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Articolo metodologico

Misurazione dell'assorbimento di glutammato utilizzando L-[3H]-glutammato radiomarcato in fette trasversali acute ottenute da ippocampo resecato con roditori

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DOI:

10.3791/62292

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2 ottobre 2021

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1Graduate Program in Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2Department of Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 3Department of Biological Sciences, Universidade Federal de Ouro Preto, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive un modo affidabile e semplice per ottenere fette trasversali acute dell'ippocampo ex vivo da topi e ratti utilizzando un tritatessuti. Le fette ottenute da ippocampi resecati possono essere sottoposte ad analisi funzionale dell'assorbimento del glutammato per studiare l'omeostasi del sistema glutammatergico.

Abstract

La rimozione del glutammato dallo spazio extracellulare da parte di trasportatori Na+-dipendenti ad alta affinità è essenziale per garantire che i meccanismi di connettività intrinseca del cervello funzionino correttamente e che l'omeostasi sia mantenuta. L'ippocampo è una struttura cerebrale unica che gestisce le funzioni cognitive superiori ed è oggetto di diversi studi riguardanti le malattie neurologiche. Lo studio dei meccanismi fisiologici e patologici nei modelli di roditori può trarre beneficio dalle preparazioni di fette di ippocampo acuto (AHS). L'AHS ha il vantaggio di fornire informazioni affidabili sulla funzione cellulare poiché la citoarchitettura e i circuiti sinaptici sono preservati. Sebbene i preparati di AHS siano comunemente utilizzati nei laboratori di neurochimica, è possibile trovare alcune differenze metodologiche in letteratura. Considerando che i protocolli distintivi di preparazione delle fette potrebbero modificare le regioni dell'ippocampo analizzate, questo protocollo attuale propone una tecnica standard per ottenere AHS trasversale dall'ippocampo resecato. Questo protocollo, semplice da eseguire, può essere utilizzato in modelli sperimentali di topi e ratti e consente diversi approcci ex vivo che studiano le dinamiche neurochimiche (nell'ippocampo dorsale, intermedio e ventrale) in diversi contesti (ad esempio, manipolazioni transgeniche) o dopo manipolazioni in vivo (ad esempio, trattamenti farmacologici o modelli di roditori adatti per studiare i disturbi clinici). Dopo aver sezionato l'ippocampo dal cervello del roditore, sono state ottenute fette trasversali lungo l'asse setto-temporale (300 μm di spessore). Questi AHS contengono parti distinte dell'ippocampo e sono stati sottoposti a un'indagine neurochimica individuale (ad esempio: trasportatori di neurotrasmettitori utilizzando i rispettivi substrati). Poiché l'ippocampo presenta un'alta densità di sinapsi eccitatorie e il glutammato è il neurotrasmettitore più importante nel cervello, il sistema glutammatergico è un bersaglio interessante per i fenomeni osservati in vivo. Pertanto, l'attuale protocollo fornisce passaggi dettagliati per esplorare l'assorbimento del glutammato nell'AHS ex vivo utilizzando L-[3H]-glutammato. L'utilizzo di questo protocollo per studiare la funzione dell'ippocampo può aiutare a comprendere meglio l'influenza del metabolismo del glutammato sui meccanismi di neuroprotezione o neurotossicità.

Introduzione

L'ippocampo, una struttura cerebrale sepolta in profondità nel lobo temporale mediale di ciascun emisfero, dove si trovano le alte funzioni cognitive, è una delle entità più studiate del sistema nervoso centrale (SNC). La funzione dell'ippocampo è fortemente correlata alla memoria dichiarativa e spaziale. Questa struttura svolge anche un ruolo nel comportamento emotivo e nella regolazione delle funzioni ipotalamiche 1,2,3,4. Da quando è stato confermato, in questa regione si verificano importanti meccanismi di formazione e archiviazione della memoria e il campo ha iniziato a studiare a fondo la regione ippocampale. Di conseguenza, l'uso di modelli animali che assomigliano a disturbi cerebrali umani legati alle funzioni dell'ippocampo, come il morbo di Alzheimer, l'epilessia, la depressione maggiore e lo stress, continua a crescere.

