Articolo metodologico

Preparazione su larga scala di esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali con liquido sinoviale mediante coltura di bioreattori 3D

DOI:

10.3791/62221

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26 luglio 2022

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1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per produrre un gran numero di esosomi di grado GMP da cellule staminali mesenchimali del liquido sinoviale utilizzando un bioreattore 3D.

Abstract

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Gli esosomi secreti dalle cellule staminali mesenchimali (MSC) sono stati suggeriti come candidati promettenti per le lesioni della cartilagine e il trattamento dell'osteoartrite. Gli esosomi per applicazioni cliniche richiedono una produzione su larga scala. A tal fine, le MSC del liquido sinoviale umano (hSF-MSCs) sono state coltivate su perle di microcarrier e quindi coltivate in un sistema di coltura dinamico tridimensionale (3D). Attraverso l'utilizzo di colture dinamiche 3D, questo protocollo ha ottenuto con successo esosomi su larga scala da supernatanti di coltura SF-MSC. Gli esosomi sono stati raccolti mediante ultracentrifugazione e verificati da un microscopio elettronico a trasmissione, saggio di trasmissione di nanoparticelle e western blotting. Inoltre, è stata rilevata la sicurezza microbiologica degli esosomi. I risultati del rilevamento degli esosomi suggeriscono che questo approccio può produrre un gran numero di esosomi di grado GMP (Good Manufacturing Practices). Questi esosomi potrebbero essere utilizzati nella ricerca sulla biologia degli esosomi e nel trattamento clinico dell'osteoartrite.

Introduzione

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L'osteoartrite (OA), derivante dalla cartilagine articolare e dalla rottura ossea sottostante, rimane una grave sfida che porta alla disabilità 1,2. Senza l'apporto di sangue e nervi, la capacità di auto-guarigione della cartilagine è minima una volta feriti 3,4. Negli ultimi decenni, le terapie basate sull'impianto autologo di condrociti (ACI) hanno fatto alcuni progressi nel trattamento dell'OA5. Per l'isolamento e l'espansione dei condrociti, è necessario raccogliere una piccola cartilagine dall'area non portante dell'articolazione OA, causando lesioni alla cartilagine. Inoltre, la procedura richiederà una seconda operazione per impiantare i condrociti espansi6. Pertanto, le terapie in un'unica fase per il trattamento dell'OA senza lesioni della cartilagine sono in fase di ampia esplorazione.

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state suggerite come alternative promettenti per il trattamento dell'OA 7,8. Originate da più tessuti, le MSC possono differenziarsi in condrociti con una stimolazione specifica. È importante sottolineare che le MSC possono modulare le risposte immunitarie tramite l'anti-infiammazione9. Pertanto, le MSC hanno vantaggi significativi nel trattamento dell'OA riparando i difetti della cartilagine e modulando la risposta immunitaria, specialmente nell'ambiente infiammatorio. Per il trattamento dell'OA, le MSC da liquido sinoviale (SF-MSCs) hanno recentemente attirato molta attenzione a causa della loro più forte capacità di differenziazione dei condrociti rispetto ad altre fonti di MSC10,11. In particolare, presso la clinica ortopedica, l'estrazione di SF infiammatoria dalla cavità articolare è una terapia di routine per alleviare il sintomo del dolore dei pazienti con OA. La SF infiammatoria estratta di solito viene smaltita come rifiuto medico. Sia i pazienti che i medici sono pronti a considerare le MSC autologhe isolate dalla SF infiammatoria come trattamento OA con pochissimi conflitti etici. Tuttavia, la terapia con SF-MSC è compromessa a causa dei rischi tumorigenici, della conservazione a lungo termine e delle barriere di spedizione distanti.

