이 연구는 C. elegans 복합 I 질병 가스-1(fc21)웜, 즉 ZebraLab (중간 처리량 분석) 및 WormScan (고처리량 분석)에서 두 개의 반 자동 운동 활동 분석 접근 에 대한 프로토콜을 제시하고 nematode 행동과 통합 신경 근육 기능을 정량화하는 광범위한 연구 방법 중 비교 분석을 제공합니다.
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방법 논문
미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Caenorhabditis elegans는 다양한 인간 질병의 메커니즘과 치료를 효율적으로 심문하는 번역 동물 모델로서 중앙 유틸리티로 널리 인정받고 있습니다. 벌레는 빠른 개발 주기, 큰 무리 크기, 짧은 수명, 현미경 투명성, 낮은 유지 보수 비용, 게놈 도구의 강력한 제품군, 돌연변이 리포지토리 및 생체 내 생물학모두에서 중재하는 실험 방법론을 활용하여 치료 목표와 치료에 대한 더 깊은 통찰력을 얻기 위해 높은 처리량 유전 및 약물 화면에 특히 적합합니다. 웜 운동 활동은 미토콘드리아 질환에서 자주 손상되는 특히 관련 표현형을 나타내며, 이는 원인과 증상에서 매우 이질적이지만 세포 에너지를 생산하는 장애인 용량을 집단적으로 공유합니다. 다른 방법론의 제품군은 웜 동작을 심문하는 데 사용될 수 있지만, 이들은 게놈 또는 약물 고처리량 스크린을 위한 실험 비용, 복잡성 및 유용성에 크게 변화합니다. 여기서, 16개의 상이한 활동 분석 방법론의 상대적인 처리량, 장점 및 한계는 다른 단계, 나이 및 실험 기간에 있는 C. elegans의 단 하나 벌레 또는 벌레 집단에서 선충제 운동, 분쇄, 인두 펌핑 및/또는 화학요법을 정량화하는 비교되었습니다. 상세한 프로토콜은 사용 가능한 소프트웨어 도구, 즉 ZebraLab (중간 처리량 접근 법)과 WormScan (높은 처리량 접근 법)의 새로운 응용 프로그램을 나타내는 선충제 운동 활동을 정량화하는 두 가지 반자동 방법을 입증했습니다. 이러한 방법을 적용한 데이터는 L4 애벌레 단계에서 유사한 정도의 감소된 동물 활성을 입증하고, 1일째 성인에서 진행되었으며, 미토콘드리아 복합 I질환(gas-1(fc21)) 돌연변이 벌레는 야생형(N2 Bristol) C. elegans에비해 있었다. 이 데이터는 ZebraLab 또는 WormScan 소프트웨어 도구를 사용하여 미토콘드리아 질환의 전임상 동물 모델에서 웜 거동에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 지원하는 가변 용량으로 웜 운동 활동을 효율적이고 객관적으로 정량화하는 이러한 새로운 응용 분야에 대한 유용성을 검증합니다.
서론
Caenorhabiditis elegans는 결합, 먹이 주기, 계란 누워, 배변, 수영 및 고체 매체1에서운동을 포함한 모든 웜 행동을 조정하는 302 개의 뉴런을 가진 신경 과학에서 뛰어난 모델로 널리 인정받고 있습니다. 이러한 헤마필로디컬 선충은 또한 C. elegans와 인간 사이의 ~80% 유전자의 잘 특징적인 게놈 및 높은 homology에 의해 가능하게 된 다양한 인간 질병 메커니즘을 이해하는 데 널리 사용된다2,3,4. C. elegans는 오랫동안 인간 미토콘드리아 질환5,6,7,8,9,10을심문하는 데 사용되어 왔으며, 이는 세포 에너지를 생성하기 위해 손상된 용량을 공....
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프로토콜
1. ZebraLab 소프트웨어를 사용하여 유리 슬라이드에 액체 매체의 웜 운동 활동 분석
- 선충 성장 및 취급
- 선충 성장 미디어 (NGM)를 포함하는 페트리 플레이트에 C. elegans를 성장하고 음식 소스로 Escherichia 대장균 OP50으로 확산. 이전에 설명된바와같이 20°C에서 웜 배양을 유지한다.
- 시간 제달 을 수행하는 벌레를 동기화52 원하는 단계에서 벌레를 연구. 이 프로토콜에서 L4 단계 웜을 분석했습니다.
- 테스트 또는 버퍼 컨트롤을 테스트할 약물 치료 유무에 관계없이 NGM 플레이트에서 제어 및 돌연변이 웜 균주를 증가시보냅니다. 약물 치료 효과를 평가하기 위해, S. 기저 용액에서 원하는 약물 재고 농도를 준비; 계산된 특정 부피를 NGM 플레이트에 분산시키고 건조시다. 특정 애벌레 또는 성인 단계에서 벌레를 옮기고 분석 전에 원하는 기간 동안 약물 치료 플레이트에 유지하십시오.
- 운동 활동 비디오 녹화 및 ZebraLab 분석을 위한 웜의 실험 설정
- 웜 픽을 사용하여 변형 및 조건당 동기화된 L4 웜 5개를 선택합니다. 카메라에....
