Articolo metodologico

Un metodo di inoculazione semplice e flessibile per valutare accuratamente i fenotipi di infezione da oidio di Arabidopsis e altre piante

DOI:

10.3791/62287

⸱

9 marzo 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland, 2Department of Nutrition and Food Science, University of Maryland College Park, 3Department of Plant Sciences and Landscape Architecture, University of Maryland College Park

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo per la costruzione di un semplice sistema di distribuzione delle spore costituito da una scatola di inoculazione con una maglia di ~ 50 μm e una camera di plastica trasparente. Questo può essere utilizzato per inoculare uniformemente le piante con spore di oidio, consentendo così una valutazione accurata e riproducibile dei fenotipi di malattia delle piante in studio.

Abstract

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Ridurre le perdite di raccolto dovute a malattie fungine richiede una migliore comprensione dei meccanismi che regolano l'immunità delle piante e la patogenesi fungina, che a sua volta richiede una determinazione accurata dei fenotipi di malattia delle piante in seguito all'infezione con un particolare agente patogeno fungino. Tuttavia, un'accurata fenotipizzazione della malattia con patogeni fungini biotrofici non coltivabili come l'oidio non è facile da raggiungere e può essere un passo limitante di un progetto di ricerca. Qui, abbiamo sviluppato un sistema di fenotipizzazione della malattia sicuro, efficiente e facile da usare utilizzando l'interazione Arabidopsis-oidio come esempio. Questo sistema consiste principalmente di tre componenti: (i) una scatola di inoculazione in legno dotata di un coperchio rimovibile montato con una rete in acciaio inossidabile o nylon di ~ 50 μm pori per inoculare un piatto di piante con spore fungine, (ii) una camera di plastica trasparente con una piccola apertura frontale per ridurre al minimo la fuoriuscita di spore durante l'inoculazione all'interno, e iii) un metodo di rimozione e distribuzione delle spore per un'inoculazione uniforme ed efficace. I protocolli qui descritti includono i passaggi e i parametri per realizzare la scatola di inoculazione e la camera di plastica a basso costo e una dimostrazione video di come utilizzare il sistema per consentire l'inoculazione uniforme con spore di oidio, migliorando così l'accuratezza e la riproducibilità della fenotipizzazione della malattia.

Introduzione

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L'oidio è una delle malattie più comuni e importanti di numerose colture alimentari e piante ornamentali1. Gli studi sulle malattie dell'oidio sono stati molto popolari, come evidenziato da oltre 10.500 pubblicazioni come risultato della ricerca con "oidio" come parola chiave sul Web of Science (a partire da novembre 2020). Infatti, l'oidio (rappresentato da Blumeria graminis) è considerato uno dei primi 10 patogeni fungini dalla rivista Molecular Plant Pathology2. La quantificazione della suscettibilità alla malattia è un passo necessario nella caratterizzazione dei geni vegetali che contribuiscono alla resistenza o alla suscettibilità alle malattie, o nell'identificazione funzionale di geni effettori candidati nell'oidio. Tuttavia, la fenotipizzazione affidabile della malattia è molto più difficile con l'oidio rispetto a quella con la maggior parte degli altri patogeni fungini, in parte perché, a differenza delle spore di questi ultimi, le spore di specie di oidio (come Golovinomyces cichoracearum UCSC1 sulla base della nostra esperienza di laboratorio) mostrano una ridotta vitalità dopo aver attraversato un processo di sospensione dell'acqua 3,4 . L'inoculazione inadeguata e/o irregolare delle piante di prova con un particolare patogeno dell'oidio può portare a risultati di fenotipizzazione imprecisi.