Nei roditori, l'ippocampo è una struttura di forma curva che parte vicino al setto mediale verso la corteccia temporale ventrale. Lungo il suo asse longitudinale, l'ippocampo può essere diviso in tre diverse regioni, ognuna correlata a un circuito specifico1. La parte superiore costituisce l'ippocampo dorsale/settale, la parte inferiore costituisce l'ippocampo ventrale/temporale e l'area tra di loro è considerata l'ippocampo intermedio. Esiste un'ampia letteratura che copre le differenze nelle proiezioni cellulari per ciascuna parte, nonché rapporti di specifici aspetti cognitivi elaborati da ciascuna 5,6. Per quanto riguarda la sua organizzazione interna, le regioni dell'ippocampo possono essere separate dalle sue aree funzionali. L'area dell'ammonide di Cornu (CA) è suddivisa in CA1, CA2 e CA3 e si estende attraverso la parte superiore dell'ippocampo, sopra il giro dentato (DG) e il subiculum, che sono le parti più interne dell'ippocampo (Figura 1). Le sinapsi situate in queste regioni subiscono un continuo riarrangiamento, mostrando processi neurogeni e plastici per tutta la vita3. Diversi studi hanno già dimostrato che distinte manipolazioni sperimentali nell'ippocampo provocano disabilità cognitiva7. Per quanto riguarda la valutazione delle alterazioni biochimiche e molecolari, le tecniche che utilizzano fette acute di cervello sono un ottimo strumento per migliorare la conoscenza dei diversi aspetti dell'ippocampo.

Grazie alla sua precisione e riproducibilità, molti studi che hanno esplorato aspetti dei fenomeni correlati alla neurotrasmissione (attività enzimatica, assorbimento o rilascio) hanno utilizzato AHS trasversale da ippocampo resecato ottenuto da un chopper tissutale 8,9,10,11,12. Questa tecnica di slicing seguita dalla valutazione dell'assorbimento è adatta per sofisticati esperimenti neurochimici che richiedono la conservazione dell'attività del trasportatore dal tessuto ippocampale. Per questo, è preferibile l'impiego di un tritatessuti, poiché è più veloce del vibratomo e fornisce l'AHS in un momento adeguato per l'uso sperimentale con un'adeguata precisione.

La neurotrasmissione eccitatoria nel cervello è compiuta dal glutammato, il neurotrasmettitore più abbondante, anche nell'ippocampo, che dipende in misura maggiore dalla segnalazione del glutammato13,14. L'abbondanza di questo neurotrasmettitore è strettamente controllata nell'ambiente extracellulare. All'interno delle vescicole intracellulari, invece, può arrivare fino a 100 mM15. Una volta rilasciato nella fessura sinaptica, il glutammato non viene metabolizzato e deve essere rimosso per evitare l'eccitotossicità, solitamente innescata come risposta a un sovraccarico di glutammato14,16. L'unico meccanismo che separa la tossicità dalla normale segnalazione è il trasporto sodio-dipendente attraverso l'attività di proteine localizzate nelle membrane plasmatiche, principalmente, delle cellule gliali 14,17,18,19. Questi trasportatori [GLAST (EAAT1) e GLT-1 (EAAT2)] regolano strettamente i livelli extracellulari di glutammato e possono essere modulati da un'ampia gamma di fattori, come la trascrizione del DNA, lo splicing e la degradazione dell'mRNA, la sintesi proteica e il targeting, l'attività di trasporto degli amminoacidi e le attività dei canali ionici 20,21,22,23. Di conseguenza, la loro attività può essere misurata mediante il trasporto di un substrato radiomarcato, come il glutammato.

