diversa. Inoltre, strutture come nuclei e actina possono essere colorate successivamente con i loro composti o etichette specifici. Pertanto, questi approcci qui presentati possono essere regolati per qualsiasi cellula le cui fonti di anticorpi primari sono limitate.

Introduzione

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Studiare l'interazione del patogeno con la cellula ospite a livello cellulare fornisce informazioni essenziali sulle cause alla base della malattia poiché diversi gruppi, come virus, batteri e protozoi, possono infettare la maggior parte dei tipi di cellule ospiti1,2,3,4. Può anche aiutare a sviluppare e identificare potenziali bersagli terapeutici che possono rallentare o inibire la crescita del patogeno. In condizioni vive, gli anticorpi prodotti sono responsabili del riconoscimento di autocomponenti, antigeni da virus, componenti o prodotti batterici, funghi, parassiti e altri5.

A tale scopo, gli anticorpi sono strumenti ampiamente utilizzati, principalmente per comprendere la posizione e la funzione delle strutture cellulari e delle proteine. Diversi studi che utilizzano l'etichettatura multipla degli anticorpi dimostrano che ulteriori fasi di blocco contribuiscono alla specificità dell'immunolocalizzazione. Inoltre, la maggior parte dei protocolli descritti utilizza anticorpi monoclonali commerciali specifici, inclusi anticorpi della stessa specie ospite6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Di solito, l'immunofluorescenza a doppia etichettatura utilizza due anticorpi allevati in specie diverse per macchiare le strutture cellulari di interesse o i patogeni e le cellule ospiti per vedere l'interazione tra di loro. Tuttavia, questo può essere un problema quando non sono disponibili anticorpi commerciali monoclonali o policlonali specifici per alcuni agenti patogeni per eseguire la doppia etichettatura. Inoltre, esistono kit di coniugazione anticorpale disponibili in commercio ed è possibile coniugare gli anticorpi primari direttamente al fluoroforo mediante una reazione di estere succinimidile15. Il problema è che questi kit sono spesso costosi ed è necessario avere abbastanza anticorpi per etichettarli. Sapendo questo, abbiamo sviluppato con successo un metodo di doppia immunofluorescenza utilizzando due diversi anticorpi allevati nella stessa specie per studiare la localizzazione delle proteine nel Trypanosoma brucei16. Tuttavia, per i parassiti intracellulari, tra cui Trypanosoma cruzi, questo approccio non è stato dimostrato. Qui, mostriamo come eseguire l'immunofluorescenza a doppia marcatura per studiare i parassiti intracellulari di T. cruzi e la cellula ospite utilizzando anticorpi primari allevati nella stessa specie senza reazioni crociate. Oltre a questo metodo, è stata stabilita una tripla etichettatura di immunofluorescenza con l'aggiunta del terzo anticorpo di una specie diversa. Questi approcci aiutano quando la fonte di anticorpi è limitata e può essere utilizzata in qualsiasi tipo di cellula.

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Protocollo

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1. Colture cellulari e parassitarie

  1. Coltiva cellule LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) dell'American Type Culture Collection (CCL-7) in un pallone di coltura cellulare di 25 cm2 contenente in mezzo RPMI integrato con il 10% di FBS (fetale bovino sierico) e antibiotici inattivati dal calore (100 U / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina) a 37 ° C nel 5% di CO2 17.
  2. Infettare le cellule LLC-MK2 con Trypanosoma cruzi (ceppo Y) secondo un precedente protocollo 18.
  3. Raccogliere il surnatante delle cellule infette LLC-MK2 (5 mL) in un tubo centrifugo conico per colture cellulari da 15 mL e centrifugare a 500 x g per 10 minuti e 22 °C per abbassare i detriti cellulari. Tenere il tubo per 10 minuti a 37 °C per consentire ai tripomastitonti di nuotare fino al surnatante.
  4. Raccogliere il surnatante in un nuovo tubo conico e centrifugare a 2500 x g per 15 minuti a 22 °C. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet contenente i parassiti in mezzo RPMI completo per determinare la densità cellulare contando le cellule in una camera Neubauer.

2. Protocollo di immunofluorescenza di controllo

NOTA: Una volta fissate, è possibile conservare piastre contenenti coverslips a 4 °C in 1x PBS (pH 7,2) per una settimana. Per essere conservati, è importante che le cellule non abbiano attraversato la fase di permeabilizzazione.

