Quadruple-Checkerboard: una modifica della scacchiera tridimensionale per lo studio delle combinazioni di farmaci

Con l'aumento della resistenza dovuto all'uso eccessivo e all'uso improprio^{di antibiotici 1,2}, la necessità di sviluppare nuovi farmaci e agenti per trattare le infezioni batteriche è diventata cruciale. Nuovi approcci come lo sviluppo di nuovi farmaci sono molto importanti per superare la crisi di resistenza. Tuttavia, l'industria farmaceutica non è interessata a sviluppare nuovi agenti antimicrobici. Inoltre, se vengono sviluppati nuovi farmaci, i batteri continuerà a evolversi e sviluppare resistenza contro questi nuovi^{farmaci 3,4}. Pertanto, il problema della resistenza non sarà risolto, rendendo la necessità di un altro approccio un must che dovrebbe essere considerato e studiato per superare la resistenza batterica.

La combinazione di farmaci è un concetto molto importante per il trattamento delle infezioni batteriche principalmente quelle causate da agenti patogeni multifarmaco resistenti^5,6. Diminuisce il corso del trattamento, diminuisce la dose somministrata; quindi, diminuendo la tossicità del farmaco dato, aiuta a diminuire il tasso di sviluppo della resistenza e, in un certo senso, sensibilizza i batteri ai farmaci dati come descritto nel concetto di sensibilità collaterale^5,7,8,9.

Lo sviluppo della resistenza a un farmaco richiede una singola mutazione; tuttavia, lo sviluppo della resistenza a una combinazione di farmaci mirati a percorsi multipli richiede diverse mutazioni indipendenti che sono rallentate da questa combinazione. Un esempio di diminuzione della resistenza durante l'utilizzo della terapia combinata è la diminuzione del tasso di resistenza a Rifampin in Mycobacterium Tuberculosis¹⁰. Un altro esempio è uno studio condotto da Gribble et al. Studi hanno dimostrato che lo sviluppo di resistenza agli amminoglicosidi nell'evoluzione dei batteri ha reso questi ceppi sensibili a vari altri farmaci⁵. La combinazione tra il farmaco di classe beta-lattame amoxicillina e l'inibitore della lattamasi acido clavulanico ha mostrato successo nel trattamento di ceppi batterici^{resistenti 8}.

Diminuire il tempo di trattamento è un buon vantaggio derivante dalle combinazioni di farmaci. Ad esempio, una terapia di penicillina combinata o ceftriaxone con gentamicina per 2 settimane darà la stessa efficacia data dalla penicillina o dal ceftriaxone da solo se somministrata per 4 settimane¹¹. La combinazione di farmaci consente l'uso di dosaggi inferiori di farmaci che non sono efficaci se somministrati da soli come i Sub-CCI. L'esempio dei sulfonamidi può essere fornito quando l'uso di tre solfamidi riduce al minimo, a dosi più basse, la tossicità prodotta che è la formazione di cristalli o cristalli quando si utilizzano solfonamidi insolubili a dosi^{complete 12}.

Pertanto, diminuendo il dosaggio dato e il tempo di trattamento alla fine diminuirà la tossicità dei farmaci sul corpo. L'idea di sviluppare metodi per valutare l'interazione tra farmaci combinati è molto importante. In uno studio, i risultati hanno dimostrato che la terapia combinata è più efficace per il trattamento di specie resistenti di Acinetobacter e P. aeruginosa⁸.

Dare farmaci in combinazione
Esistono diversi metodi con cui possiamo studiare le combinazioni di farmaci, come il metodo della scacchiera, il metodo della curva di uccisione del tempo e il metodo di test E¹³. Il metodo della scacchiera può studiare tutte le possibili combinazioni tra i due farmaci in questione in un unico esperimento stesso. Inoltre, è stato sviluppato per studiare una combinazione di tre farmaci¹⁴. Ora, lo estendiamo a studiare una combinazione di quattro farmaci principalmente per il trattamento di agenti patogeni multirrogatori.

Il test della curva di uccisione del tempo viene solitamente eseguito per testare l'effetto battericida di un certo farmaco. È stato anche usato per testare l'effetto delle combinazioni di farmaci in cui diversi farmaci sono combinati a concentrazioni specifiche. Questo protocollo richiede la preparazione di diversi tubi sterili o tazze in cui in ogni tazza aggiungiamo il brodo, la combinazione di farmaci e il ceppo batterico richiesto. Dopo l'incubazione e la registrazione della densità ottica in diversi punti di tempo, i risultati vengono confrontati con il tasso di crescita normale del ceppo utilizzato per vedere se il tasso di crescita è aumentato, diminuito o non è^{cambiato 13}.