L'uso di substrati radiomarcati rappresenta un metodo preferibile per quantificare l'attività del trasportatore poiché consentono di tracciare meccanismi dinamici come il trasporto attraverso le membrane cellulari. Oltre alla loro elevata sensibilità e specificità, i vantaggi degli esperimenti con radiotraccianti includono la loro semplicità e la piccola spesa rispetto alle tecnologie concorrenti come la spettrometria di massa24. Inoltre, utilizzando solo piccole quantità di tracciante, i livelli fisiologici dei substrati non vengono alterati, fornendo così un quadro più rappresentativo dello scenario reale dell'attività metabolica.

La disponibilità di approcci sperimentali ex vivo è fondamentale per supportare la ricerca di base sull'identificazione di nuovi bersagli molecolari e sulle attività di scoperta di farmaci. Pertanto, considerando la rilevanza dell'assorbimento del glutammato per l'omeostasi del sistema glutammatergico e l'elevata predominanza delle sinapsi glutammatergiche nell'ippocampo, questo protocollo dimostra come valutare l'attività di assorbimento del glutammato in un metodo veloce e facile da riprodurre utilizzando AHS trasversale dall'ippocampo resecato. Questo test utilizza L-[3H]-glutammato radiomarcato, che consente confronti quantitativi e una chiara visualizzazione dei risultati, e può essere modificato per l'uso con substrati specifici o personalizzati, in un'ampia gamma di condizioni di reazione25.

Le fette acute del cervello presentano molti vantaggi e sono state utilizzate per supportare il cambiamento della funzione sotto manipolazioni farmacologiche e genetiche 26,27,28. Il loro utilizzo beneficia di: (i) la conservazione della funzionalità neurochimica e le interazioni cellula-cellula; (ii) la possibilità di eseguire numerose manipolazioni farmacologiche e genetiche per studiare le vie sottostanti le funzioni neuronali e gliali; (iii) controllo preciso dell'ambiente extracellulare; e (iv) un buon accesso sperimentale a diverse aree ippocampali (come CA1, CA3 o DG), che sono mantenute nella stessa fetta a seconda del metodo di affettamento. Considerando che protocolli distintivi di preparazione della fetta potrebbero modificare le regioni dell'ippocampo esposte, questo protocollo propone una tecnica standard per ottenere AHS trasversale dall'ippocampo resecato. Questo protocollo, semplice da eseguire, può essere utilizzato in modelli di roditori e può consentire diversi approcci ex vivo che studiano le dinamiche neurochimiche in diversi contesti o dopo manipolazioni in vivo29,30 (Figura 2).

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Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvate dal Comitato Etico locale (approvazione del progetto # 33732/CEUA-UFRGS). Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo il disagio e il numero di animali utilizzati negli esperimenti.

1. Preparazione della soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)

  1. In un becher da 1 L, aggiungere circa 0,5 L di acqua sterile o bidistillata e iniziare a mescolare energicamente su un agitatore magnetico. Aggiungere i seguenti componenti HBSS (in mM): 137 NaCl, 0,63 Na2HPO4, 4,17 NaHCO3, 5,36 KCl, 0,44 KH2PO4, 0,41 MgSO4, 0,49 MgCl2, 5,55 D-glucosio (vedi Tabella 1).
  2. Regolare il pH a 7,4 con NaOH o HCl prima di aggiungere 1,26 mM di CaCl2 per evitare precipitazioni. Aggiungere questo sale molto lentamente e sotto agitazione. Portarlo a un volume di 1 L con acqua sterile o bidistillata. Questo tampone verrà utilizzato per lavare il tessuto e per mantenere l'AHS in uno stato vitale durante l'esperimento. Fornirà ioni inorganici mantenendo un pH fisiologico e una pressione osmotica.
    NOTA: L'aggiunta di cationi bivalenti viene effettuata dopo la titolazione del pH per evitare la precipitazione.
  3. Separare due diverse frazioni di HBSS: una sarà tenuta in un bagno d'acqua a 37 °C e utilizzata durante il paradigma di assorbimento, mentre l'altra sarà mantenuta ghiacciata (4 °C) e utilizzata per lavaggi prima e dopo l'esperimento.
    NOTA: E' possibile preparare soluzioni di brodo di ogni sale e tenerle congelate fino all'utilizzo, conservarlo in freezer (-20 °C) e consumarlo entro poche settimane.

