Escherichia coli è la principale causa di meningite batterica gram-negativa neonatale. Durante l'infezione batterica, le specie reattive di ossigeno prodotte dai neutrofili svolgono un ruolo battericida importante. Qui introduciamo un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili in risposta alla meningite E. coli.
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Articolo metodologico
Quantificazione in tempo reale delle specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili infettati da Escherichia Coli meningitica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'Escherichia coli (E. coli)è il batterio Gram-negativo più comune che causa meningite neonatale. Il verificarsi di batteriemia e penetrazione batterica attraverso la barriera ematica-encefalica sono passi indispensabili per lo sviluppo della meningite E. coli. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) rappresentano i principali meccanismi battericidi dei neutrofili per distruggere gli agenti patogeni invasi. In questo protocollo, la produzione di ROS intracellulare dipendente dal tempo nei neutrofili infetti da meningite E. coli è stata quantificata utilizzando sonde ROS fluorescenti rilevate da un lettore di micropiacche a fluorescenza in tempo reale. Questo metodo può anche essere applicato alla valutazione della produzione di ROS nelle cellule di mammifero durante le interazioni patogeno-ospite.
Introduzione
La meningite batterica neonatale è una malattia infettiva pediatrica comune. L'Escherichia coli (E. coli) con una capsula K1 è il più comune agente patogeno Gram-negativo che causa meningite batterica neonatale, rappresentando circa l'80% dell'incidenzatotale 1,2,3. Nonostante i progressi nella chemioterapia antimicrobica e nelle cure di supporto, la meningite batterica è ancora una delle condizioni più devastanti con elevata morbilità e mortalità4.
Il verificarsi di meningite batterica neonatale di solito ....
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Protocollo
Il sangue periferico dei volontari applicato in questa ricerca è stato approvato dall'Institutional Review Board della prima Hospital of China Medical University (#2020-2020-237-2).
1. Preparazione dei reagenti e del mezzo di coltura
- Preparare il tampone di lisi dei globuli rossi aggiungendo 8,29 g di NH4Cl, 1 g di KHCO3, 37,2 mg di Na2EDTA in 1 L di acqua distillata doppia e regolare il pH a 7,2-7,4. Rimuovere i batteri mediante filtrazione utilizzando filtri da 0,22 μm.
- Preparare il terreno di coltura sperimentale per i neutrofili aggiungendo il 5% di siero bovino fetale al mezzo RPMI 1....
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Risultati
Utilizzando il protocollo delineato in questo articolo, i neutrofili sono stati isolati dal sangue periferico umano e caricati con sonda a fluorescenza DHE per rilevare i cambiamenti dei livelli di ROS in risposta all'infezione da E44. Qui forniamo dati rappresentativi che dimostrano la produzione ROS evocata dalla deformazione E44 determinata da un lettore di micropiatte in tempo reale. Aggiungendo ceppi E44 ad un MOI di 100, i livelli di ROS sono aumentati immediatamente e hanno mostrato una continua tendenza all'aumen.......
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Discussione
I neutrofili agiscono come il componente più abbondante dei globuli bianchi nella circolazione sanguigna umana. Sono importanti cellule effettori nel sistema immunitario umano innato, che costruisce la prima linea di difesa contro l'invasione di agenti patogeni11. La generazione di ROS rappresenta uno dei principali meccanismi battericidi dei neutrofili dopo la fagocitosi11. Recenti studi hanno dimostrato che una struttura simile a una rete rilasciata da un neutrofilo chiam.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) e dal Programma di Distinguished Professor della provincia di Liaoning (LJH2018-35).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da centrifuga coniche in polipropilene da 15 mL | KIRGEN | KG2611 | |
| Piastra a 96 pozzetti | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Contatore di cellule autonome | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Sicurezza biologica Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Infusione di cuore cerebrale | BD | 237500 | |
| CD16 Microsfere, umano | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuga | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Colonne | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Diidroetidio (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Siero fetale bovino | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubatore | Heraeus | Hera Cell | |
| tampone di separazione MACS | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Lettore di micropiastre | Dispositivi molecolari | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| Unità di separazione QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicina | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medio | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Agitatore termostatico | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Estratto di lievito | OXOID | LP0021 |
Riferimenti
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11(2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants
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Ristampe e permessi
