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Articolo metodologico

Stampa 3D di microcarrier idrogel in vitro mediante getto alternato di forza viscosa-inerziale

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DOI:

10.3791/62252

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21 aprile 2021

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* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui viene presentata una lieve tecnica di stampa 3D guidata dall'alternanza di forze viscose-inerziali per consentire la costruzione di microcarrier in idrogel. Gli ugelli fatti in casa offrono flessibilità, consentendo una facile sostituzione di diversi materiali e diametri. I microcarrier leganti le cellule con un diametro di 50-500 μm possono essere ottenuti e raccolti per un'ulteriore coltivazione.

Abstract

I microcarrier sono perline con un diametro di 60-250 μm e una grande superficie specifica, che sono comunemente usati come vettori per colture cellulari su larga scala. La tecnologia di coltura del microcarrier è diventata una delle principali tecniche nella ricerca citologica ed è comunemente usata nel campo dell'espansione cellulare su larga scala. I microcarrier hanno anche dimostrato di svolgere un ruolo sempre più importante nella costruzione di ingegneria tissutale in vitro e nello screening clinico dei farmaci. I metodi attuali per la preparazione di microcarrier includono chip microfluidici e stampa a getto d'inchiostro, che spesso si basano su un complesso design del canale di flusso, un'interfaccia bifase incompatibile e una forma a ugello fisso. Questi metodi affrontano le sfide della complessa lavorazione degli ugelli, dei cambiamenti scomodi degli ugelli e delle forze di estrusione eccessive quando applicati a più bioink. In questo studio, è stata applicata una tecnica di stampa 3D, chiamata alternanza viscoso-inerziale a getto di forza, per consentire la costruzione di microcarrier idrogel con un diametro di 100-300 μm. Le cellule sono state successivamente seminate su microcarrier per formare moduli di ingegneria tissutale. Rispetto ai metodi esistenti, questo metodo offre un diametro libero della punta dell'ugello, commutazione flessibile dell'ugello, controllo libero dei parametri di stampa e condizioni di stampa miti per una vasta gamma di materiali bioattivi.

Introduzione

I microcarrier sono perline con un diametro di 60-250 μm e una grande superficie specifica e sono comunemente usati per la coltura su larga scala di cellule1,2. La loro superficie esterna fornisce abbondanti siti di crescita per le cellule e l'interno fornisce una struttura di supporto per la proliferazione spaziale. La struttura sferica offre anche praticità nel monitoraggio e nel controllo dei parametri, tra cui pH, O2 e concentrazione di nutrienti e metaboliti. Se utilizzati in combinazione con bioreattori a serbatoio agitato, i microcarrier possono raggiungere densità cellulari più elevate in un....

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Protocollo

1. Coltura cellulare

  1. Integrare il mezzo essenziale minimo modificato (H-DMEM) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio con il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di soluzione di aminoacidi non essenziali (NEAA), l'1% di penicillina G e streptomicina e l'1% di integratore di glutammina come terreno di coltura per le cellule A549.
  2. Coltura di cellule A549 in un incubatore a CO2 a 37 °C e con co2 al 5%
  3. Dissociare le cellule per la sottocoltura usando la tripsina a circa l'80% di confluenza.
    1. Utilizzare 3 mL di tripsina per trattare le cellule nel matraccio di coltura T75 a 37 °C per 3 minuti, quindi aggiunger....

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Risultati

Testine di stampa di vari tassi di convergenza e diametri sono state fabbricate per ottenere la stampa di più tipi di materiali. Gli ugelli ottenuti con una forza di trazione crescente sono mostrati nella Figura 1B. Gli ugelli sono stati divisi in tre aree: serbatoio (III), contrazione (II) e testina di stampa (I). Il serbatoio era la parte non elaborata dell'ugello, in cui il liquido forniva pressione statica e input bioink per la stampa. L'area di contrazione era la parte principale per ge.......

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Discussione

Il protocollo qui descritto fornisce istruzioni per la preparazione di multi-tipi di microcarrier idrogel e la successiva semina cellulare. Rispetto ai metodi di stampa a chip microfluidico e a getto d'inchiostro, l'approccio AVIFJ alla costruzione di microcarrier offre maggiore flessibilità e biocompatibilità. Un ugello indipendente consente di utilizzare in questi sistemi di stampa un'ampia gamma di ugelli leggeri, tra cui micropipette di vetro. L'elaborazione altamente controllabile consente di regolare liberamente pa.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Beijing Natural Science Foundation (3212007), dal Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), dal Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), dalla National Natural Science Foundation of China (51805294), dal National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) e dal Progetto 111 (B17026).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cellule A549ATCCCCL-185Linea cellulare di carcinoma polmonare umano non a piccole cellule
Microscopio a campo chiaroOlympusDP70
NikonTI-FL
Siero fetale bovino, FBSBI04-001-1ACS Gelatina
SIGMAG1890
Micropipette in vetrosutter strumentob150-110-10
GlutaMAXGIBCO35050-061
H-DMEMGIBCO11960-044Aquila modificata di Dulbecco media
Polvere di perossidasi di rafanoSIGMAP6782
Agente idrofobico3MPN7026Seguire le istruzioni del produttore e utilizzare dopo la diluizione
Dispositivo di microforgiaturanarishigeMF-900
Aminoacidi non essenziali, NEAAGIBCO11140-050Aminoacidi non essenziali
Penicillina G e streptomicinaGIBCO15140-122
Piastra di PetriSIGMAP5731-500EA
StrumentoPuller SutterP-1000
Alginato di sodioSIGMAA0682
TripsinaGIBCO25200-056
Soluzione di collagene di tipo I da coda di rattoSIGMAC3867
Microscopio confocale

Riferimenti

  1. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
  2. Li, B., et al.

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Ristampe e permessi

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