Sono stati riportati diversi metodi di inoculazione per studi sull'oidio. Questi includono (i) spazzolare le spore direttamente dalle foglie infette alle piante di prova5, (ii) spruzzare una sospensione di spore per testare le piante6, (iii) soffiare spore usando una torre di decantazione azionata a vuoto alle piante sul fondo della torre7 e (iv) consegna di spore mediante l'uso combinatorio di una membrana a rete di nylon e vibrazioni basate sul suono8 . Il metodo di spazzolatura delle spore (o spolveratura) è facile da eseguire ma di natura irregolare, quindi potrebbe non essere accurato per la valutazione quantitativa. La spruzzatura di spore è conveniente e uniforme, ma come detto sopra può causare una scarsa germinazione delle spore4. Gli ultimi due (cioè iii-iv) sono metodi molto migliorati in grado di raggiungere anche l'inoculazione; Tuttavia, entrambi non sono flessibili nel regolare la loro capacità di inoculazione in termini di numero di piante da inoculare in un singolo evento, rendendo entrambi gli apparecchi non banali, e il loro funzionamento è limitato alle aree di laboratorio dove c'è un vuoto e / o una fonte di elettricità.

Il nostro laboratorio lavora con l'interazione pianta-oidio da oltre 20 anni 9,10. Negli ultimi dieci anni, abbiamo testato una serie di metodi di inoculazione e recentemente abbiamo sviluppato un metodo di inoculazione dell'oidio semplice ma efficace. Questo metodo di spazzolatura delle spore a rete può garantire un'inoculazione uniforme ed è semplice e scalabile, quindi dovrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio che lavora con l'oidio.

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Protocollo

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1. Realizzazione di una scatola di inoculazione standard con un coperchio superiore rimovibile montato con una rete

  1. Acquista un rotolo di rete a membrana di nylon da 50 μm o rete in acciaio inossidabile da 48 μm (consigliato) dai negozi. Assicurati di ordinare abbastanza per tagliare in più pezzi da 14 in x 26 pollici per la sostituzione della rete usurata.
  2. Acquista un pannello di fibra o compensato a media densità da 1/4 in x 2 ft x 4 ft e taglia due 24-1/2 in x 10 in pezzi e due 12 in x 10 in pezzi per fare una scatola di inoculazione. Utilizzare 8 morsetti angolari per sostenere i quattro lati.
    NOTA: se rivolto verso il lato largo del contenitore, il lato sinistro 12 in x 10 in è fissato in modo permanente e il lato destro 12 in x 10 in è una porta rimovibile tenuta in posizione da quattro chiusure magnetiche (Figura 1A, B).
  3. Posizionare quattro parentesi graffe angolari da 2 pollici due in ciascun angolo interno del lato sinistro, un pollice dall'alto e un pollice dal basso, segnare e praticare un foro. Utilizzare le viti per fissare in modo permanente il lato corto sinistro a due lati lunghi (anteriore e posteriore). La distanza interna tra i due lati lunghi dovrebbe essere 12 in e non 11-1/2 in.
  4. Con i morsetti angolari ancora in posizione e il corretto allineamento della porta destra, contrassegnare e forare la posizione dei 4 fermi magnetici per mantenere la porta staccabile destra in posizione. Installare una manopola a pulsante sulla porta. La parte superiore della porta si blocca sotto il coperchio superiore (Figura 1A,B).
  5. Per realizzare un coperchio superiore rimovibile con una rete, tagliare il lungo tassello quadrato di legno in 2 set da 26 pollici e 12-3/4 pollici. Incolla e inchioda i quattro pezzi in modo tale che si adattino alla scatola - le dimensioni interne del telaio sono un po 'più grandi delle dimensioni esterne della scatola, poiché la rete dello schermo sarà attaccata a questa cornice.
  6. Taglia la mesh dello schermo a poco meno di 14 pollici x 26 pollici. Non lasciare che lo schermo sporga oltre la cornice in modo da evitare spigoli vivi. Avere assistenza per allungare lo schermo sul telaio. Tenere la rete con il telaio tramite morsetti (Figura 1C) e utilizzare una pistola cucitrice con le graffette giuste per fissare lo schermo al telaio.
  7. Tagliare due serie di tasselli quadrati di legno più corti (21 pollici e 9 pollici) e utilizzare viti per inserire saldamente la rete lungo il telaio usando i 4 pezzi più corti di tassello quadrato di legno (Figura 1C, D).