Il metodo di prova elettronica viene solitamente eseguito per verificare la concentrazione inibitoria minima (MIC) in cui una striscia contenente una concentrazione gradiente del farmaco in questione viene messa su una piastra inoculata. È stato anche utilizzato per testare la combinazione tra due farmaci in cui due strisce vengono aggiunte alla piastra in modo perpendicolare intersecandosi ai loro^{CCI 13}.

Secondo la letteratura, non esiste un gold standard per definire e studiare la sinergia; pertanto, è difficile valutare quale dei metodi utilizzati per studiare la combinazione sia migliore e quale produca risultati migliori e più affidabili principalmente¹³. Tuttavia, il test time-kill richiede molto lavoro, richiede molto tempo e^{costa 15,16}, mentre il metodo di test E viene sviluppato per studiare una combinazione solo tra due farmaci. La scacchiera può studiare tutte le possibili combinazioni tra i due farmaci testati ed è per questo che questa tecnica è stata scelta per essere sviluppata.

1. Fasi di preparazione

1. Preparare il brodo muller-hinton (MHB) aggiungendo 25 g di brodo MH a 1 L di acqua distillata e mescolare. Autoclave a 121 °C per 2,5 h. Quindi, conservare il supporto autoclavato a temperatura ambiente o in frigo.
2. Sottocultura dei batteri in questione(E. coli ESBL) sul supporto dell'agar utilizzando il metodo di striatura a quattro quadranti e incubare durante la notte a 37 °C.
   1. Usando un ciclo sterile, prendi una colonia e diffondila nella prima metà della piastra di agar MacConkey facendo strette striature parallele.
   2. Usando il loop, diffondere i batteri nel secondo quadrante striature dal primo quadrante.
   3. Dal secondo quadrante, estendere le striature nel terzo quadrante utilizzando striature parallele ravvicinate.
   4. Diffondere i batteri al centro del quarto quadrante striature dal terzo quadrante.

2. Preparazione del pannello

1. Posizionare quattro piatti da 96 po', uno accanto all'altro, per formare un quadrato. Usando un nastro adesivo, rastresere il fondo insieme.
2. Ripetere questo passaggio per ottenere quattro pannelli ciascuno contenente 4 piastre e denominarle A1, A2, A3 e A4.
3. Aggiungere 50 μL di brodo MH ai pozzi tra la colonna 2 e la colonna 11 nelle piastre da 16 96 pozza dei quattro pannelli.
4. Aggiungere 200 μL di brodo MH al pozzo H12 fungendo da pozzo di controllo negativo nelle piastre da 16 96 pozza dei quattro pannelli.
5. Aggiungere 150 μL di brodo MH ai pozzali A1 e H1 fungendo da pozzi di controllo positivi nelle piastre da 16 96 pozza dei quattro pannelli.

3. Farmaco 1, Cefotaxime, diluizione seriale

1. Ad un tubo conico aggiungere 15 ml di dH_{sterile 2}O.
   1. Calcolare il volume da rimuovere dalla soluzione stock del farmaco seguendo la formula C₁V₁ = C₂V₂. Pertanto, V₁ = (C₂ x 15 mL) / C₁.
      NOTA: Nel nostro caso, la soluzione di cefotaxime stock è di 10⁵ μg/mL e C₂ è di 256 μg/mL; quindi, V₁ = 38,4 μL.
2. Rimuovere il volume calcolato dai 15 mL di dH_{sterile 2}O, quindi aggiungere il farmaco.
3. Pipetta 50 μL della soluzione farmacologica preparata in ogni pozzo nella colonna 11 e nella colonna 12 ad eccezione di H12.
4. Iniziare la diluizione seriale rimuovendo 50 μL dalla colonna 11 e inserendola nei pozzi corrispondenti nella colonna 10, quindi da 10 fino a raggiungere la colonna 2 dove i 50 μL prelevati dalla colonna 2 verranno scartati.
5. Ripetere i passaggi 3.4 e 3.5 per tutte le 16 piastre da 96 pozzi dei quattro pannelli.