  1. Depositare le celle LLC-MK2 (2 x 104) in 24 piastre di pozzo contenenti coverslip arrotondati sterilizzati UV in supporti RPMI per 16 ore.
  2. Per le cellule infette, aggiungere un surnatante contenente T. cruzi (punto 1.4) a ciascun pozzetto in proporzione (MOI 10:1) e lasciare per 6 ore di infezione. Lavare i coverslip contenenti cellule infette e non infette cinque volte con soluzione pbs e fissati con paraformaldeide al 2% in 1x PBS (pH 7,2) per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
  3. Lavare le coverslip tre volte per 5 minuti ciascuna con 1x PBS (pH 7,2).
  4. Permeabilizzare i coverslip con 0,2% IGEPAL CA-630 in 1x PBS (PH 7.2) per 10 min a RT.
  5. Lavare le coverslip tre volte per 5 minuti ciascuna con 1x PBS.
  6. Incubare i coverslip per 30 minuti a RT con la soluzione bloccante (2% BSA in 1x PBS, pH 7,2).
  7. Incubare le coperture per 30 minuti a RT con anticorpi monoclonali anti-hnRNPA1 di topo (diluizione 1:200) o con anticorpi policlonali anti-TcFAZ (diluizione 1:100) di topo diluiti in soluzione bloccante.
  8. Lavare le coverslip tre volte per 5 minuti ciascuna con 1x PBS.
  9. Incubare i coverslips per 30 min a RT con capra anti-topo IgG F (ab')2 (H+L) coniugato ad Alexa Fluor 488 (1:600) insieme a falloidina coniugata ad Alexa 594 (1:300) per macchiare filamenti di actina (F-actina) nella cellula ospite diluita nella soluzione bloccante.
  10. Lavare tre volte con 1x PBS (pH 7,2) per 5 minuti ciascuno.
  11. Applicare una piccola quantità di reagente di montaggio antideflagrante ProLong Gold con mezzo DAPI sulla superficie del vetrino.
  12. Usando la pinza, inclinare delicatamente il coperchio nel mezzo di montaggio per evitare la formazione di bolle. Una volta asciutto, sigillare il coperchio, se lo si desidera.

3. Protocollo di immunofluorescenza a doppia etichettatura utilizzando anticorpi monoclonali e policlonali allevati nello stesso ospite

  1. Ripetere i passaggi da 2.1 a 2.6 descritti sopra.
  2. Incubare coverslip contenenti cellule infette e non infette con anticorpo policlonale anti-TcFAZ di topo interno (1:100) diluito in soluzione bloccante per 30 minuti a RT.
  3. Lavare le coverslip tre volte per 5 minuti ciascuna con 1x PBS.
  4. Incubare coverslips per 30 min a RT con capra anti-topo IgG F (ab')2 (H+L) coniugato ad Alexa Fluor 647 (1:600) diluito nella soluzione bloccante.
  5. Lavare le coverslip tre volte per 5 minuti ciascuna con 1x PBS.
  6. Eseguire la seconda fase di blocco con AffiniPure coniglio anti-topo IgG (H+L) diluito (0,12 mg/mL) in soluzione bloccante per 30 minuti a RT.
  7. Lavare le coverslip tre volte con 1x PBS (pH 7,2) per 5 minuti ciascuna. Quindi incubare con l'anticorpo monoclonale anti-hnRNP A1 IgG2b di topo (1:200) per 30 minuti a RT.
  8. Lavare le coverslip tre volte per 5 minuti ciascuna con 1x PBS.
  9. Incubare i coverslips per 30 min con l'anticorpo IgG2b anti-topo di capra coniugato ad Alexa Fluor 488 (1:600) e con falloidina coniugata ad Alexa 594 (1:300) diluita nella soluzione bloccante.
  10. Lavare le coverslip tre volte per 5 minuti ciascuna con 1x PBS.
  11. Ripetere i passaggi da 2.8 a 2.10 descritti sopra.

4. Protocollo di immunofluorescenza a tripla marcatura con l'aggiunta del terzo anticorpo policlonale di diverse specie ospiti

NOTA: Per l'etichettatura aggiuntiva, notare le sottoclassi IgG, gli isotipi anticorpali e seguire l'ordine degli anticorpi: 1. policlonale di topo, 2. policlonale di coniglio, 3. secondo blocco e 4. monoclonale di topo. Considerare il tipo di laser disponibili nel microscopio confocale per scegliere l'anticorpo secondario coniugato con fluoroforo corretto.