2. Preparazione di HBSS senza sodio

  1. Prima di miscelare i componenti per HBSS senza sodio, preparare in anticipo altre due soluzioni: Glucamina-HCl (137 mM) e Glucamina-HEPES (4,17 mM). Mescolare le concentrazioni equimolari di base NMDG e HCl per ottenere la soluzione di glucamina-HCl. Eseguire la stessa procedura con acido libero HEPES 2,0 M per ottenere la soluzione NMDG-HEPES (vedere Tabella 2).
  2. In un becher da 0,5 L, aggiungere circa 0,2 L di acqua sterile o bidistillata e iniziare a mescolare energicamente in un agitatore magnetico. Aggiungere i seguenti componenti tampone (in mM): 137 glucamina-HCl, 4,17 glucamina-HEPES, 5,36 KCl, 0,44 KH2PO4, 1,26 MgSO4, 0,41 MgCl2 e 5,55 D-glucosio (vedi Tabella 2).
  3. Regolare il pH a 7,4 con KOH o HCl e continuare a mescolare. Aggiungere 1,26 mM di CaCl2 molto lentamente e sotto agitazione. Portare la soluzione fino a un volume di 0,3 L con acqua sterile o a doppia distillazione.
    NOTA: Questo tampone verrà utilizzato per misurare l'assorbimento di glutammato non sodio-dipendente, che consentirà la misurazione dell'assorbimento passivo/non specifico di glutammato. Dopo l'esperimento, questo parametro viene sottratto dall'assorbimento totale di glutammato per determinare l'assorbimento sodio-dipendente.
  4. Dopo la preparazione, questo tampone può essere conservato nel congelatore (-20 °C) e utilizzato successivamente negli esperimenti successivi. Lo stesso vale per le soluzioni NMDG.
  5. Durante l'esperimento, mantieni sempre l'HBSS privo di sodio ghiacciato.

3. Organizzare il materiale per la dissezione dell'ippocampo dai ratti

  1. Organizzare l'area di dissezione accanto al lavandino prima di iniziare l'esperimento. Posizionare una ghigliottina specifica per ratti (per i topi sarà possibile utilizzare forbici affilate) nel lavandino per mantenere pulita la panca.
  2. Disporre gli strumenti chirurgici e gli altri materiali per la rimozione del cervello e la dissezione ippocampale nell'ordine di utilizzo e il più vicino possibile al luogo in cui sono necessari (vedi Tabella dei materiali). Metti la capsula di Petri in un secchiello per il ghiaccio. Inoltre, tieni un sacchetto di plastica nelle vicinanze per lo smaltimento della carcassa.
  3. Preparare entrambe le soluzioni HBSS alla concentrazione consigliata per l'uso. L'HBSS privo di sodio può essere congelato e scongelato prima dell'esperimento.
    1. Separare l'HBSS contenente sodio in due porzioni distinte, come precedentemente raccomandato: una riscaldata a 37 °C e un'altra a 4 °C che verrà utilizzata per la dissezione. Scongelare l'HBSS senza sodio e mantenerlo a 4 °C.
  4. Per indurre l'anestesia, utilizzare isoflurano31% al 3%. Prima di iniziare l'esperimento, assicurarsi di verificare l'assenza di riflesso corneale e di stimolazione nocicettiva della zampa posteriore.
    NOTA: Fare attenzione a scegliere il farmaco anestetico adeguato, in quanto non deve interferire con i parametri che saranno oggetto di indagine. Per questo protocollo, si raccomanda l'uso di anestetico inalante (ad es. isoflurano)32.

