Questo protocollo descrive come studiare tutte le possibili combinazioni che possono essere ottenute tra quattro farmaci in un unico esperimento. Questo metodo si basa sul saggio standard di micro diluizione a piastre da 96 pozzi e sul calcolo delle concentrazioni inibitorie frazionarie (COV) per valutare i risultati.
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Articolo metodologico
Quadruple-Checkerboard: una modifica della scacchiera tridimensionale per lo studio delle combinazioni di farmaci
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il concetto di terapia a combinazione di farmaci sta diventando molto importante principalmente con il drastico aumento della resistenza ai farmaci. La scacchiera Quadruple, chiamata anche Q-checkerboard, mira a massimizzare il numero di possibili combinazioni che possono essere ottenute tra quattro farmaci in un unico esperimento per ridurre al minimo il tempo e il lavoro necessari per ottenere gli stessi risultati con altri protocolli. Questo protocollo si basa sulla semplice tecnica di micro diluizione in cui i farmaci vengono diluiti e combinati insieme in diverse piastre da 96 pozzi.
Nel primo set di piastre da 96 pozzi, viene aggiunto brodo Muller-Hinton seguito dal primo farmaco richiesto (ad esempio, Cefotaxime qui) per diluirlo serialmente. Dopo che il primo passo è stato fatto, un altro set di piastre da 96 po 'viene utilizzato per diluire il secondo farmaco (ad esempio, Amikaci), che verrà trasferito rimuovendo un volume specifico di farmaco 2 e messo nei pozzi corrispondenti nel primo set di piastre a 96 po 'che contengono il farmaco uno. Il terzo passo viene fatto aggiungendo le concentrazioni richieste del terzo farmaco (ad esempio, Levofloxacina), alle piastre appropriate nel set iniziale contenenti combinazione di farmaco 1 e 2. Il quarto passo viene fatto aggiungendo le concentrazioni richieste del quarto farmaco (ad esempio, Trimethoprim-sulfamethoxazol) nelle piastre appropriate nel primo set. Quindi, L'inoculo batterico E. coli ESBL verrà preparato e aggiunto.
Questo metodo è importante per valutare tutte le combinazioni possibili e ha una gamma più ampia di possibilità da testare inoltre per i test in vivo. Nonostante sia una tecnica stancante che richiede molta attenzione, i risultati sono notevoli e fanno risparmiare tempo dove molte combinazioni possono essere testate in un singolo esperimento.
Introduzione
Con l'aumento della resistenza dovuto all'uso eccessivo e all'uso impropriodi antibiotici 1,2, la necessità di sviluppare nuovi farmaci e agenti per trattare le infezioni batteriche è diventata cruciale. Nuovi approcci come lo sviluppo di nuovi farmaci sono molto importanti per superare la crisi di resistenza. Tuttavia, l'industria farmaceutica non è interessata a sviluppare nuovi agenti antimicrobici. Inoltre, se vengono sviluppati nuovi farmaci, i batteri continuerà a evolversi e sviluppare resistenza contro questi nuovifarmaci 3,4. Pertanto, il prob....
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Protocollo
1. Fasi di preparazione
- Preparare il brodo muller-hinton (MHB) aggiungendo 25 g di brodo MH a 1 L di acqua distillata e mescolare. Autoclave a 121 °C per 2,5 h. Quindi, conservare il supporto autoclavato a temperatura ambiente o in frigo.
- Sottocultura dei batteri in questione(E. coli ESBL) sul supporto dell'agar utilizzando il metodo di striatura a quattro quadranti e incubare durante la notte a 37 °C.
- Usando un ciclo sterile, prendi una colonia e diffondila nella prima metà della piastra di agar MacConkey facendo strette striature parallele.
- Usando il loop, diffondere i batteri nel secondo quadrante striature dal primo ....
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Risultati
La figura 2A rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. I pozzi colorati sono i pozzi che contengono crescita. Notiamo che la quarta piastra non .......
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Discussione
Il metodo Quadruple Checkerboard assomiglia alla scacchiera e alla scacchiera tridimensionale nel suo protocollo. Tuttavia, si dovrebbero prendere in considerazione alcune misure cruciali per evitare errori durante l'esperimento.
Assicurarsi di testare il MIC di ogni farmaco contro l'isolato testato prima di iniziare il protocollo per sapere quali sono le concentrazioni necessarie per avviare le diluizioni con per il farmaco 1 e il farmaco 2 che devono essere diluiti serialmente nelle piastre........
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1000 µ Punte a L | Citotest | 4330000402 | |
| 200 µ Puntali L | Citotest | 4330-0013-17 | |
| Provetta da centrifuga da 50 mL | Corning | 430828 | Per la preparazione di farmaci 3 e 4 Provetta |
| 5 mL in polisterene a fondo tondo | Falcon | Per la preparazione dell'inoculo batterico MacFarland 0,5 | |
| Piastre di Petri da 90 mm | JRZ Plastilab | Come letto per le soluzioni da aggiungere utilizzando la pipetta multicanale | |
| Piastre | a 96 pozzetticorning | 3596 | Per la diltuiazione seriale e la combinazione di farmaci |
| Bactrim 200, 40 mg (Trimetoprim-sulamethoxazolo | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, Francia | 10177403 | Farmaco 4 |
| Ceforano, 1 g (Cefotaxima) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Farmaco 1 |
| Densitometro | |||
| E. Coli ceppo ESBL | Recuperato come ceppo medico dal Saint-George Ospedale Libano | Ceppo batterico | |
| Mac Conkey + agar cristallo violetto | BIO-RAD | 64169508 | Per la produzione di piastre di agar utilizzate per la subcoltura |
| Miacina 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Farmaco 2 |
| Brodo Muller-Hinton | BIO-RAD | 69444 | Per la produzione di terreni batterici |
| Pipetta multicanale | Thermo Scientific | GJ54761 | Per la diluizione seriale e l'aggiunta di terreni, batteri e farmaci |
| Pipette a canale singolo | con | ||
| di carta | |||
| Tavanic, 500 mg (Levofloxacina) | sanofi aventis | 221937/2009 | Farmaco 3 |
Riferimenti
- Ibezim, E. Microbial resistance to antibiotics. African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. <....
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Ristampe e permessi