2. Fare una camera di inoculazione

  1. Acquista fogli acrilici trasparenti e articoli hardware da negozi appropriati. Tagliare un 7 in x 20 nella finestra di apertura sul foglio acrilico sul lato anteriore della scatola come mostrato nella Figura 2C.
  2. Assemblare i lati sinistro e destro, anteriore (con finestra) e posteriore in una scatola utilizzando 8 morsetti angolari come mostrato nella Figura 2A. Assicurarsi che le misure interne della camera siano uguali alle dimensioni del foglio superiore.
    NOTA: il lato destro è lì per il supporto e non sarà attaccato ai fogli anteriore o posteriore. È 1/2 in più corto rispetto agli altri fogli di proposito. Questo lato destro diventerà una porta "a ribalta" tenuta in posizione da una cerniera ad angolo retto nella parte inferiore e da due chiusure magnetiche nella parte superiore, come mostrato nella figura 2C,D.
  3. Utilizzare parentesi graffe angolari per fissare insieme i pannelli (Figura 2B,C). Tenere le parentesi graffe in posizione, contrassegnare con un pennarello, centrare il pugno e quindi praticare il foro.
    NOTA: la perforazione dell'acrilico è diversa dalla perforazione di qualsiasi altra cosa, non forzare o il lato del foro opposto al trapano potrebbe rompersi. Utilizzare rivetti o viti. Non stringere eccessivamente le viti o l'acrilico potrebbe rompersi con il tempo.
  4. Ruotare la custodia sul lato posteriore e rimuovere i 4 morsetti angolari e posizionare il foglio superiore in posizione. Segna e trapano.
  5. Installare la cerniera ad angolo retto, realizzata con un tutore angolare da 3/4. Utilizzare un dado di bloccaggio in nylon come asta di cerniera. Non stringere, lasciare uno spazio vuoto in modo che la porta ruoti su questa cerniera.
  6. Segnare, centrare, forare e fissare i due magneti magnetici per porte con viti a testa pentola #6-32x3/4". Quindi fissare le piastre di fissaggio con viti a testa piatta #6-32x3/8", vedere Figura 2C, D.

3. Inoculare piante in appartamento

  1. Preparare spore fresche di oidio come inoculi (ad esempio, Arabidopsis oidio Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Coltivare piante mutanti pad4-1 pulite immuno-compromesse di Arabidopsis 11 in una camera di crescita (22 °C, 65% di umidità relativa per 6-8 settimane) e inoculare una o mezza piatta di piante pad4-1 per accumulare spore di oidio fresco sufficienti (Figura 3A).
  2. Coltiva le piante per determinare i fenotipi di infezione in standard 11 in x 21 in x 2,5 in appartamenti.
    NOTA: Le piante di Arabidopsis coltivate a breve giorno (8 ore di luce, 16 ore di buio; 22 ° C) per sei-otto settimane sono buone per i test di infezione con oidio.
  3. Quando sono disponibili spore fresche di oidio da piante infette a 8-10 giorni dopo l'inoculazione (dpi), spostare un piatto di piante per il test di infezione nella scatola di inoculazione all'interno della camera di inoculazione (Figura 1B,2C).
  4. Tagliare 15-20 foglie di Arabidopsis fortemente infette (o 4-6 rosette infette, a seconda delle dimensioni della foglia/rosetta e del livello di inoculazione), lasciare asciugare le foglie se c'è acqua condensata.
  5. Prendi 1-2 foglie o una rosetta con un paio di pinze lunghe usando una mano e affronta le foglie capovolte. Quindi, mettere entrambe le mani attraverso l'apertura della camera e colpire delicatamente il braccio della pinza con un paio di forbici mentre si spostano lentamente le foglie / rosetta sopra la rete montata sulla scatola di inoculazione (Figura 3B). Ripeti questa operazione fino a quando non vengono utilizzate tutte le foglie o le rosette.
    NOTA: Le spore mature si sloggiano facilmente dai conidiofori delle foglie infette. Cerca di rimuovere le spore sulla rete nel modo più uniforme possibile.
  6. Utilizzare una o due spazzole sottili per frullatore a ventaglio per spazzolare delicatamente le spore attraverso la rete (Figura 3C). Assicurarsi di spazzolare l'intera superficie della rete in direzioni diverse per quattro o più volte per massimizzare la distribuzione uniforme delle spore sulle piante sul fondo della scatola di inoculazione (Figura 3D). Picchiettare delicatamente la rete per alcune volte con i pennelli per scrollarsi di dosso le spore che sono bloccate nella rete.
  7. Lascia che le spore si depositino per mezzo minuto. Quindi, spostare fuori l'appartamento contenente le piante inoculate dalla scatola di inoculazione. Coprire l'appartamento con una cupola di plastica e posizionarlo in una camera di crescita (22 °C, 65% di umidità relativa). La fenotipizzazione della malattia può essere eseguita a 5, o da 8 a 12 dpi 12.