4. Eutanasia del ratto

  1. Eutanasia del roditore utilizzando i metodi approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), nonché dalla National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, rivista nel 1978).
  2. Usando una ghigliottina, decapitare il ratto immediatamente prima della prima vertebra cervicale.
  3. Posizionare la testa su un tovagliolo di carta pulito inumidito con soluzione salina fredda. Rimuovere completamente il cuoio capelluto con la forbice chirurgica taglia S, così come il muscolo cutaneo con l'obiettivo di esporre completamente le suture sulla superficie superiore del cranio. Iniziare questa procedura con attenzione, iniziando vicino all'osso occipitale e correndo posteriormente fino all'osso nasale.
    NOTA: Nel caso in cui il modello sperimentale sia un topo, utilizzare forbici affilate per rimuovere la testa. Assicurati di tagliare appena dietro il cranio per escludere il tessuto in eccesso.

5. Rimozione del cervello di ratto

  1. Eseguire la rimozione del cervello il più rapidamente possibile. Con una pinza per ossa appropriata, fai un singolo taglio tra i due fori per gli occhi che uniscono entrambi gli orifizi nel cranio del topo. Successivamente, posiziona una punta della forbice chirurgica di taglia S nel forame magno e fai un singolo taglio lateralmente nel cranio. Ripeti per l'altro lato.
  2. Tagliare le placche craniche dalla placca occipitale, quindi lungo la sutura mediana delle placche parietali e infine alla placca frontale verso il naso. Assicurati che la testa del roditore sia tenuta saldamente e che la pressione sia diretta lontano dal cervello per evitare di danneggiare il tessuto sottostante.
    NOTA: È di fondamentale importanza che la pressione sia diretta lontano dal cervello per evitare di danneggiare il tessuto sottostante. Nei ratti e nei topi giovani, è possibile tagliare il cranio con piccole forbici chirurgiche.
  3. Rimuovere delicatamente le placche occipitale e parietale da entrambi gli emisferi utilizzando una spatola o una pinza. Ispezionare attentamente la presenza di qualsiasi dura che possa essere attaccata alle ossa del cranio e allungata sulla superficie del cervello.
  4. Rimuovere immediatamente il cervello con la spatola sottile a doppia estremità e posizionare delicatamente l'intero cervello su una capsula di Petri ghiacciata ricoperta di carta da filtro. Con la pipetta Pasteur in plastica, inumidirla con una soluzione salina ghiacciata. Inizia immediatamente a sezionare l'ippocampo da entrambi gli emisferi cerebrali come spiegato di seguito.
  5. Reseca con cura il cervelletto da tutto il cervello con la lama del bisturi #11. Per separare completamente gli emisferi cerebrali, far scorrere una lama di bisturi attraverso la fessura intraemisferica. Con la pipetta Pasteur in plastica, inumidirla frequentemente con un tampone HBSS ghiacciato per mantenere il tessuto umido e conservato.
  6. Prendi ogni emisfero separatamente, seca il tronco encefalico e il mesencefalo dalla corteccia sovrastante con una forbice dell'iride. Con attenzione, con la forbice chirurgica tagliare il tronco encefalico/mesencefalico/talamo, mentre con una spazzola sottile spingere verso il basso e tirare queste strutture cerebrali. Al di sotto sarà possibile osservare l'ippocampo (superficie mediale) e il ventricolo laterale. La corteccia con l'ippocampo dovrebbe ora essere libera dal tronco encefalico.