Gli esosomi, secreti da molti tipi di cellule, comprese le MSC, trasportano la maggior parte delle bio-informazioni della cellula madre. È stato studiato in modo approfondito come terapia cell-free12,13. Secondo le risorse aggiornate disponibili sul sito web del governo della sperimentazione clinica (ClinicalTrials.gov), vengono avviati e intrapresi studi clinici sugli esosomi più ampi nei campi di ricerca del cancro, dell'ipertensione e delle malattie neurodegenerative. Il trattamento degli esosomi SF-MSC potrebbe essere uno studio entusiasmante e impegnativo per far fronte all'OA. La produzione di esosomi di grado GMP e su larga scala è essenziale per la traduzione clinica. L'isolamento degli esosomi su piccola scala è stato ampiamente eseguito sulla base di colture cellulari bidimensionali (2D). Tuttavia, le strategie di produzione di esosomi su larga scala devono essere ottimizzate. In questo studio è stato sviluppato un metodo di produzione di esosomi su larga scala, basato su una massiccia coltura SF-MSC in condizioni prive di xeno. Dopo l'ultracentrifugazione da supernatanti di coltura cellulare, sono state convalidate la sicurezza e la funzione degli esosomi.

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Protocollo

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Questo studio è stato approvato dal Comitato di etica umana del secondo ospedale popolare di Shenzhen. Un diagramma schematico di esosomi isolati dal protocollo hSF-MSCs in vitro è mostrato in Figura 1.

1. Cultura e identificazione delle SF-MSC umane

  1. Raccogliere 20 ml di SF usando una siringa e un ago da pazienti clinici con OA.
    1. Disinfettare l'articolazione del ginocchio del paziente OA. Puntura dal tendine del quadricipite femorale al di fuori della rotula nella cavità articolare con un ago 7#.
    2. Estrarre 10 ml del liquido articolare. Coprire il sito di puntura con il bastone trasfusionale e premere per 5 minuti.
  2. Eliminare il surnatante SF dopo centrifugazione a 1.500 x g per 10 minuti a 4 °C.
  3. Risospendere il pellet cellulare con 10 mL di 1x tampone fosfato salino (PBS), centrifugare a 1.500 x g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il PBS.
  4. Risospendere il pellet con 10 ml di terreno di coltura MSC umano ad una densità cellulare di 5 x 104 cellule/ml (vedere Tabella dei materiali), quindi placcare la sospensione in un piatto da 100 mm.
  5. Incubare il piatto a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2.
  6. Dopo 48 ore, rimuovere le cellule non aderenti cambiando il mezzo e lavare con 1x PBS. Sostituire il mezzo ogni 3 giorni per 2 settimane.
  7. Raccogliere i supernatanti di coltura cellulare.
  8. Identificare le SF-MSC utilizzando la citometria a flusso.
    1. Digerire la terza generazione (P3) di SF-MSC, centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e raccogliere il pellet cellulare.
      NOTA: Un passaggio viene riconosciuto come la sottocoltura delle cellule in un altro piatto di coltura. Le cellule primarie isolate da SF e seminate sui piatti sono etichettate come passaggio zero (P0). A circa il 75% di confluenza, le cellule vengono digerite e staccate dai piatti, seminate su altri piatti ed etichettate come P1.
    2. Aggiungere 400 μL di tampone bloccante (1% BSA in 1x PBS) al pellet cellulare (5 x 104) e lasciarlo riposare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
    3. Centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μL di 1x PBS.
    4. Aggiungere 1 μL di CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, anticorpo fluorescente monoclonale HLA-DR (rapporto di diluizione 1:100) (vedere Tabella dei materiali) per provetta e incubare a RT per 30 minuti.
    5. Lavare due volte con 1x PBS e gettare il surnatante. Raccogliere il pellet cellulare e risospendere in 100 μL di 1x PBS.
    6. Rileva su un citometro a flusso fino a 10.000 cellule utilizzando filtri di 525/50 e 585/40 per rilevare i fluorofori.