4. Inoculare le piante con scatole di inoculazione più piccole

NOTA: Nei casi in cui devono essere inoculate meno piante, è ancora possibile utilizzare la scatola di inoculazione standard. Assicurati di posizionare le piante al centro della scatola. Rimuovere e spazzolare le spore nell'area della rete che copre le piante per garantire che tutte le piante siano inoculate risparmiando inoculi. In alternativa, e preferibilmente, possono essere utilizzate scatole di inoculazione più piccole (come descritto di seguito).

  1. Converti le scatole di cartone in una scatola di inoculazione. Basta rimuovere i lati superiore e inferiore della scatola, fissare l'angolo per rassodarlo se necessario e montare una maglia da 50 μm opportunamente dimensionata sulla parte superiore mediante incollaggio o pinzatura (Figura 4A,B).
  2. Spostare l'appartamento contenente le piante all'interno della camera di inoculazione, posizionare la scatola di inoculazione più piccola sopra l'appartamento per coprire le piante.
  3. Rimuovere e spazzolare le spore come descritto sopra.

5. Inoculare le foglie staccate nelle piastre di Petri

NOTA: Nei casi in cui (i) le spore fresche di oidio sono molto limitate e/o (ii) le piante devono essere mantenute pulite mentre devono essere valutati i fenotipi della malattia e/o la localizzazione subcellulare delle proteine nelle cellule infette, le foglie staccate possono essere utilizzate per l'infezione nelle piastre di MS-agar.

  1. Crea una mini scatola di inoculazione che sia solo leggermente più grande di una capsula di Petri.
  2. Preparare 1/2 forza Murashige e Skoog (MS) piastre di agar medio (1,5%). Aggiungere tiabendazolo (40 mg / L) per ridurre la contaminazione della muffa, se necessario. Conservare le piastre a 4 °C in frigorifero fino all'uso.
  3. Tagliare una o due foglie completamente espanse dalla base del picciolo per ogni singola pianta da testare. Inserire il picciolo delle foglie staccate in agar medium con un angolo di ~30°.
    NOTA: Ogni piastra può contenere 20-40 foglie a seconda della dimensione delle foglie e della piastra utilizzata (Figura 4C).
  4. Inoculare le foglie all'interno della camera di inoculazione come descritto sopra. Spostare il piatto con il coperchio in una camera di crescita.
  5. Tagliare una piccola sezione di una foglia e controllare la localizzazione subcellulare delle proteine in specifici punti temporali.
  6. Per valutare i fenotipi dell'infezione, trasferire le foglie in una piastra di agar MS asettica fresca a 4 o 5 dpi. Tagliare la base del picciolo prima di inserire le foglie nel mezzo di agar fresco. Valutare i fenotipi della malattia a 8 o 9 dpi.