6. Dissezione di ippocampi da ratti

  1. Per resecare l'ippocampo, mettere un emisfero cerebrale sul piano coronale con la corteccia parietale rivolta verso il basso. In questo momento, è possibile osservare le fibre bianche della fimbria che formano un'iperbole poco profonda nella parte inferiore dell'ippocampo.
  2. Con molta attenzione, con la mano non dominante, ancorare il tessuto cerebrale con una pinzetta sottile. Con la mano dominante, posiziona altre pinzette sotto la punta caudale dell'ippocampo.
  3. Ancorando i tratti mediali della sostanza bianca, posizionare le pinzette completamente sotto l'ippocampo per separarlo delicatamente dal resto del cervello. Applicare pressione muovendo leggermente la seconda punta anteriormente e lateralmente. Se fatto correttamente, l'ippocampo dovrebbe atterrare sulla carta da filtro.
  4. Per terminare la dissezione dell'ippocampo, rimuovere il tessuto di riserva con le stesse pinzette (di solito la corteccia rimanente, i vasi sanguigni e la sostanza bianca). Ripetere la stessa metodologia per il secondo emisfero.
  5. Una volta rimossi entrambi gli ippocampi, trasferiscili in una capsula di Petri con HBSS posizionata sul secchiello del ghiaccio e trasferiscili nell'area del tavolo da taglio sopra la lama nel tritatessuti. Assicurati di identificare correttamente le aree dorsale e ventrale se l'indagine richiede di analizzarle separatamente.
    NOTA: È importante distinguere sempre le parti ventrale e dorsale dell'ippocampo durante la dissezione. In questo modo, l'estremità anteriore sarà rivolta verso l'alto33. Questa parte dell'ippocampo è leggermente più sottile dell'estremità posteriore.

7. Preparazione delle fette

NOTA: Mentre si dispone il materiale chirurgico sul banco (sessione 2), preparare il tritatessuti per ottenere la fetta trasversale dall'ippocampo resecato.

  1. Impostare i parametri nel tritatutto prima del suo utilizzo. Il Chopper può tagliare fette da 100 a 400 μm; impostarlo su 300 μm. Inoltre, si consiglia un intervallo di 60-80 colpi al minuto, in quanto mantiene l'integrità del tessuto durante la procedura di affettatura.
  2. Dopo tutte le procedure eseguite nella sessione 2, una volta che l'ippocampo è stato resecato dal cervello e posto sulla carta da filtro umidificata con soluzione salina fredda sopra un supporto in polipropilene liscio, allineare ogni ippocampo sulla carta da filtro prima di sottoporli alla procedura di taglio.
  3. Posizionare l'ippocampo alla volta sul tavolo da taglio circolare in acciaio inox dal trinciatessuti, perpendicolarmente alle lame di taglio per ottenere le fette trasversali dell'ippocampo lungo l'asse setto-temporale. Prima di iniziare il processo di tritatura, umidificare leggermente la lama con alcol isopropilico. Questa procedura impedisce al fazzoletto di attaccarsi alla lama, consentendo un taglio più fluido e preciso.
  4. Dopo aver acceso l'apparecchiatura, la lama nel braccio di taglio verrà sollevata e abbassata, affettando il tessuto nello spessore selezionato. Questo è un processo rapido e normalmente il fazzoletto verrà tagliato correttamente dopo un minuto. È possibile tagliare più di un ippocampo contemporaneamente se vengono tenuti adeguatamente separati sul tavolo da taglio.
  5. Per separare le fette, prelevare con cura ogni campione affettato dal tritafazzoletti utilizzando la spatola a doppia estremità e immergerlo in una capsula di Petri con soluzione salina ghiacciata. Usando due pennelli sottili, pizzicare delicatamente l'ippocampo e separare le fette. Prestare attenzione a mantenere l'integrità della sezione durante questo processo.
    1. Eseguire questo esperimento in triplicati, quindi selezionare 6 fette da ciascun campione: 3 fette per l'assorbimento totale di glutammato e 3 per l'assorbimento non specifico.
  6. Con lo spazzolino, trasferire delicatamente ogni fetta dalla piastra di Petri in una piastra a 24 pozzetti contenente: (i) 1 mL di HBSS; e (ii) 1 mL di HBSS senza sodio. Identificare il pozzetto/piastra con i corrispondenti gruppi sperimentali ed eseguire l'analisi almeno in triplicati.
    NOTA: A causa di un problema di tempo limitato, se l'esperimento viene eseguito in triplicati, limita il numero di animali/gruppi a soli 6 alla volta (un ippocampo per animale in 5 minuti di assorbimento). Ciò significa che l'L-[3H]-glutammato verrà somministrato ogni 15 s fino a quando tutte le fette non saranno incubate. Per arrestare la reazione, è necessario osservare lo stesso intervallo per garantire che tutti i campioni siano esposti a un periodo di incubazione di 5 minuti.