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결과
액체 매체에서 C. elegans locomotor 활성의 분석은 고체 매체에서 쉽게 정량화되지 않을 수 있는 미토콘드리아 질병 웜 모델의 통합 표현형을 쉽게 포착할 수 있었다. ZebraLab은 L4 애벌레 단계에서 액체 매체에서 WTworms에 비해 잘 확립된 미토콘드리아 복합체 I 질환가스-1(fc21)의운동 활성을 정량화하는 데 사용되었습니다. 단일 액체 낙하에 5개의 벌레의 활성은 1분 이상 기록되었으며, 각 변형에 대해 총 19개의 비디오(기술 복제)가 기록되어 스트레인당 95개의 웜을 분석한 결과. 4개의 생물학적 복제 실험은 균주당 수득하였다. 웜 활동은 N2 Bristol WT제어(그림 3B)로정규화될 때 픽셀 변경(그림3A)및 제어(POC)의 백분율로 표시됩니다. 가스-1(fc21)웜(62% ± 16% 픽셀 변화, 평균 ± SD, n=19).......
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토론
여기에서, 연구 결과는 벌레 분쇄, 운동, 인두 펌핑 및 화학 요법을 포함하여 다양한 결과의 수준에서 C. elegans 신경 근육 활동을 공부하기 위한 상세한 정보 및 근거를 요약했습니다. 16개의 상이한 활동 분석 방법론의 비교는 다른 연령 및 실험 기간에 단일 웜 또는 웜 집단에서 정량화선충 활동의 상대적 처리량, 장점 및 한계의 관점에서 수행되었다. 이 중, 반자동 분석의 두 가지 새로운 적응 및 응용 프로그램은 L4 애벌레 발달 단계에서 애벌레 단계 와 1 일째에 잘 확립 된 미토콘드리아 복합 I 질환 C. elegans 균주, 가스-1(fc21)WT 대조군에서 유의한 감소를 보여주기 위해 강조되었다.
특히, C. 신경근육 기능 및 운동 활동은 WT 웜 운동이 부비동파 패턴에서 매우 규칙적이기 때문에 고체 매체에서 광범위하게 연구되고 있다. 그들의 정규 이동 경로 및 속도의 이상은 종종 낮은.......
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공개 사항
M.L., N.D.M. 관련 재무 공시가 없습니다. M.J.F.는 미토쿠레아, Inc.의 공동 창립자이며, 리보노바, Inc.에 대한 지분 지분을 가진 과학 자문 위원회 위원, 콘드리온과 라리마르 테라피의 유료 컨설턴트로 과학 이사회 위원입니다. M.J.F.는 이전에 또는 현재 유료 컨설턴트로 미토콘드리아 질환 치료 전임상 및 / 또는 임상 단계 개발에 관련된 여러 회사와 종사하고있다 (아스텔라스 [이전 미토 브리지] 제약 Inc., 사이클리온 치료제, 에피리움 바이오, 이멜 치료제, 미노비아 치료제, NeuroVive, Reneo 치료제, 스텔스 바이오테라피, 조게닉스, Inc.) 및/또는 후원하는 연구 협력자(AADI 치료제, 카르데로 치료제, 사이클리온 치료제, 이멜 치료제, 미노비아 치료제, 미션 테라피, NeuroVive, 랩터 치료제, REATA Inc., 리보노바, 스탠디그알 치료제 및 스텔스 바이오테라피(BioTherapeutics).
감사의 글
이 프로젝트의 초기 준비에 대한 조직적 지원과 프로토콜 분석에 기여한 에린 하우스(Erin Haus)에게 감사드립니다. 이 작품은 줄리엣의 치료 FBXL4 미토콘드리아 질병 연구 기금, Jaxson Flynt C12ORF65 연구 기금 및 국립 보건 원 (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863, 및 T2303-NS1307)에 의해 투자되었다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 기금 모금자 또는 국립 보건 원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| C. elegans 야생 분리& | nbsp; Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 Bristol | |
| Camera | Olympus | DP73 | |
| gas-1(fc-21) | CGC | CW152 | |
| 현미경 슬라이드 | ThermoFisher | 4951PLUS | |
| 선충 성장 배지 (NGM) | Research Products International Corp. | N81800-1000.0 | |
| OP50 대장균 | CGC | Uracil auxotroph E. coli 스트레인 | |
| 페트리 접시 (60 mm) | VWR 국제 | 25373-085 | |
| S. 기초 | VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, 그리고 5 mg 콜레스테롤, 1 l H2O VWR | 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660 | |
| 스캐너 | EPSON | V800 | |
| 실체현미경 | Olympus | MVX10 현미경 | |
| 96-웰 플랫 바텀 | VWR international | 29442-056 | |
| WormScan 소프트웨어 | Mathew et al. 45 | S1 스캔 | 플레이트의 차이 이미지 자동화를 위한 |
| ZebraLab 소프트웨어 | ViewPoint ViewPoint | (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening)에서 설계한 제브라피시 동작의 자동 양자화 및 추적을 위한 소프트웨어 및 여기서는 C. elegans에 적용됩니다. 이 시스템은 고처리량 동작 분석에 적용할 수 있습니다. |
참고문헌
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
- Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085(2011).
- van Ham, T. J., et al.
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재인쇄 및 허가