4. Droga 2, Amkacin, diluizione seriale

1. A un tubo conico aggiungere 10 ml di dH_{sterile 2}O.
2. Calcolare il volume da rimuovere dalla soluzione stock del farmaco seguendo la formula C₁V₁ = C₂V₂. Pertanto, V₁ = (C₂ x 10 mL) / C₁.
   NOTA: Nel nostro caso, la soluzione stock di Amikacin è di 10³ μg/mL e C₂ è di 64 μg/mL; quindi, V₁ = 64 μL.
3. Rimuovere il volume calcolato dai 10 mL di dH_{sterile 2}O, quindi aggiungere il farmaco.
4. Prendi otto piatti separati da 96 pozzi.
5. Ad ogni piastra, aggiungere 100 μL di MHB ai pozzi tra le file G e B.
6. Aggiungere 100 μL della soluzione di farmaco 2 precedentemente preparata ai pozzi della riga G.
7. Diluire serialmente dalla riga G alla riga B prendendo 100 μL da ogni pozzo e infine scartare i 100 μL dai pozzi della riga B.
8. Ripetere i passaggi 4.5, 4.6 e 4.7 per preparare otto piastre.

5. Trasferimento della droga 2 ai quattro pannelli

1. Pipetta 50 μL di farmaco 2 dai pozzi tra le file G e B nei pozzi corrispondenti in ogni piastra nei quattro pannelli. Una piastra preparata da 96 pozzi contiene 100 μL di farmaco 2 che è sufficiente per due piastre in un pannello.

6. Farmaco 3, Levofloxacina, aggiunta

1. A quattro diversi tubi conici aggiungere 14 ml di dH_{sterile 2}O.
2. Calcolare il volume da rimuovere dalla soluzione stock del farmaco seguendo la formula C₁V₁ = C₂V₂. Pertanto, V₁ = (C₂ x 14 mL) / C₁.
   NOTA: Nel nostro caso, la levofloxacina viene preparata in quattro diverse concentrazioni da una soluzione stock di 5 x 10³ μg/mL.
   C₁ = 2 μg/mL, V₁ = 5,6 μL
   C₂ = 4 μg/mL, V₁ = 11,2 μL
   C₃ = 8 μg/mL, V₁ = 22,4 μL
   C₄ = 16 μg/mL, V₁ = 44,8 μL
3. Rimuovere il volume calcolato dai 14 ml di dH₂O sterile da ogni tubo, quindi aggiungere il farmaco.
4. Dopo aver preparato le concentrazioni richieste del terzo farmaco, assumere 50 μL e aggiungerlo ai pozzi corrispondenti tra le file B e G e le colonne 2 e 12 nella piastra corrispondente in ogni pannello in cui C1 corrisponde alle quattro piastre P1 nei quattro pannelli, C2 corrisponde alle quattro piastre P2 nei quattro pannelli , C3 corrisponde alle quattro piastre P3 nei quattro pannelli e C4 corrisponde alle quattro piastre P4 nei quattro pannelli.

7. Farmaco 4, Trimethoprim-sulfamethoxazolo, aggiunta

1. A un tubo conico aggiungere 14 ml di dH_{sterile 2}O.
2. Calcolare il volume da rimuovere dalla soluzione stock del farmaco seguendo la formula C₁V₁ = C₂V₂. Pertanto, V₁ = (C₂ x 14 mL) / C₁.
   NOTA: Nel nostro caso, il trimethoprim-sulfamethoxazolo viene preparato in quattro diverse concentrazioni da una soluzione stock di 48 x 10³ μg/mL.
   C₁ = 512 μg/mL, V₁ = 149,33 μL
   C₂ = 1024 μg/mL, V₁ = 298,66 μL
   C₃ = 2048 μg/mL, V₁ = 597,33 μL
   C₄ = 4096 μg/mL, V₁ = 1 194,66 μL
3. Rimuovere il volume calcolato dai 14 ml di dH_{sterile 2}O di ogni tubo, quindi aggiungere il farmaco.
4. Dopo aver preparato le concentrazioni richieste del quarto farmaco, assumere 50 μL e aggiungerlo ai pozzi corrispondenti tra le righe B e G e le colonne 2 e 12 nelle quattro piastre nel pannello corrispondente dove C1 corrisponde al pannello 1, C2 corrisponde al pannello 2, C3 corrisponde al pannello 3 e C4 corrisponde al pannello 4.