8. Saggio di captazione del glutammato

  1. Durante la stabilizzazione delle fette nel rispettivo tampone (HBSS o HBSS privo di sodio), preparare la soluzione contenente radioattività diluendo L-[3H]-glutammato in acqua sterile a una concentrazione finale di 4,5 μCi/mL in un volume finale che consenta 20 μL per fetta più un po' di eccesso, che impedirà la mancanza di input radioattivo alla fine del lotto, poiché sarà necessario quantificare quante disintegrazioni al minuto (DPM) sono state offerte a ciascuna slice all'inizio.
    NOTA: Per ogni piastra da 24 pozzetti, si consiglia di preparare 500 μL di 4,5 μCi/mL di L-[3H]- Glutammato a causa del tempo di incubazione totale necessario per l'assorbimento di L-[3H]-Glutammato (5 min) e del tempo per pipettare ogni aliquota da 20 μL (0,33 μCi in ciascun pozzetto), come spiegato di seguito. La concentrazione madre di L-[3H]-Glutammato è solitamente di 1,0 mCi/mL, quindi preparare una diluizione 1:200 da applicare sulle fette.
  2. Dopo 15 minuti di pre-incubazione in HBSS, rimuovere completamente il tampone con una pipetta Pasteur e sostituirlo aggiungendo alle fette 280 μL di uno dei seguenti: (i) HBSS normale (37 °C) per l'assorbimento totale; o ii) HBSS esente da sodio (4 °C) per l'assorbimento aspecifico. È importante notare che l'assorbimento totale deve essere eseguito su una piastra riscaldante a 37 °C, mentre l'assorbimento non specifico viene eseguito su ghiaccio.
  3. Preparare un timer e impostare l'inizio dell'esperimento quando si aggiungono 20 μL di input nel primo pozzetto contenente una fetta. Attendere 15 - 20 s (a seconda del numero di fette nella piastra) e aggiungere l'input radioattivo al pozzetto successivo e così via fino alla fine dei pozzetti contenenti fette. Distribuire 20 μL di input in tutti i pozzetti, considerando sempre il tempo totale di incubazione (5 min).
  4. Una volta riempiti tutti i pozzetti contenenti le fette della piastra, attendere che la prima fetta completi l'incubazione di 5 minuti con L-[3H]-glutammato. Quindi, rimuovere immediatamente il mezzo di incubazione in un pallone adeguato per i rifiuti radioattivi.
  5. Subito dopo la rimozione, aggiungere rapidamente 300 μL di HBSS ghiacciato e rimuoverlo delicatamente. Ripetere questa procedura altre due volte in ogni pozzetto, completando tre lavaggi per ogni fetta. Assicurarsi di utilizzare l'HBSS privo di sodio per lavare le fette dedicate alla misurazione non specifica dell'assorbimento. Dopo aver lavato tutte le fette nella piastra, aggiungere 300 μl di NaOH 0,5 M a ciascun pozzetto e conservare la piastra protetta con parafilm a 4 °C per una notte.

9. Conteggio del radioattivo L-[3H]-glutammato

  1. Il giorno successivo, etichettare tante provette quante fette nell'esperimento e raccogliere il contenuto del pozzetto in ciascuna provetta. Assicurarsi che le fette siano completamente solubilizzate nella soluzione di lisi. Se necessario, omogeneizzare il campione utilizzando un ago calibro 26 accoppiato a una siringa da 1 mL.
  2. Aggiungere 1,2 mL di liquido di scintillazione a un volume finale di circa 1,5 mL e omogeneizzare tutti i campioni in un vortice prima di leggerli in un contatore a scintillazione per 60 s ciascuno.
    NOTA: Assicurarsi che i parametri di rilevamento siano impostati su trizio e che il risultato venga fornito in DPM.

