Qui, presentiamo un protocollo per l'editing genetico nelle cellule T umane primarie utilizzando la tecnologia CRISPR Cas per modificare le cellule CAR-T.
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Articolo metodologico
Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le terapie cellulari adottive che utilizzano cellule T del recettore dell'antigene chimerico (cellule CAR-T) hanno dimostrato una notevole efficacia clinica in pazienti con neoplasie ematologiche e sono attualmente in fase di studio per vari tumori solidi. Le cellule CAR-T sono generate rimuovendo le cellule T dal sangue di un paziente e ingegnerizzandole per esprimere un recettore immunitario sintetico che reindirizza le cellule T per riconoscere ed eliminare le cellule tumorali bersaglio. L'editing genetico delle cellule CAR-T ha il potenziale per migliorare la sicurezza delle attuali terapie cellulari CAR-T e aumentare ulteriormente l'efficacia delle cellule CAR-T. Qui, descriviamo i metodi per l'attivazione, l'espansione e la caratterizzazione delle cellule CAR-T umane CD19 progettate con CRISPR. Ciò comprende la trasduzione del vettore lentivirale CAR e l'uso di RNA guida singolo (sgRNA) ed endonucleasi Cas9 per indirizzare i geni di interesse nelle cellule T. I metodi descritti in questo protocollo possono essere universalmente applicati ad altri costrutti CAR e geni bersaglio oltre a quelli utilizzati per questo studio. Inoltre, questo protocollo discute le strategie per la progettazione del gRNA, la selezione del gRNA principale e la convalida del knockout del gene bersaglio per ottenere in modo riproducibile l'ingegneria CRISPR-Cas9 multiplex ad alta efficienza delle cellule T umane di grado clinico.
Introduzione
La terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico (CAR)-T ha rivoluzionato il campo delle terapie cellulari adottive e dell'immunoterapia del cancro. Le cellule CAR-T sono cellule T ingegnerizzate che esprimono un recettore immunitario sintetico che combina un frammento di anticorpo a catena singola antigene-specifico con domini di segnalazione derivati dalla catena TCRzeta e domini costimulatori necessari e sufficienti per l'attivazione e la co-stimolazione delle cellule T1,2,3,4 . La produzione di cellule CAR-T inizia estraendo le....
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Protocollo
Le cellule T umane sono state acquistate attraverso il nucleo di immunologia umana dell'Università della Pennsylvania, che opera secondo i principi della buona pratica di laboratorio con procedure operative standard stabilite e / o protocolli per la ricezione, l'elaborazione, il congelamento e l'analisi dei campioni conformi alle linee guida etiche MIATA e Dell'Università della Pennsylvania.
1. Produzione vettoriale lentivirale
NOTA: I prodotti virali sono stati resi difettosi di replicazione mediante separazione dei costrutti di imballaggio (Rev, gag/pol/RRE, VSVg e plasmide di trasferimento) in quattro plasmidi s....
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Risultati
Descriviamo qui un protocollo per ingegnerizzare geneticamente le cellule T, che può essere utilizzato per generare sia cellule CAR-T autologhe che allogenei, nonché cellule T reindirizzate TCR.
La Figura 1 fornisce una descrizione dettagliata delle fasi coinvolte nel processo di produzione delle cellule T modificate crispr. Il processo inizia progettando sgRNA per il gene di interesse. Una volta che gli sgRNA sono stati progettati e sintetizzati, vengono poi util.......
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Discussione
Qui descriviamo gli approcci per modificare le cellule CAR-T utilizzando la tecnologia CRISPR Cas9 e fabbricare prodotti per testare ulteriormente la funzione e l'efficacia. Il protocollo di cui sopra è stato ottimizzato per l'esecuzione dell'editing genetico CRIPSR in cellule T umane primarie combinate con cellule T ingegneristiche con recettori dell'antigene chimerico. Questo protocollo consente un'elevata efficienza di knockout con una variabilità minima da donatore a donatore. La modifica utilizzando CRISPR può migli.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno divulgazioni.
Ringraziamenti
Riconosciamo il Nucleo di Immunologia Umana per la fornitura di cellule T normali donatrici e il Nucleo di Citometria a Flusso presso l'Università della Pennsylvania.
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Materiali
Unità PD1 anti-umano
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| centrale 4D-Nucleofactor | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuga | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-umano CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Clone | Biolegend | EH12.2H7 | |
| Cas9-Potenziatori di elettroporazione | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ Kit di isolamento delle cellule T | Tecnologie StemCell | 15062 | |
| Kit di isolamento delle cellule T CD8+ | Tecnologie StemCell | 15063 | |
| Corning 0,45 micron filtro/flacone sottovuoto | Corning | 430768 | |
| Fiaschetta per colture cellulari Corning T150 | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Kit sangue e tessuti | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| celle HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel e pulizia | PCRTakara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Cellula primaria 4D-nucleofattore X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilina-Streptomicina-Glutammina | ThermoFisher | 10378016 | |
| espressione di pTRPE Plasmide | in casa | ||
| Coniglio Anticorpo monoclonale FMC63 scFv, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Provette per ultracentrifuga | Beckman Coulter | 326823 | |
| Miscela per imballaggio virale | in casa | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
Riferimenti
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al.
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Ristampe e permessi