2.3D Coltura cellulare di bioreattore

  1. Preparazione microcarrier
    1. Gonfiare i 0,75 g secchi di microcarrier (vedi Tabella dei materiali) e idratare in 1x soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) (50 mL/g di microcarrier) per almeno 3 ore a RT.
    2. Decantare il surnatante e lavare i microcarrier per 5 minuti in DPBS fresco (50 mL/g di microcarrier). Eliminare il PBS e sostituirlo con 1x DPBS fresco (50 mL/g di microcarrier).
    3. Sterilizzare i microcarrier mediante autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi). Lasciare che i microvettori sterilizzati si depositino, decantare il surnatante.
    4. Risciacquare brevemente i microcarrier nel terreno di coltura (50 mL/g di microcarrier) a RT. Lasciare che i microcarrier si depositino, scartare il surnatante.
  2. Bioreattore a perfusione
    1. Sterilizzare il bioreattore mediante autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi).
    2. Contare il numero di SF-MSC e allocare 2,5 x 107 SF-MSC e microcarrier al bioreattore perfuso con terreno di coltura MSC di grado GMP (250 ml).
    3. Mettere il bioreattore in un incubatore con il 5% di CO2 a 37 °C. Ruotare il bioreattore ad una velocità di 15 giri / min. Cambiare il terreno di coltura ogni 6 giorni.
    4. Raccogliere i supernatanti e i microcarrier della coltura cellulare per ulteriori analisi dopo la coltura per 14 giorni.

3. Identificazione degli esosomi e rilevamento della sicurezza

  1. Ultracentrifugazione
    1. Centrifugare il surnatante di coltura cellulare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante; Scartare i detriti cellulari.
    2. Centrifugare i surnatanti a 2.000 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante; scartare le vescicole più grandi (corpi apoptotici e alcune microvescicole più grandi).
    3. Centrifugare nuovamente il surnatante a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere le vescicole più grandi; raccogliere i pellet e risospenderli in 40 ml di 1x PBS.
    4. Centrifugare i pellet risospesi a 120.000 x g per 70 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere i pellet che contengono esosomi in 500 μL di 1x PBS.
  2. Analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
    NOTA: Per ogni corsa, 500 μL del campione sono stati iniettati nella camera ad una portata di 30 μL/min. Eseguire l'analisi a 24,4 °C-24,5 °C.
    1. Diluire i campioni di esosoma appena isolati con 1x PBS sterile a 1 mL contenente 107-10 9 /mL di particelle e iniettarli nel sistema di analisi di tracciamento delle nanoparticelle (vedere Tabella dei materiali).
    2. Impostare manualmente il sistema di acquisizione e analisi in base al protocollo del produttore. Visualizza le particelle mediante diffusione della luce laser e cattura il loro movimento browniano su video digitali.
    3. Analizza le videocassette registrate utilizzando un software (vedi Tabella dei materiali) in base al tracciamento di almeno 200 singole particelle per esecuzione.
  3. Microscopia elettronica a trasmissione
    1. Fissare gli esosomi in paraformaldeide al 4% (in freddo 1x DPBS) per 5 minuti.
    2. Montare 5 μL di esosomi su griglie di rame. In questo esperimento, la concentrazione di esosomi è di 1 mg/ml quantificata da un kit di analisi delle proteine (vedi Tabella dei materiali).
    3. Incorporare gli esosomi in acido fosfotungstico al 3% per 10 minuti sul ghiaccio. Rimuovere l'acido in eccesso e asciugare i campioni a RT.
    4. Immagini dei campioni di esosoma mediante un TEM ad una tensione di accelerazione di 100 kV.
  4. Western blotting
    1. Aggiungere 300 μL di tampone di lisi (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) e cocktail di inibitori della proteasi (vedere Tabella dei materiali) agli esosomi.
    2. Mescolare gli esosomi nel tampone di lisi mediante pipettaggio su e giù e lasciarlo riposare sul ghiaccio per 20 minuti.
    3. Centrifugare la miscela a 9,391 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante. Misurare la concentrazione proteica utilizzando un kit di analisi delle proteine (vedere la tabella dei materiali).
    4. Aggiungere 100 μL di 4x tampone di carico proteico e riscaldare a 100 °C per 10 minuti.
    5. Caricare 15 μL di proteine ad una concentrazione di 10 mg/mL ed eseguire mediante elettroforesi su gel (120 V, 70 min) ed elettroblotting a 100 V, 60 min a 4 °C.
    6. Rilevare i marcatori non esosomi-specifici (calnexina) e i biomarcatori esosomici (CD9, CD63 e CD81) mediante western blotting fluorescente (vedere Tabella dei materiali).
  5. Test di sicurezza
    1. Per il rilevamento di batteri, funghi e Mycobacterium tuberculosis seguire i passaggi 3.5.2-3.5.5.
    2. Semie 100 μL della soluzione di esosoma (1 mg/ml) su una piastra di coltura di agar sanguigno (vedere tabella dei materiali) e incubare la piastra di coltura a 37 °C per 24 ore.
    3. Semie 100 μL della soluzione di esosoma (1 mg/ml) su una piastra media di agar sabouraud (vedere tabella dei materiali) e incubare a 35 °C per 48 ore.
    4. Semare 100 μL della soluzione di esosoma (1 mg/ml) su una piastra di terreno di coltura Lowenstein-Jensen (vedere tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 3 settimane.
    5. Rilevare la comparsa di batteri, funghi e colonie di Mycobacterium tuberculosis mediante osservazione macroscopica.
      NOTA: I criteri per valutare la sicurezza degli esosomi sono l'assenza di microrganismi sulla piastra di coltura.
    6. Per il rilevamento del micoplasma, seguire i passaggi 3.5.7-3.5.9.
    7. Risospendere gli esosomi in 50 μL di soluzione tampone inclusa nel kit e riscaldare a 95 °C per 3 minuti.
    8. Amplificare il Mycoplasma in soluzione di esosoma utilizzando un kit di rilevamento del Mycoplasma PCR (vedere Tabella dei materiali).
    9. Rilevare i prodotti PCR con elettroforesi su gel di agarosio all'1,5% (30 min, 120 V).