10. Calcoli

  1. Converte i risultati forniti dal contatore a scintillazione nella radioattività emessa dal reagente intrappolato all'interno della fetta e rappresenta la quantità di glutammato assorbita. Detrarre il valore ottenuto per l'assorbimento non specifico dal risultato ottenuto con l'HBSS regolare. Un μCi equivale a 2,22×106 DPM.
  2. Conoscendo la quantità di μCi e la concentrazione originale di [3H]L-glutammato (informazioni solitamente fornite nel pallone del reagente o nella scheda tecnica), calcolare l'L-[3H]-glutammato catturato da ciascuna fetta.

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Risultati

L'assorbimento del glutammato è uno dei meccanismi più importanti che controllano la neurotrasmissione nel cervello. L'ippocampo, in particolare, è un luogo critico nella segnalazione del glutammato, essendo un importante hub che collega la memoria, la cognizione e le emozioni nel cervello. Seguendo il protocollo, sono stati utilizzati ratti Wistar maschi adulti per generare risultati rappresentativi. Gli animali sono stati anestetizzati con isoflurano al 3% fino a quando non hanno perso conoscenza. Dopo aver sezionato i...

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Discussione

Il protocollo presentato mostra una valutazione dell'assorbimento del glutammato facile da eseguire utilizzando fette di ippocampo. I risultati dimostrano che l'AHS assorbe regolarmente circa 60 fmol di L-[3H]-glutammato radiomarcato, che lo spessore della fetta (quantità di proteine) non ha influenzato l'assorbimento di L-[3H]-glutammato (dati non mostrati) e che le parti dorsale, intermedia e ventrale dell'ippocampo hanno mostrato prestazioni simili quando ottenut...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ricevono sostegno finanziario dall'Istituto Nazionale Brasiliano di Scienza e Tecnologia per l'Eccitotossicità e la Neuroprotezione [465671/2014-4], CNPq [438500/2018-0] e [152189/2020-3], FAPERGS/CAPES/DOCFIX [18/2551-0000504-5], CAPES [88881.141186/ 2017-01], CNPq [460172/2014-0], PRONEX, FAPERGS/CNPq [16/ 2551-0000475-7], FAPERGS/MS/CNPq/SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017]

UFOP - MODALIDADE: "EDITAL PROPP 19/2020 AUXÍLIO À PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS - 2020", PROCESSO N.: 23109.000929/2020-88

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
#11 lama per bisturiSwann-Morton525
Piastra di Petri in vetro da 100 mmFornitori comuni Filtro
Whatman da 110 mm di diametroSigma AldrichWHA1001110
Filtro Whatman da 42,5 mm di diametroSigma AldrichWHA1001042
Piastra per coltura cellulare a 24 pozzettiFalcon353047
BeckerLame
per tritatessutiWilkinson3241
Bone rongeurErwin Guth9,00,005
CaCl2Sigma AldrichC4901
D-[2,3-3H]-Acido asparticoPerkinElmerNET581001MC11,3 Ci/mmol
(37 MBq)
D-glucosioSigma AldrichG8270
N-metil-D-glucaminaSigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.Super Low Level #425-020
Forbici per irideErwin Guth8,00,040
IsofluranoCristalia (Sã Paulo, Brasile)4,10,5251 mL/mL
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4Sigma AldrichP0662
L-[3,4-3H]-Glutammico AcidoPerkinElmerNET490005MC49,7 Ci/mmol
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Pipetta in plastica PasteurFornitori comuni
Liquido di scintillazionePerkinElmer1200.437 per 1 x 5 litriOptiphase HiSafe 3
Piccole forbici chirurgicheErwin Guth8,00,040
Pinzette piccoleErwin Guth6,00,131
Dischi da taglio di ricambio per il tritatuttoFornitori
Forbici standardErwin Guth8,00,010
Spazzole sottili ( dimensione 0 o 2)Fornitori
Sottile spatola a doppia estremitàErwin Guth470.260E
TritatessutiTed Pella, Inc.Codice: 10180
comunicomuni

Riferimenti

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