  1. Ripetere i passaggi da 2.1 a 2.6 descritti sopra.
  2. Dopo i passaggi da 3.2 a 3.5 (fase di lavaggio), iniziare una nuova incubazione con anticorpo policlonale di coniglio in soluzione bloccante per 30 minuti a RT.
  3. Lavare le coverslip tre volte con 1x PBS (pH 7,2) per 5 minuti ciascuna.
  4. Incubare i coverslip con l'anticorpo anti-coniglio di capra IgG coniugato ad Alexa 647 (1:600) in soluzione bloccante per 30 minuti.
  5. Lavare le coverslip tre volte per 5 minuti ciascuna con 1x PBS.
  6. Eseguire una fase di blocco con AffiniPure coniglio anti-topo IgG (H+L) diluito (0,12 mg/mL) in soluzione bloccante per 30 minuti a RT.
  7. Lavare le coverslip tre volte con 1x PBS (pH 7,2) per 5 minuti ciascuna e incubare con qualsiasi anticorpo monoclonale di topo della sottoclasse IgG diluito in soluzione bloccante per 30 minuti.
  8. Lavare le coverslip tre volte per 5 minuti ciascuna con 1x PBS.
  9. Incubare i coverslips per 30 minuti con una coppia specifica di anticorpi della sottoclasse IgG anti-topo di capra coniugati ad Alexa 594 (1:600) in soluzione bloccante per 30 minuti.
  10. Lavare le coverslip tre volte per 5 minuti ciascuna con 1x PBS.

5. Acquisizione di immagini confocali

  1. Analizzare i campioni di immunofluorescenza utilizzando un microscopio confocale, con un obiettivo di immersione in olio 63X e rilevare la fluorescenza con un tubo fotomoltiplicatore (PMT) e un rilevatore ibrido (HyD).
    NOTA: Abbiamo utilizzato la configurazione del Laboratorio Multiutente di Microscopia Confocale - LMMC, Ribeirao Preto Medical School, Università di San Paolo.
  2. Acquisisci tutte le immagini confocali con canali separati. Eseguite l'elaborazione delle immagini utilizzando Adobe Photoshop.

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Risultati

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Qui, mostriamo come studiare le interazioni ospite-parassita mediante immunofluorescenza quando la fonte di anticorpi è limitata a causa dell'indisponibilità di anticorpi commerciali che riconoscono strutture e proteine specifiche nei tripanosomatidi.

Tra i tripanosomatidi, T. cruzi ha uno dei cicli di vita più complessi che coinvolgono vari stadi di sviluppo tra vertebrati e invertebrati ospiti 19. Durante il ciclo di vita di T. cruzi, in una fase pre...

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Discussione

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Qui, presentiamo un protocollo per eseguire la doppia immunolabeling nelle cellule infette da Trypanosoma cruzi utilizzando due diversi anticorpi della stessa specie ospite. Per studiare, con maggiori dettagli, le implicazioni dell'infezione, le strutture nella cellula ospite come il nucleo o gli organelli citosolici possono essere etichettate utilizzando questo protocollo. Inoltre, può essere utilizzato nel metodo di etichettatura immunogold a sezione sottile post-incorporamento. Questo approccio aiuta a supera...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti o finanziari.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) alla MMAB, dalla Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA alla MMAB e dalla Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - codice finanziario 001. CG-C ha ricevuto un master e una borsa di dottorato da CAPES e LAMT-S ha ricevuto una borsa di dottorato da CNPq. Ringraziamo Elizabete R. Milani per l'assistenza alla microscopia confocale e il Dr. Dario Zamboni per aver fornito cellule LLC-MK2 (Ribeirao Preto Medical School, USP).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alexa Fluor 488 - Anticorpo IgG2bLife technologies, USAA21141Anti-topo di capra
AffiniPure Rabbit anti-topo IgG (H+L)Jackson Immunoresearch, USA315-005-003Anticorpo anti-topo
Alexa Fluor 488 - Anticorpo IgG F (ab')2 (H+L) Lifetechnologies, USAA11017Anti-topo di capra
Alexa Fluor 594 IgG1 antibodyLife technologies, USAA21125
Anticorpo di capra Alexa Fluor 647 - Anticorpo IgG F (ab')2 (H+L)Life technologies, USAA21237Anticorpo di capra anti-topo
Anti-hnRNPA1 IgG2bSigma-Aldrich, USAR4528Anticorpo di topo
anticorpo anti-TcFAZ (proteina FAZ di T. cruzi)Il nostro laboratorioIn-houseAnticorpo di topo
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-Aldrich, USAA2153-10GDetergente per proteine dell'albumina
Igepal CA-630Sigma-Aldrich, USAI3021Detergente non ionico
Fetale Siero bovino (FBS)Gibco, Thermo fisher scientific, USA12657-029Siero
Penicillina StreptomicinaGibco, Thermo fisher scientific, USA15140-122Antibiotico
Falloidina Alexa Fluor 594Life technologies, USAA12381Marcatore di actina
ProLong Gold antifade con tecnologie DAPILife, USAP36935Reagente terreno di montaggio
RPMI 1640 1X con L-glutamminaCorning, USA10-040-CVTerreno di coltura cellulare
Soluzione di tripsina-EDTASigma-Aldrich, USAT4049-100MLBioreagente

Riferimenti

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