Denne undersøgelse præsenterer protokoller for to semi-automatiserede lokomotorisk aktivitet analyse tilgange i C. elegans kompleks I sygdom gas-1(FC21) orme, nemlig ZebraLab (en medium-throughput assay) og WormScan (en high-throughput assay) og give sammenlignende analyse blandt en bred vifte af forskningsmetoder til at kvantificere nematode adfærd og integreret neuromuskulær funktion.
Caenorhabditis elegans er bredt anerkendt for sin centrale nytte som en translationel dyremodel til effektivt at afhøre mekanismer og behandlinger af forskellige menneskelige sygdomme. Orme er særligt velegnede til højgennemsigtige genetiske og lægemiddelskærme for at få dybere indsigt i terapeutiske mål og terapier ved at udnytte deres hurtige udviklingscyklus, stor brødstørrelse, kort levetid, mikroskopisk gennemsigtighed, lave vedligeholdelsesomkostninger, robust pakke af genomiske værktøjer, mutantlagre og eksperimentelle metoder til at afhøre både in vivo og ex vivo fysiologi. Orm lokomotorisk aktivitet repræsenterer en særlig relevant fænotype, der ofte forringes i mitokondriesygdom, som er meget heterogen i årsager og manifestationer, men kollektivt deler en nedsat evne til at producere cellulær energi. Mens en suite af forskellige metoder kan bruges til at afhøre orm adfærd, disse varierer meget i eksperimentelle omkostninger, kompleksitet, og nytte for genomiske eller stof high-throughput skærme. Her blev den relative gennemløb, fordele og begrænsninger af 16 forskellige aktivitetsanalysemetoder sammenlignet, der kvantificerer nematode-bevægelse, thrashing, svælgpumpning og / eller chemotaxis i enkelte orme eller ormpopulationer af C. elegans på forskellige stadier, aldre og eksperimentelle varigheder. Detaljerede protokoller blev demonstreret for to halvautomatiske metoder til at kvantificere nematode lokomotorisk aktivitet, der repræsenterer nye anvendelser af tilgængelige softwareværktøjer, nemlig ZebraLab (en medium-throughput tilgang) og WormScan (en høj-throughput tilgang). Data fra anvendelsen af disse metoder viste lignende grader af reduceret animalsk aktivitet forekom på L4 larvestadiet, og skred frem i dag 1 voksne, i mitokondrie kompleks I sygdom (gas-1(fc21)) mutant orme i forhold til vilde-type (N2 Bristol) C. elegans. Disse data validerer nytten for disse nye applikationer ved hjælp af ZebraLab eller WormScan softwareværktøjer til at kvantificere orm lokomotorisk aktivitet effektivt og objektivt, med variabel kapacitet til at støtte high-throughput lægemiddel screening på orm adfærd i prækliniske dyremodeller af mitokondriesygdom.
Caenorhabiditis elegans er bredt anerkendt som en fremragende model i neurovidenskab baseret på det at have 302 neuroner, der koordinerer alle orm adfærd, herunder parring, fodring, æglægning, afføring, svømning, og bevægelse på solide medier1. Disse hermafroditiske nematoder bruges også i vid udstrækning til at forstå en bred vifte af menneskelige sygdomsmekanismer, muliggjort af dets velkarakteriserede genom og høje homologi af ~ 80% gener mellem C. elegans og mennesker2,3,4. C. elegans har længe været brugt til at afhøre human mitokondriesygdom5,6,7,8,9,10, som er en meget genetisk og fænotype heterogen gruppe af arvelige metaboliske lidelser, der deler nedsat kapacitet til at generere cellulær energi og ofte klinisk til stede med væsentligt nedsat neuromuskulær funktion, motion intolerance og træthed11 ,12,13,14. Med henblik herpå muliggør brugen af C. elegans modeller præklinisk modellering af kvantitative aspekter af dyrs aktivitet og neuromuskulær funktion i forskellige genetiske undertyper af mitokondriesygdom samt deres reaktion på kandidatbehandlinger, der kan forbedre deres neuromuskulære funktion og samlede aktivitet.
Neuromuskulær aktivitet i C. elegans er objektivt målbar ved en række eksperimentelle metoder, herunder både manuelle og halvautomatiske tilgange, der tillader funktionelle analyser i enten faste eller flydende medier (Tabel 1)1,15. Nøjagtig kvantificering af C. elegans aktivitet har vist sig vigtigt at gøre det muligt opdagelser relateret til funktion og udvikling af muskel-og nervesystemet16,17,18. Denne undersøgelse opsummerer og sammenligner eksperimentelle krav, fordele og begrænsninger af 17 forskellige analyser, der kan udføres i forskningslaboratorier for at evaluere neuromuskulær funktion og aktivitet på fire vigtige resultater i C. elegans sygdomme modeller, både ved baseline på en række udviklingsstadier og aldre samt som reaktion på kandidat behandlinger (Tabel 1 ). Undersøgelsen giver faktisk et detaljeret overblik over rækken af tilgængelige eksperimentelle tilgange til at karakterisere satser for C. elegans thrashing (krop bøjninger pr minut), lokomotorisk aktivitet, svælg pumpning, og chemotaxis-i hvert enkelt tilfælde angiver den eksperimentelle og analytiske metode, der anvendes, fordele og begrænsninger af hver metode, udstyr og software er nødvendige for at udføre og analysere hver analyse, og gennemløbskapaciteten for hver metode til at understøtte dens anvendelse til genetiske eller lægemiddelscreeningsformål med høj kapacitet. Gennemløbskapaciteten for hver analyse beskrives som lav, mellem eller høj baseret på den eksperimentelle protokolkompleksitet, herunder ormvedligeholdelse, behandlingstid, brug af enkelt- eller multi-brøndplader og/ eller eksperimentatortid, der er nødvendig for at fuldføre den eksperimentelle indstilling og dataanalyser.