8. Preparazione e aggiunta di inoculo batterico E. coli ESBL

1. Utilizzando un anello sterile, trasferire una colonia dell'isolato batterico E. coli ESBL precedentemente coltivato su una piastra in 2 mL di MHB sterile e vortice.
2. Verificare la torbidità dove dovrebbe essere 0,5 McFarland utilizzando un densitometro.
3. Aggiungere 80 mL di brodo MH sterile a una tazza di urina sterile.
4. Aggiungere l'inoculo batterico dall'inoculo di 0,5 McFarland alla tazza di urina dopo C₁V₁ = C₂V₂, dove V₁ = (10⁶ x 80 mL) / 10⁸ = 800 μL.
5. Pipetta 50 μL della soluzione di inoculo 10⁶ CFU/mL in ogni pozzo ad eccezione di H12, che è il pozzo di controllo della sterilità.
6. Incubare i pannelli a 37 °C durante la notte.
7. Dopo l'incubazione, aggiungere 50 μL di Iodotetrazolium per registrare la crescita nei pozzi.

9. Protocollo per il modello FIC (file supplementare)

1. Scrivere la più alta concentrazione del farmaco 1 (Cefotaxime) nella cella gialla nel pannello A.
2. Scrivi la più alta concentrazione del farmaco 2 (Amikacin) nella cella gialla nel pannello B.
3. Scrivi la più alta concentrazione del farmaco 3 (Levofloxacina) nella cella gialla nel pannello C.
4. Scrivi la più alta concentrazione di farmaco 4 (Trimethoprim-sulfamethoxazole) nel pannello D.
5. Traccia la Linea Rossa (interfaccia Crescita/nessuna Crescita) evidenziando i pozzi con crescita in rosso.
6. Scrivi il MIC del farmaco 1 nella tabella del farmaco 1 (ATB1).
7. Scrivi il MIC del farmaco 2 nella tabella del farmaco 2 (ATB2).
8. Scrivi il MIC del farmaco 3 nella tabella del farmaco 3 (ATB3).
9. Scrivi il MIC del farmaco 4 nella tabella del farmaco 4 (ATB4).
10. Per calcolare il FIC per ATB1
    1. Determinare i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita.
    2. Nella tabella ATB1, fare doppio clic sulla cella accanto a FIC1 e trascinare la cella gialla a sinistra del pannello A sul primo pozzo selezionato.
    3. Ripetere il passaggio 9.10.2 per ogni pozzo selezionato dove ben 1 corrisponde a FIC1, ben 2 corrisponde a FIC2 e così via.
11. Per calcolare il FIC per ATB2
    1. Nella tabella ATB2, fare doppio clic sulla cella accanto a FIC1 e trascinare la cella gialla a sinistra del pannello B nel primo pozzo preselezione.
    2. Ripetere il passaggio 9.11.1 per ogni pozzo preselezione.
12. Per calcolare il FIC per ATB3
    1. Nella tabella ATB3, fare doppio clic sulla cella accanto a FIC1 e trascinare la cella gialla a sinistra del pannello C nel primo pozzo preselezione.
    2. Ripetere il passaggio 9.12.1 per ogni pozzo preselezione.
13. Per calcolare il FIC per ATB4
    1. Nella tabella ATB4, fare doppio clic sulla cella accanto a FIC1 e trascinare la cella gialla a sinistra del pannello D nel primo pozzo preselezione.
    2. Ripetere il passaggio 9.13.1 per ogni pozzo preselezione.
14. Nella tabella con l'etichetta ATB1+2+3+4, sommare automaticamente il FIC1 di ogni ATB. Lo stesso accadrà per gli altri TEC (FIC2, FIC3 e così via).
    1. Nella cella contenente FIC ed evidenziata in giallo, fare doppio clic su di essa e selezionare i ΣFIC sommati dalla tabella ATB1+2+3+4.
15. Ripetere questi passaggi per ciascuno dei nove fogli che rappresentano le nove piastre.
    NOTA: Nel foglio FIC all, la tabella mostrerà il FIC riassunto finale con l'interpretazione del valore ottenuto.