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Risultati

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Qui presentiamo un nuovo metodo di inoculazione delle spore di oidio che è facile da preparare, utilizzare e regolare. La figura 1 mostra l'assemblaggio della scatola di inoculazione standard con enfasi sulla marca del coperchio rimovibile montato con una maglia a membrana da 50 μm. La figura 2 mostra l'assemblaggio della camera di inoculazione. La figura 3 illustra le fasi chiave del processo di inoculazione utilizzando questo sist...

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Discussione

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Il nostro metodo di inoculazione basato su mesh-box presenta diversi vantaggi rispetto ad altri metodi di inoculazione. In primo luogo, può raggiungere una distribuzione uniforme delle spore se utilizzato correttamente, come dimostrato nella Figura 5. In secondo luogo, l'uso di ~ 50 μm di mesh, oltre allo spostamento delle spore mediante un leggero scuotimento delle foglie infette, può ridurre l'infezione delle piante da tripidi o altri insetti che infettano le piante presenti nelle piante d...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (IOS-1901566) a S. Xiao. Gli autori desiderano ringraziare F. Coker e C. Hooks per la manutenzione dell'impianto di crescita delle piante e Jorge Zamora per l'aiuto tecnico associato alla fabbricazione della scatola e della camera di inoculazione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
  48 & micro; m griglia in acciaio inox; Dimensioni: 24" X 48" AmazonNAPer fare il coperchio di una scatola di inoculazione
#6-32 x ¾ " viti a macchina, rondelle piatte e dadi Home DepotNAPer realizzare una camera di inoculazione
#6-32 controdado in nylon zincato (confezione da 4)Home DepotNAPer realizzare una camera di inoculazione
#6-32x3/8" Viti a testa piatta Phillips, rondelle piatte e dadi Home DepotNAPer fissare le piastre di cattura della porta magnetica
#8-32x1/2" viti a macchina, rondelle piatte e dadiHome DepotNAPer il fissaggio di bretelle angolari e cerniera della porta
foglio mascherato con film acrilico estruso trasparente di spessore 0,250;   Taglia: 17 ½ "X 20"Plastiche professionaliSACR.250CEFPer realizzare una camera di inoculazione
mascherato con film acrilico estruso trasparente di 0,250 spesso; Dimensioni: 18" X 20"   Plastiche professionali  SACR.250CEFPer la realizzazione di una camera di inoculazione
lastra acrilica trasparente estrusa con film mascherato di spessore 0,250; Dimensioni: 18" X 30" Plastiche professionaliSACR.250CEFPer la realizzazione di una camera di inoculazione
acrilico estruso trasparente mascherato con film di spessore 0,250; Dimensioni: 20" X 29 ½ "Professional PlasticsSACR.250CEFPer realizzare una camera di inoculazione
1-5/8" porta dell'armadio chiusura magnetica biancoHome DepotModello #P110-WPer realizzare una camera di inoculazione
2" acciaio zincato angolo brace (8-Pack) Home Depot  Modello #13611 Per realizzare una scatola e una camera di inoculazione
3" Morsetto angolareHarbor Freight ToolsSKU 63653, 1852, 60589Per la realizzazione di una camera di inoculazione
3/4"  supporto angolare zincato in acciaio (confezione da 4)Home DepotModello #13542Per la realizzazione di una scatola e una camera di inoculazione
Maniglie di trazione per porte leggere zincate da 4-7/8"Home DepotModello #15184Per realizzare una scatola di inoculazione
Frullatore a ventola fine spazzoleMichaels StoreM10472846 Per l'inoculazione
Kelleher 3/4 "x 3/4" x 36 "tassello quadrato in legno Home DepotNAPer realizzare il coperchio di una scatola di inoculazione
Pannello di fibra a media densità (1/4" x 2' x 4');  Home DepotModel# 1508104Per realizzare una scatola di inoculazione
Vetrini coprioggetti rotondi in vetro con un 500 µ m gridibidi USA Inc.10816Per determinare la densità delle spore
foglio in foglio

Riferimenti

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  10. Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
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