4. Rilevamento della funzione degli esosomi in vitro

  1. Etichettatura degli esosomi
    1. Etichettare 100 μL di esosomi (1 mg/ml) con 1 mM Dil (1000x) (vedi Tabella dei materiali) e incubare a RT per 30 minuti.
    2. Recuperare gli esosomi mediante ultracentrifugazione a 100.000 x g per 70 minuti. Risospendere il pellet in 500 μL di 1x PBS.
  2. Il caricamento di Cy3-miR-140 imita negli esosomi
    1. Mescolare 1 μg/μL di proteina esosomica e 5 μmol/mL di Cy3-miR-140 in un volume finale di 400 μL di tampone per elettroporazione (1,15 mM di fosfato di potassio (pH 7,2), 25 mM di cloruro di potassio e 21% (v/v) (vedere Tabella dei materiali).
    2. Trasferire la miscela in cuvette di elettroporazione fredda da 0,4 cm ed elettroporate con capacità di 300 V/100 μF utilizzando un sistema di trasfezione genica (vedi Tabella dei materiali).
    3. Immediatamente dopo l'elettroporazione, mantenere la miscela a RT per 30 minuti per garantire che la membrana dell'esosoma sia completamente ripristinata.
    4. Trattare le miscele con un'unità di RNasi A (vedere Tabella dei materiali) per 20 minuti per eliminare i miRNA imitatori al di fuori degli esosomi.
    5. Ultracentrifugare la miscela di esosomi a 120.000 x g per 90 minuti, scartare il surnatante e risospendere gli esosomi in 500 μL di 1x PBS.
  3. Saggio di assorbimento degli esosomi
    1. Seminare i condrociti (1 x 107) in piatti confocali da 35 mm con 1 mL di DMEM/F12 contenente il 10% di FBS.
    2. Dopo 24 ore, trattare i condrociti con esosomi marcati con DiI (100 ng/mL) o esosomi caricati con cy3-miR-140 (100 ng/mL) per 1 ora.
    3. Lavare con 1x PBS tre volte, quindi etichettare con DAPI (10 ng / mL) per 10 minuti a RT.
    4. Registrare il segnale di fluorescenza in microscopia a fluorescenza a scansione laser confocale (CLSM) utilizzando i filtri appropriati (vedi Tabella dei materiali).

5. Analisi statistica

  1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software statistici appropriati.
    NOTA: I dati rappresentativi in ciascuna figura sono stati espressi come media ± DS. Il t-test di Student è stato utilizzato per il confronto di due gruppi utilizzando software di statistica. Un ANOVA unidirezionale seguito dal multiplo di Tukey è stato eseguito nel caso di confronti tra più gruppi. Valori P <0,05 (*), <0,01 (**) o <0,001 (***).