10. Determinazione MIC utilizzando il saggio di microdiluizione per i quattro farmaci

1. Etichettare quattro righe diverse con l'abbreviazione di ogni farmaco testato. Ad esempio, CTX per Cefotaxime, AMK per Amikacin, LEVO per Levofloxacina e SXT per Trimethoprim-sulfamethoxazolo.
2. Pipetta 200 μL di brodo sterile Muller Hinton in pozzo numero 1 e pozzo numero 12 in ogni riga usata. Bene, il numero 12 servirà bene come controllo negativo.
3. Pipetta 100 μL di brodo sterile Muller Hinton ai pozzi da 2 a 11 in ogni fila usata.
4. Calcolare il volume di ciascun farmaco da aggiungere utilizzando la formula C₁V₁ = C₂V₂. Pertanto, V₁ = (C₂ x 4 x V₂) / C₁. V₂ è il volume finale nei pozzi che è di 200 μL, C 1 è la concentrazione della_soluzione stock, e C₂ è la concentrazione iniziale che dobbiamo avere nel primo pozzo.
   NOTA: Qui, usiamo quanto segue:
   Cefotaxime: C₁ = 10⁵ μg/mL, dove lo diluiamo a 10⁴ μg/mL, C₂ = 256 μg/mL; quindi, V₁ = 20,48 μL
   Amikacina: C₁ = 10³ μg/mL, C₂ = 64 μg/mL; quindi, V₁ = 51,2 μL
   Levofloxacina: C₁ = 5 x 10³ μg/mL, dove la diluiamo a 5 x 10² μg/mL, C₂ = 16 μg/mL; quindi, V₁ = 25,6 μL
   Trimethoprim-Sulfamethoxazolo: C₁ = 48 x 10³ μg/mL, C₂ = 4096 μg/mL; quindi, V₁ = 68,26 μL
5. Pipettare il volume richiesto per ogni farmaco nel primo pozzo della riga corrispondente dopo aver rimosso lo stesso volume dal brodo da 200 μL per ottenere un volume totale di 200 μL dopo l'aggiunta del farmaco.
6. Diluire serialmente rimuovendo 100 μL dal pozzo 1 al pozzo 2 e così via fino a raggiungere ben 10 dove i 100 μL rimossi da ben 10 verranno scartati. Si noti che ben 11 funge da pozzo di controllo positivo.
7. Pipetta 100 μL di 10⁶ inoculo batterico preparato in ogni pozzo in ogni riga utilizzata ad eccezione del pozzo numero 12 che funge da controllo negativo.
8. Incubare a 37 °C durante la notte.

La figura 2A rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. I pozzi colorati sono i pozzi che contengono crescita. Notiamo che la quarta piastra non contiene crescita nel quadrante contenente la combinazione. Questo perché in questa piastra abbiamo il MIC di Levofloxacina che inibisce la crescita. In questa figura, possiamo vedere che il MIC del Cefotaxime è ottenuto nel pozzo A8, che è uguale a 32 μg/mL. Il MIC di Amikacin è ottenuto nel pozzo E1, che è uguale a 16 μg/mL. Un effetto di inibizione è visto nella fila contenente 1/2 MIC di Amikacin (riga D) oltre a diversi subMIC di Cefotaxime e Levofloxacina oltre a 1/8 MIC di Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Questa inibizione della crescita batterica in pozzi contenenti concentrazioni subMIC potrebbe essere una forma di sinergia tra queste concentrazioni dei quattro farmaci.

La figura 2B rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. I pozzi colorati sono i pozzi che contengono crescita. Seguire la stessa interpretazione per la quarta piastra. Nel pannello rappresentato da questa figura, possiamo vedere che il modello di inibizione della crescita batterica si è verificato anche nella riga D, dove i pozzi contengono subMIC di Cefotaxime e levofloxacina, 1/2 MIC di Amikacin e 1/4 MIC di Trimethoprim-sulfamethoxazole.

La figura 2C rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. I pozzi colorati sono i pozzi che contengono crescita. Seguire la stessa interpretazione per la quarta piastra. Per quanto riguarda il modello di inibizione in questo pannello, possiamo vedere che nelle righe C e D la crescita non è vista. Ciò significa che nei pozzi contengono diversi subMIC di Cefotaxime e Levofloxacina oltre a 1/2 MIC di Trimethoprim-sulfamethoxazole e 1/4 MIC e 1/2 MIC di Amikacin.

La figura 2D rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. Seguire la stessa interpretazione per la quarta piastra. Possiamo vedere che solo nella riga A e nella colonna 1 abbiamo pozzi colorati che significano crescita. Questo perché in questo pannello abbiamo il MIC di trimethoprim-sulfamethoxazolo che inibisce totalmente la crescita.

Figura 2: Risultati sperimentali ottenuti nella prova 1 per alcune combinazioni testate. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa cifra.

File supplementare. Clicca qui per scaricare questo file.

nessuno.