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Articolo metodologico

Un metodo per preservare le radici delle zone umide e le rizosfere per l'imaging elementare

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DOI:

10.3791/62227

⸱

15 febbraio 2021

 ,  , 
1Department of Plant and Soil Sciences, University of Delaware, 2National Synchrotron Radiation Lightsource-II, Brookhaven National Laboratory

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un protocollo per campionare, conservare e sezionare le radici intatte e il suolo della rizosfera circostante da ambienti umidi utilizzando il riso(Oryza sativa L.) come specie modello. Una volta conservato, il campione può essere analizzato utilizzando tecniche di imaging elementare, come l'imaging di speciazione chimica a fluorescenza a raggi X (XRF) di sincrotrone.

Abstract

Le radici interagiscono ampiamente con il loro ambiente del suolo, ma visualizzare tali interazioni tra le radici e la rizosfera circostante è una sfida. La chimica della rizosfera delle piante delle zone umide è particolarmente difficile da catturare a causa dei ripidi gradienti di ossigeno dalle radici al suolo sfuso. Qui viene descritto un protocollo che preserva efficacemente la struttura delle radici e la chimica della rizosfera delle piante delle zone umide attraverso lo slam-freezing e la liofilizzazione. Lo slam-congelamento, in cui il campione viene congelato tra blocchi di rame pre-raffreddati con azoto liquido, riduce al minimo i danni alle radici e la distorsione del campione che possono verificarsi con il congelamento flash, riducendo al minimo i cambiamenti di speciazione chimica. Mentre la distorsione del campione è ancora possibile, la possibilità di ottenere più campioni rapidamente e con costi minimi aumenta il potenziale per ottenere campioni soddisfacenti e ottimizza i tempi di imaging. I dati mostrano che questo metodo ha successo nel preservare le specie di arsenico ridotte nelle radici di riso e nelle rizosfere associate alle placche di ferro. Questo metodo può essere adottato per studi sulle relazioni pianta-suolo in un'ampia varietà di ambienti umidi che coprono intervalli di concentrazione dal ciclo di oligoelementi alle applicazioni di fitodepurazione.

Introduzione

Le radici e le loro rizosfere sono dinamiche, eterogenee e di fondamentale importanza per capire come le piante ottengono nutrienti minerali e contaminanti1,2,3. Le radici sono il percorso primario attraverso il quale i nutrienti (ad esempio, il fosforo) e i contaminanti (ad esempio, l'arsenico) si spostano dal suolo alle piante e quindi la comprensione di questo processo ha implicazioni per la quantità e la qualità del cibo, il funzionamento dell'ecosistema e il fitorisanimento. Tuttavia, le radici sono dinamiche nello spazio e nel tempo crescendo in risposta alle esigenze di acquisizione dei nutrienti e spesso variano per funzione, diametro e struttura (ad esempio, radici laterali, radici avventizie, peli di radice)2. L'eterogeneità dei sistemi di radici può essere studiata su scale spaziali da cellulare a livello di ecosistema e su scale temporali da oraria a decadale. Pertanto, la natura dinamica ed eterogenea delle radici e del loro suolo circostante, o rizosfera, pone sfide per catturare la chimica della rizosfera nel tempo. Nonostante questa sfida, è imperativo studiare le radici nel loro ambiente del suolo per caratterizzare questa relazione critica pianta-suolo.

La chimica della rizosfera delle piante delle zone umide è particolarmente difficile da studiare a causa dei ripidi gradienti di ossigeno che esistono dal suolo sfuso alle radici, che cambiano nello spazio e nel tempo. Poiché le radici hanno bisogno di ossigeno per respirare, le piante delle zone umide si sono adattate alle condizioni di basso contenuto di ossigeno dei terreni delle zone umide creando aerenchima4,5. Gli aerenchima sono tessuti corticali scavati che si estendono dai germogli alle radici, consentendo la diffusione dell'aria attraverso la pianta nelle radici. Tuttavia, parte di questa aria fuoriesce nella rizosfera in parti meno suberizzate delle radici, in particolare vicino alle giunzioni delle radici laterali, alle punte delle radici meno mature e alle zone di allungamento6,7,8,9. Questa perdita radiale di ossigeno crea una zona ossidata nella rizosfera delle piante delle zone umide che influenza la chimica della rizosfera (bio-geo)ed è distinta dal suolo a massa ridotta10,11,12. Per comprendere il destino e il trasporto di nutrienti e contaminanti nelle rizosfere e nelle radici delle zone umide, è fondamentale preservare il suolo sfuso chimicamente ridotto, la rizosfera ossidata e le radici delle piante delle zone umide per l'analisi. Tuttavia, poiché il terreno sfuso contiene costituenti del suolo ridotti che sono sensibili all'ossigeno, i metodi di conservazione delle radici e del suolo devono preservare le strutture delle radici e ridurre al minimo le reazioni sensibili all'ossigeno.

Esistono metodi per fissare i tessuti vegetali e preservare l'ultrastruttura per l'imaging, ma tali metodi non possono essere applicati per preservare chimicamente le radici che crescono nel suolo delle zone umide. Per le indagini in cui si desidera solo la distribuzione elementare all'interno delle cellule vegetali, le piante sono tipicamente coltivate idroponicamente e le radici possono essere facilmente rimosse dalla soluzione, fissate sotto congelamento ad alta pressione e sostituzione del congelamento e sezionate per una varietà di applicazioni di imaging tra cui spettrometria di massa ionica secondaria ad alta risoluzione (nanoSIMS), microscopia elettronica e analisi di fluorescenza a raggi X di sincrotrone (S-XRF)13, 14,15. Per indagare la placca fe all'esterno delle radici delle zone umide, questi studi idroponici devono indurre artificialmente la formazione della placca Fe nellasoluzione 16,che non rappresenta accuratamente l'eterogeneità della distribuzione e della composizione minerale della formazione della placca Fe e degli elementi associati in situ17,18,19,20. Esistono metodi per preservare il suolo delle zone umide e i microrganismi associati con il carotaggio21, ma è difficile ottenere radici con questa tecnica. I metodi attuali per visualizzare le radici che crescono nel suolo e la loro chimica rizosferica consistono in due tipi di misurazione primari: flussi elementari e concentrazione elementare totale (e speciazione). Il primo è tipicamente misurato utilizzando gradienti diffusivi in film sottili (DGT)22 , 23,24, in cui il terreno viene posto in rizobox per sostenere la crescita delle piante in un ambiente di laboratorio e gli elementi labili nel terreno si diffondono attraverso un gel in uno strato legante. Questo livello di legame può quindi essere ripreso per quantificare gli elementi labili di interesse. Questa tecnica può illustrare con successo le relazioni tra le radici e la rizosfera24,25,26,27, ma i manufatti del radicamento possono esistere coltivando piante in rizobox e le informazioni sull'interno della radice non vengono catturate con DGT. Quest'ultimo comporta il campionamento delle radici e della rizosfera, la conservazione del campione e l'analisi diretta della distribuzione elementare su una sezione campione. Per questo campionamento ambientale delle radici delle piante delle zone umide e della rizosfera circostante, è necessaria un'attenta gestione del campione per evitare artefatti dalla preparazione del campione.

Qui viene descritto un protocollo che preserva efficacemente le strutture delle radici e la chimica della rizosfera delle piante delle zone umide mediante slam-congelamento e liofilizzazione. Il congelamento flash può rallentare drasticamente le trasformazioni dei soluti sensibili all'ossigeno, ma può danneggiare le radici e può causare mobilizzazione quando i campioni si asciugano. Tuttavia, lo slam-freezing in cui il campione è congelato tra blocchi di rame pre-raffreddati con azoto liquido riduce al minimo il danno alle radici e la distorsione del campione28. I campioni conservati vengono quindi incorporati in una resina epossidica che conserva as speciation20,29 e possono essere tagliati e lucidati per l'imaging delle radici all'interno del loro terreno rizosfera. I campioni in questo rapporto sono stati analizzati mediante imaging di speciazione chimica S-XRF dopo un sezionamento sottile. Tuttavia, potrebbero essere utilizzate anche altre tecniche di imaging, tra cui la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente da ablazione laser (LA-ICP-MS), l'emissione di raggi X indotta da particelle (PIXE), la spettrometria di massa ionica secondaria (SIMS) e la spettroscopia di rottura indotta da laser (LIBS).