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Risultati

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La citometria a flusso è stata utilizzata per identificare i marcatori di superficie delle SF-MSCs, secondo i criteri minimi per definire le MSC umane raccomandati dalla Società Internazionale per la Terapia Cellulare14,15. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che le SF-MSC coltivate in questo studio hanno soddisfatto i criteri di identificazione delle MSC. Sono risultati negativi per CD34, CD45 e HLA-DR (inferiori al 3%) e positivi per CD73, CD90 e CD...

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Discussione

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Le cellule staminali mesenchimali sono state ampiamente utilizzate nella medicina rigenerativa grazie al loro auto-rinnovamento, differenziate in cellule tissutali con funzioni specializzate ed effetti paracrini16,17. In particolare, gli effetti paracrini esercitati dagli esosomi hanno attirato molta attenzione18. Gli esosomi trasportano le bioinformazioni delle MSC e svolgono la loro funzione biologica e superano le carenze delle MSC, com...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

National Natural Science Foundation of China (n. 81972116, n. 81972085, n. 81772394); Programma chiave della Fondazione di Scienze Naturali della Provincia del Guangdong (No.2018B0303110003); Progetto di cooperazione internazionale del Guangdong (n. 2021A0505030011); Progetti scientifici e tecnologici di Shenzhen (n. GJHZ20200731095606019, n. JCYJ20170817172023838, n. JCYJ20170306092215436, n. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (No.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (No.2021A1515010985); Progetto Sanming di Medicina a Shenzhen (SZSM201612079); Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nella provincia del Guangdong.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit di analisi BCAThermoFisher23227Saggio di concentrazione proteica
Piastra di agar sanguignoNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0903Coltura batterica
Anticorpo CD105ElabscienceE-AB-F1243CCitometria a flusso
Anticorpo CD34ElabscienceE-AB-F1143CCitometria a flusso
Anticorpo CD45BD Bioscience555483Citometria a flusso
CD63 AnticorpoAbclonal  A5271Western blotting
Anticorpo CD73ElabscienceE-AB-F1242CCitometria a flusso
CD81 anticorpoABclonal  A5270Western blotting
CD9 anticorpoAbclonal  A1703Western blotting
Anticorpo CD90ElabscienceE-AB-F1167CCitometria
a flusso CentrifugaEppendorfCentrifuge 5810R
Incubatore a CO2Coltura termocellulare
Microscopia a fluorescenza a scansione laser confocaleZEISSLSM 800
CytodexGE HealthcareMicrocarrier
DilThermoFisherD1556Etichetta dell'esosoma
EZ-PCR Kit di rilevamento del micoplasmaBI20-700-20Rilevamento del micoplasma
Citometria a flussoIdentificazione MSC di Beckman
Sistema Gene Pulser IIBio-Rad Laboratories1652660Trasfezione genica
GraphPad Prism 8.0.2GraphPad Software, Inc.Versione 8.0.2
Anticorpo HLA-DRElabscience E-AB-F1111CCitometria a flusso
Terreno di coltura Lowenstein-JensenNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.T0573Coltura di Mycobacterium tuberculosis
MesenGroStemRDMGro-500Coltura MSC
Nanosight NS300MalvernNanosight NS300Analisi del tracciamento delle nanoparticelle
Software NTA 2.3MalvernAnalisi dei dati
Odyssey FCGene Company LimitedWestern blotting fluorescente
OptiPrep tampone di elettroporazioneSigmaD3911Trasfezione genica
Cocktail di inibitori della proteasiSigmaP8340Inibitore della proteinasi
RNasi AQiagen158924Rimozione dell'RNA
Piastra di agar SabouraudNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0919Coltura di funghi
TEMJEM-1200EX
Il sistema di coltura cellulare rotante (RCCS)SyntheconRCCS-4HDColtura 3D
UltracentrifugaBeckmanOptima XPN-100Centrifuga esosomiale

Riferimenti

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