Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Sommario

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. La procedura dura circa 3 ore.

Abstract

I disturbi oculari colpiscono milioni di persone in tutto il mondo, ma la limitata disponibilità di tessuti umani ostacola il loro studio. I modelli di topo sono strumenti potenti per comprendere la fisiopatologia delle malattie oculari a causa delle loro somiglianze con l'anatomia e la fisiologia umana. Le alterazioni dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), inclusi i cambiamenti nella morfologia e nella funzione, sono caratteristiche comuni condivise da molti disturbi oculari. Tuttavia, l'isolamento e la coltura di successo delle cellule RPE del topo primario sono molto impegnativi. Questo documento è una versione audiovisiva aggiornata del protocollo precedentemente pubblicato da Fernandez-Godino et al. Questo metodo è altamente riproducibile e si traduce in solide colture di monostrati RPE altamente polarizzati e pigmentati che possono essere mantenuti per diverse settimane su Transwells. Questo modello apre nuove strade per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari alla base delle malattie oculari. Inoltre, fornisce una piattaforma per testare approcci terapeutici che possono essere utilizzati per trattare importanti malattie oculari con esigenze mediche non soddisfatte, compresi disturbi ereditari della retina e degenerazioni maculari.

Introduzione

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. L'RPE è un monostrato situato nell'occhio tra la retina neurale e la membrana di Bruch. Questo singolo strato è costituito da cellule epiteliali altamente polarizzate e pigmentate unite da giunzioni strette, che presentano una forma esagonale che ricorda un nido d'ape². Nonostante questa apparente semplicità istologica, l'RPE svolge un'ampia varietà di funzioni critiche per la retina e il normale ciclo^{visivo 2,3,4}. Le funzioni principali del monostrato RPE i....

Protocollo

Sono state seguite le linee guida della dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e della visione.

NOTA: Questo metodo si è dimostrato efficace con topi di diversa origine genetica, tra cui C57BL/6J, B10. D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ, e topi albini, a varie età. Preferibilmente utilizzare topi da 8 a 12 settimane per ottenere cellule RPE. Le cellule RPE dei topi più anziani proliferano meno in coltura e i topi più giovani hanno sempre più cellule, il che richiede la messa in comune di occhi di animali diversi per avere colture vitali.

1. Preparazione dei reagenti....

Risultati

Questo protocollo è stato utilizzato per isolare e coltura cellule RPE da topi geneticamente modificati¹. Non sono state osservate differenze tra ceppi di topi o sesso. I risultati hanno contribuito a comprendere alcuni aspetti importanti del meccanismo alla base delle malattie oculari come la degenerazione maculare legata all'età, che è la causa più comune di perdita della vista tra gli anziani⁹. Le cellule RPE isolate a seguito di questo protocollo sono state completament.......

Discussione

Mentre diversi metodi per l'isolamento e la coltura delle cellule RPE del topo^{erano stati sviluppati prima di 1,13,20,22}, 26^,27, il metodo di Fernandez-Godino ha utilizzato per la prima volta inserti a membrana che consentono la crescita efficiente delle cellule RPE in^{coltura per le settimane 1,9<.......}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa con punta BD Luer-Lok da 10 ml, monouso	BD Biosciences	309604
Provetta da centrifuga da 15 ml	VWR International	21008-103
Provetta da centrifuga da 50 ml	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Micro pinza angolata	WPI	501727
Centrifuga da banco	qualsiasi
incubatore a CO2	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Microscopio da dissezione	Qualsiasi
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190144
Dumont #5 45 gradi Pinzette per biologia medica, punta da 0,05 x 0,01 mm, lunghezza 11 cm	WPI	14101
Etanolo	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Piatto per colture cellulari in polistirene trasparente, 35 mm	BD Biosciences	353001
Siero fetale bovino	Hyclone	SH30071.03	Inattivato a caldo.
Hank' s Soluzione salina bilanciata più calcio e magnesio, senza rosso fenolo	Life Technologies	14175095
Hank' s Soluzione salina bilanciata più calcio e magnesio, senza rosso fenolo B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Ialuronidasi	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Idrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Cappa a flusso laminare	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Diluire in PBS a 37C a 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro forbici WPI lunghe 8 cm		503216
Aminoacidi non essenziali 100X	Gibco	11140050
N1 Integratore 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Lama chirurgica in acciaio al carbonio misura 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Piastre a 12 pozzetti trattate con coltura tissutale	Fisher-Scientific	08-772-29
Piastre a 6 pozzetti trattate con coltura tissutale	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supporta	Sigma-Aldrich	da 6,5 mmCLS3470-48EA
Triiodo-tironina	Sigma-Aldrich	T-5516
Tripsina-EDTA (0,25%), pinzetta	Gibco	25200056
, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curva, acciaio inossidabile 0,02 x 0,06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Forbici lunghe 8 cm, acciaio inossidabile	WPI	501790
Filtri per siringa Whatman Puradisc da 25 mm 0,45 m dimensione dei pori	Fisher-Scientific	6780-2504