Manuelle analyser af thrashing19, locomotorisk aktivitet20, svælgpumpning17,21og chemotaxis22,23 er veletablerede metoder til evaluering af ormaktivitet, der kræver et stereomikroskop24. Mens måling af thrashing aktivitet orme kræver analyse i flydende medier til at bestemme hyppigheden af kroppen bøjninger per minut, orm lokomotorisk aktivitet kan måles enten på faste medier eller i flydende medier. Manuelle analyser af individuelle ormaktivitet er dog i sagens natur tidskrævende og involverer uundgåelig brugergenereret bias. Automatisering af ormaktivitetsanalyser minimerer brugergenereret bias og kan i høj grad øge eksperimentelle gennemløb25. Videooptagelser af orm thrashing aktivitet i flydende medier kan analyseres ved hjælp af wrMTrck, en ImageJ plugin26. Men de oprindelige eksperimentelle indstillinger, der blev udviklet til wrMTrck begrænset sin nytte, da alt for mange orme i en enkelt flydende dråbe førte til overlapning af orme, der gjorde præcis sporing vanskelig. Mens denne eksperimentelle begrænsning er blevet løst27, wrMTrck metode er ikke i stand til at støtte high-throughput screening.
Der findes en række metoder til at kvantificere orm lokomotorisk aktivitet ved baseline og som reaktion på kandidatbehandlinger i C. elegans mitokondriesygdomsmodeller. Disse omfatter ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28, wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, Infinity Chip32og WMicrotracker One33 (Tabel 1). Disse metoder muliggør samtidig analyse af bevægelse i flere ormstammer eller tilstande, typisk på multi-brønd plader, og dermed støtte højere gennemløb lægemiddelscreening applikationer. Nogle af disse metoder har unikke overvejelser, der kan begrænse eller forbedre deres generelle nytte, såsom behovet for dyrt udstyr versus open-access software, og varierende lethed at udføre eksperimentelle protokoller. Samlet set er intet enkelt eksperimentelt system eller protokol ideelt egnet til alle C. elegans lokomotoriske aktivitetseksperimenter. Det er snarere vigtigt omhyggeligt at vælge, hvilken metode der passer bedst til den specifikke investigators eksperimentelle mål og krav.
Pharyngeal pumpning repræsenterer et andet vigtigt resultat til at vurdere neuromuskulær aktivitet i C. elegans. C. elegans svælg består af 20 muskelceller, 20 neuroner, og 20 andre celler, der muliggør indtagelse af Escherichia coli (E. coli) i den forreste ende af ormens fordøjelseskanalen34,35,36. Flere manuelle metoder er blevet etableret til at bestemme svælg pumpehastigheder17,21,37,38. De fleste metoder er baseret på brugen af et stereomikroskop og kamera til at visualisere og registrere svælg pumpefrekvens med direkte optælling af den eksperimentelleobservatør 21. Automatiseret pharyngeal pumpehastighed analyse er mulig ved at udføre en ekstracellulær optagelse kaldes elektropharyngeogram (EPG), som giver yderligere oplysninger om varigheden af hver pumpe39. Pharyngeal pumpehastighed analyse er også muligt i et mikrofluidisk system, WormSpa, hvor de enkelte orme er begrænset ikamre 40,41. En kommerciel metode til rådighed for at lette analysen af den svælg pumpehastighed er ScreenChip System (InVivo Biosystems), som måler, visualiserer og analyserer de neuromuskulære aspekter af fodringsadfærd i en enkelt orm, der er immobiliseret i en brugerdefineret chip. Denne svælg pumpe kvantificering tilgang kan bruges til at vurdere både neuronal og fysiologiske reaktioner på narkotika, aldring, og andre faktorer42,43,44,45.
Chemotaxis beskriver bevægelsen af C. elegans som reaktion på et lugtstof placeret væk fra ormene i et defineret område af nematode vækstmedier (NGM) plade. Vurdering af chemotaxis respons giver et integreret mål for orm neuronal og neuromuskulær aktivitet, der kan kvantificeres ved at observere og måle den fysiske afstand, der rejses af orme mod lugtstof i en defineret periode46. Multi-Worm Tracker er en automatisk metode, der kan bruges til at forbedre den eksperimentelle effektivitet at kvantificere den afstand, der rejses af orme mod et attractant eller fra en afvisende47.