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Protocollo

1. Preparazione dell'attrezzatura per il congelamento dello slam

  1. Posizionare due blocchi di rame (~ 5 cm x 5 cm x 15 cm) orizzontalmente all'interno di un dispositivo di raffreddamento pulito in grado di contenere azoto liquido e versare abbastanza azoto liquido per immergere i blocchi. Una volta che il gorgogliamento si attenua, posizionare due distanziali sopra un blocco di rame a ciascuna estremità.
    NOTA: l'altezza del distanziatore determina l'altezza del campione da congelare; in questo esempio viene utilizzato un distanziatore di 2 cm per creare cubi di circa 3 cm x 3 cm x 2 cm. Il volume dell'azoto liquido dipenderà dalla dimensione del dispositivo di raffreddamento. In questo esempio viene utilizzato circa 1 L per circa 5 cubi in serie.
    ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione individuale e ventilazione adeguati poiché l'azoto liquido è un criogeno e un asfissiante.
  2. Usando pinze e guanti criogenici, alza l'altro blocco di rame alla sua estremità, per facilitare il recupero quando il campione è in posizione.

2. Raccolta dei campioni e slam-freezing

  1. Estrarre la pianta e la rizosfera desiderate dal terreno umido usando una pala e assicurarsi che il foro scavato sia molto più grande del volume di radice desiderato. Metti il terreno e pianta in un contenitore e posizionalo su un banco.
    NOTA: È possibile utilizzare anche l'intero terreno in vaso e la pianta di uno studio in vaso.
  2. Determinare la posizione del terreno desiderata in cui devono essere prese le radici (cioè profondità e vicinanza alle riprese). Tagliare via il terreno in eccesso usando una lama d'acciaio, facendo attenzione a non disturbare il terreno nella zona desiderata. Quando viene raggiunta l'area desiderata, tagliare un "cubo" di radice di circa 3 cm x 3 cm x 2 cm e posizionare immediatamente il cubo tra i due distanziali sul blocco di rame orizzontale. Usando guanti criogenici, prendi il blocco di rame verticale e posizionalo sopra i distanziali per sbattere il cubo della rizosfera.
  3. Dopo che il gorgogliamento si è attenuato (~ 5 minuti), recupera il cubo di rizosfera congelato dai blocchi di rame e avvolgi all'interno di un quadrato di foglio di alluminio pre-etichettato. Contrassegnare l'orientamento del blocco sulla lamina, se lo si desidera. Mettere in un secondo contenitore di azoto liquido fino a quando non viene riposto in un congelatore a -80 °C.
  4. Ripetere l'operazione in base alle esigenze per ottenere il numero desiderato di cubi di radice dal sito di campo o dall'esperimento. Assicurarsi che entrambi i blocchi di rame siano dati il tempo di raffreddarsi tra i campioni.

3. Liofilizzazione e incorporamento di cubi di rizosfera

  1. Preparare il liofilizzatore secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che abbia ottenuto la pressione e la temperatura del vuoto adeguate prima di rimuovere i campioni dal congelatore a -80 °C.
  2. Quando il liofilizzatore è pronto per ricevere i campioni, posizionare un cubo di rizosfera congelato all'interno di un tubo da 50 ml pulito e lavato con acido e coprire liberamente con una salvietta monouso pulita. Fissare la salvietta con un elastico. Ripetere se necessario per assicurarsi un cubo per tubo.
    NOTA: se il campione è troppo grande per un tubo, può essere inserito direttamente nel recipiente del liofilizzatore utilizzando il foglio di alluminio come porta campioni.
  3. Posizionare i tubi contenenti campioni in recipienti di liofilizzatore e liofilizzare per diversi giorni. Il tempo esatto di asciugatura dipenderà dalle proprietà del suolo.
    NOTA: Conservare i campioni essiccati nel liofilizzatore o in un essiccatore per evitare la reidratazione.
  4. Utilizzare una lama di acciaio per tagliare i cubetti di terreno essiccati a misura in modo che si adattino alla forma desiderata (ad esempio, la forma di diametro 25 mm è ideale per la maggior parte delle applicazioni). Etichettare ogni forma, posizionare i cubetti di terreno nelle forme e posizionare le forme all'interno di un essiccatore sottovuoto.
  5. Preparare la resina epossidica secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che la resina epossidica scelta non sia contaminata e non causi cambiamenti di speciazione degli elementi desiderati 20,29,30.
  6. Utilizzare un contagocce per aggiungere resina epossidica alla forma su un lato del terreno, fino a coprire interamente il campione. Il terreno si scurisce di colore mentre la resina epossidica bagna il terreno.
    NOTA: Aggiungere lentamente la resina epossidica per consentire all'aria nel terreno di fuoriuscire.
  7. Una volta che i moduli sono pieni di resina epossidica, chiudere l'essiccatore a vuoto e accendere il vuoto. A seconda della quantità di aria intrappolata nel terreno, potrebbe essere necessario aggiungere periodicamente più resina epossidica alle forme. Controllare il livello di resina epossidica ogni 30-90 minuti per le prime 1-4 ore e aggiungere resina epossidica secondo necessità.
  8. Rimuovere il campione dalla forma una volta che la resina epossidica si è indurita (~ 5 giorni).

4. Taglio e sezionamento dei cubi della rizosfera

  1. Tagliare il campione utilizzando una sega a umido di precisione a lama diamantata. Tagliare i campioni in posizioni diverse se non si ottengono radici nel taglio precedente.
  2. Carteggiare manualmente i campioni tagliati con carta vetrata progressivamente più fine (ad esempio, grana 220, 500, 1000 e 1500) sul lato di taglio per ~ 30 s.
  3. Eseguire l'imaging superficiale dei campioni utilizzando tecniche come LA-ICP-MS.
    NOTA: per preparare sezioni sottili per S-XRF, inviare i campioni a un'azienda in grado di preparare le sezioni sottili (lucidatura laterale singola o doppia) o seguire i passaggi 4.4 - 4.6 come descritto di seguito.
  4. Incollare il lato del campione desiderato su un vetrino al quarzo usando super colla e consentire la polimerizzazione durante la notte.
  5. Utilizzando una sezionatrice sottile, tagliare il terreno su vetrini a 2 mm di spessore e quindi macinare allo spessore desiderato (in genere 30 μm). La superficie del campione può essere lucidata se lo si desidera.
  6. Eseguire l'imaging S-XRF delle sezioni. Seguire i passaggi appropriati presso la struttura di sincrotrone e la beamline desiderate per richiedere e utilizzare il tempo di imaging.

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Risultati

Questo metodo consente la conservazione delle radici e delle specie chimiche nelle radici e nella rizosfera delle piante delle zone umide e nel terreno sfuso. In questo lavoro, il metodo è stato utilizzato per valutare la speciazione e la co-localizzazione di As con ossidi fe e Mn e nutrienti vegetali nella rizosfera del riso (Oryza sativa L.). Il riso è stato coltivato presso la RICE Facility dell'Università del Delaware, dove 30 mesocosmi di risone (2 m x 2 m, 49 piante ciascuno) vengono utilizzati per coltiva...

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Discussione

Questo documento descrive un protocollo per ottenere terreno sfuso preservato + rizosfere di radici di piante delle zone umide utilizzando una tecnica di congelamento slam che può essere utilizzata per l'imaging elementare e / o la mappatura della speciazione chimica.

Ci sono diversi vantaggi di questo metodo rispetto ai metodi esistenti. In primo luogo, questo metodo consente l'indagine simultanea delle radici e delle rizosfere circostanti. Attualmente esistono metodi per preservare e immagin...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono una sovvenzione congiunta di semi a Seyfferth e Tappero per sostenere la collaborazione tra l'Università del Delaware e il Brookhaven National Laboratory. Parti di questa ricerca hanno utilizzato la linea di fascio XFM (4-BM) della National Synchrotron Light Source II, una struttura utente dell'Office of Science del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti (DOE) gestita per l'Ufficio della Scienza del DOE dal Brookhaven National Laboratory sotto contratto n. DE-SC0012704.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Blocchi di rameMcMaster Carr89275K42
Disco diamantatoBuehler15 LC, 102 mm x 0,3 mmvelocità di funzionamento: 225 giri/min
Forme epossidicheStruers40300085FixiForm
EpoxyEpotek301-2FL
SupercollaLoctite404
Sezionatrice sottileBuehlerPetroThin
Sega a umidoBuehlerIsoMet 1000

Riferimenti

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Chimica della rizosferacongelamento rapido (slam freezing)liofilizzazionepreservazione della struttura radicaleplacca di ferrospeciazione dell'arsenicofluorescenza a raggi X da sincrotroneinterazione pianta-suolo
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