Her beskrives den detaljerede protokol for to nye, halvautomatiske metoder, der er etableret til kvantificering af ormaktivitet. Den første tilgang udnytter ZebraLab en kommerciel software, der oprindeligt blev udviklet til at studere svømning aktivitet Danio rerio (zebrafisk), for en ny medium-throughput ansøgning om at kvantificere den samlede lokomotoriske aktivitet i flydende medier af C. elegans baseret på pixel ændringer under bevægelse (Tabel 1, Figur 1). Data output er hurtigt opnået fra et stort antal samtidige forhold og prøver analyseret på et glas dias, selv om denne metode ikke er egnet til en multi-brønd plade format. Den anden tilgang er en ny tilpasning af WormScan metode48,49 ( Figur2), som bruger en flatbed scanner til at skabe et differentieret billede af to sekventielle scanninger, der kan varierende bruges med open source-software til at muliggøre semi-automatiseret kvantitativ analyse af integrerede fysiologiske resultater såsom fecundity og overlevelse. Her blev der udviklet en ny high-throughput tilpasning af WormScan-metoden til at kvantificere orm lokomotorisk aktivitet i flydende medier i populationer af femten larvetrin 4 (L4) orme pr. brønd af en 96-brønd, fladbundsplade. Denne semi-automatiserede og billige WormScan metode kan let tilpasses til high-throughput drug skærme, samt til analyser af forskellige dyr faser og alderen48,49.
Her er protokollen og effekten af at analysere C. elegans locomotorisk aktivitet ved hjælp af både ZebraLab og WormScan semi-automatiserede metoder demonstreret i en veletableret C. elegans model for mitokondrie kompleks I sygdom, gas-1(fc21). gas-1 (K09A9.5 gen) er en ortholog af human NDUFS2 (NADH: ubiquinon oxidoreductase kerne (jern-svovlprotein) subunit 2) (Figur 3). Den mutante si C. elegans gas-1(fc21) bærer en homoseksuøs p.R290K missense mutation i den menneskelige ortholog af NDUFS250, forårsager signifikant nedsat fecundity og levetid, nedsat respiratorisk kædeoxidativ fosforylering (OXPHOS) kapacitet51, samt nedsat mitokondrie masse og membran potentiale med øget oxidativ stress5,8 . På trods af den veletablerede brug i løbet af de sidste to årtier til at studere mitokondriesygdom blev lokomotorisk aktivitet af gas-1(fc21) mutanter ikke tidligere rapporteret. Her blev ZebraLab og WormScan metoder anvendt til selvstændigt at kvantificere lokomotorisk aktivitet af gas-1(fc21) i forhold til vilde-type (WT, N2 Bristol) orme, både som en måde at validere metoder samt at demonstrere deres komparative nytte og effektivitet af de eksperimentelle protokoller og informatik analyser. ZebraLab software tilladt hurtig kvantificering af flere samtidige betingelser for orm locomotor aktivitet i C. elegans mitokondrie sygdom modeller, med potentiel anvendelse for målrettet lægemiddelscreening eller validering undersøgelser. WormScan analyse, især, er velegnet til let at muliggøre høj-throughput lægemiddel skærme af sammensatte biblioteker og prioritere fører, der forbedrer dyret neuromuskulære funktion og lokomotorisk aktivitet i prækliniske C. elegans modeller af primær mitokondriesygdom.
Her opsummerede undersøgelsen detaljerede oplysninger og rationaler til at studere C. elegans neuromuskulær aktivitet på niveau med forskellige resultater, herunder orm thrashing, bevægelse, svælg pumpning, og chemotaxis. Sammenligningen af 16 forskellige aktivitetsanalysemetoder blev udført med hensyn til den relative gennemløb, fordele og begrænsninger af kvantificere nematodeaktiviteter i en enkelt orm eller ormpopulationer i forskellige aldre og eksperimentelle varigheder. Blandt disse blev to nye ti…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Anthony Rosner, ph.d., med hans organisatoriske støtte til den tidlige forberedelse af dette projekt, og at Erin Haus for at bidrage til protokol analyse. Dette arbejde blev finansieret af Juliet’s Cure FBXL4 Mitochondrial Disease Research Fund, Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund og National Institutes of Health (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 og T32-NS007413). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis finansieringskildernes eller de nationale sundhedsinstitutters officielle synspunkter.
C. elegans wild isolate | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 Bristol | |
Camera | Olympus | DP73 | |
gas-1(fc-21) | CGC | CW152 | |
Microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS | |
Nematode Growth Medium (NGM) | Research Products International Corp. | N81800-1000.0 | |
OP50 Escherichia coli | CGC | Uracil auxotroph E. coli strain | |
Petri dishes (60 mm) | VWR international | 25373-085 | |
S. Basal | VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O | VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660 | |
Scanner | EPSON | V800 | |
Stereomicroscope | Olympus | MVX10 microscope | |
96-well flat bottom | VWR international | 29442-056 | |
WormScan software | Mathew et al. 45 | S1 Standalone Java platform | Software for automation of difference image of scanned plates |
ZebraLab software | ViewPoint | Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis |