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Articolo metodologico

Determinazione delle classi lipidiche e lipidiche totali in campioni marini

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DOI:

10.3791/62315

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11 dicembre 2021

 , 
1Department of Ocean Sciences and CREAIT Network, Memorial University of Newfoundland

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo è per la determinazione dei lipidi in acqua di mare e campioni biologici. I lipidi nei filtrati vengono estratti con cloroformio o miscele di cloroformio e metanolo nel caso di solidi. Le classi lipidiche sono misurate mediante cromatografia a strato sottile con rilevamento della ionizzazione a fiamma e la loro somma fornisce il contenuto lipidico totale.

Abstract

I lipidi sono in gran parte composti da carbonio e idrogeno e, quindi, forniscono una maggiore energia specifica rispetto ad altre macromolecole organiche nel mare. Essendo ricchi di carbonio e idrogeno sono anche idrofobici e possono agire come solvente e vettore di assorbimento per contaminanti organici e quindi possono essere driver di bioaccumulo inquinante negli ecosistemi marini. La loro natura idrofobica facilita il loro isolamento dall'acqua di mare o da campioni biologici: l'analisi lipidica marina inizia con il campionamento e poi l'estrazione in solventi organici non polari, fornendo un metodo conveniente per la loro separazione da altre sostanze in una matrice acquatica.

Se l'acqua di mare è stata campionata, il primo passo di solito comporta la separazione in fazioni "disciolte" e "particolato" definite operativamente mediante filtrazione. I campioni vengono raccolti e i lipidi isolati dalla matrice del campione tipicamente con cloroformio per materia veramente disciolta e colloidi, e con miscele di cloroformio e metanolo per solidi e campioni biologici. Tali estratti possono contenere diverse classi da fonti biogeniche e antropogeniche. In questo momento, i lipidi totali e le classi lipidiche possono essere determinati. Il lipide totale può essere misurato sommando le classi lipidiche determinate individualmente che di solito sono state separate cromatograficamente. La cromatografia a strato sottile (TLC) con rilevamento della ionizzazione di fiamma (FID) viene regolarmente utilizzata per l'analisi quantitativa dei lipidi da campioni marini. TLC-FID fornisce informazioni sulla classe lipidica sinottica e, sommando le classi, una misurazione lipidica totale.

Le informazioni sulla classe lipidica sono particolarmente utili se combinate con misurazioni di singoli componenti, ad esempio acidi grassi e / o steroli, dopo il loro rilascio da estratti lipidici. L'ampia varietà di strutture e funzioni lipidiche significa che sono ampiamente utilizzate nella ricerca ecologica e biogeochimica che valuta la salute dell'ecosistema e il grado di influenza degli impatti antropogenici. Sono stati impiegati per misurare sostanze di valore dietetico per la fauna marina (ad esempio, acquafeed e / o prede) e come indicatore della qualità dell'acqua (ad esempio, idrocarburi).

Introduzione

I metodi qui descritti riguardano sostanze che sono definite operativamente come lipidi marini. Questa definizione si basa sulla loro suscettibilità all'estrazione liquido-liquido in solventi organici non polari e fornisce un metodo conveniente per la loro separazione da altre sostanze in una matrice acquatica. La loro natura idrofoba facilita il loro isolamento dall'acqua di mare o dai campioni biologici, così come il loro arricchimento e la rimozione di sali e proteine.

La misurazione del contenuto lipidico e della sua composizione negli organismi marini è stata di grande interesse per l'ecologia della rete alimentare, la nutrizione dell'acquacoltura e la scienza dell'alimentazione per decenni. I lipidi sono componenti universali negli organismi viventi, che agiscono come molecole essenziali nelle membrane cellulari, come principali fonti di energia biodisponibile, fornendo isolamento termico e galleggiabilità e fungendo da molecole di segnalazione. Sebbene le procedure per la determinazione dei lipidi in altri campi siano state descritte bene, il loro uso con campioni marini richiede comunemente modifiche per adattarsi alle condizioni del campo e al tipo di campione1.

Per i campioni di acqua di mare, la prima fase di solito richiede la separazione nelle frazioni "disciolte" e "particolato" definite operativamente, normalmente mediante filtrazione (fase 1 del protocollo). La frazione di particolato è ciò che viene trattenuto dal filtro e la dimensione dei pori è importante nella definizione del cut-off2. Spesso, quando campioniamo il particolato, vorremmo mettere in relazione le concentrazioni lipidiche con le concentrazioni di massa totale, nel qual caso un campione separato, più piccolo, (ad esempio, 10 ml) deve essere preso per questo scopo (protocollo passo 1, nota). Per ottenere una determinazione accurata della massa è importante aggiungere il formate di ammonio (35 g/L) alla fine della filtrazione.

Il filtrato di acqua di mare dal campione più grande deve ammontare tra 250 ml e 1 L a seconda del tipo di campione ed è sottoposto all'estrazione liquido-liquido in un imbuto separatore (fase 2 del protocollo). La natura idrofobica dei lipidi significa che possono essere separati da altri composti mediante estrazione in un solvente non polare come il cloroformio. Viene creato un sistema a due strati in cui i lipidi si dividono nello strato organico mentre i componenti solubili in acqua rimangono nello strato acquoso.

Campioni di particolato su un filtro, o campioni biologici vengono estratti con un'estrazione modificata di Folch et al.3, che coinvolge anche il cloroformio (fase del protocollo 3). Ancora una volta, viene creato un sistema organico / acquoso in cui i lipidi si dividono nella fase organica, mentre le molecole solubili in acqua rimangono nella fase acquosa e le proteine vengono precipitate. Infatti, per i solidi, la maggior parte dei laboratori utilizza alcune variazioni della procedura di estrazione Folch et al.3 che coinvolge cloroformio e metanolo. Per i filtri, il primo passo è omogeneizzare in 2 ml di cloroformio e 1 ml di metanolo.

Durante l'estrazione, è necessario prestare attenzione per proteggere i lipidi da modifiche chimiche o enzimatiche, mantenendo campioni e solventi sul ghiaccio per ridurre l'idrolisi del legame estere o l'ossidazione a doppio legame carbonio-carbonio. I tessuti e i lipidi cellulari sono abbastanza ben protetti dagli antiossidanti naturali e dalla compartimentazione4; tuttavia, a seguito dell'omogeneizzazione dei campioni, il contenuto cellulare viene combinato rendendo i lipidi più disposti all'alterazione, chimicamente o enzimaticamente. Alcuni lipidi, come la maggior parte degli steroli, sono molto stabili, mentre altri, come quelli contenenti acidi grassi polinsaturi, sono più suscettibili all'ossidazione chimica. Altri, come gli steroli con doppi legami coniugati, sono inclini all'ossidazione catalizzato dalla luce5. Dopo le estrazioni, i lipidi sono molto più suscettibili all'ossidazione chimica e i campioni devono essere conservati sotto un gas inerte come l'azoto. Un flusso delicato di azoto verrebbe anche usato per concentrare gli estratti.

Dopo la concentrazione, i lipidi sarebbero normalmente quantificati alla rinfusa in quanto sono una componente importante degli ecosistemi marini che forniscono un'alta concentrazione di energia, più del doppio del kJ / g di carboidrati e proteine. Invariabilmente verrebbero poi quantificati come singoli componenti: l'analisi completa dei lipidi comporta generalmente la separazione in categorie più semplici, in base alla loro natura chimica. Pertanto, un'analisi completa comporta la misurazione dei lipidi totali, delle classi lipidiche e dei singoli composti.

Il lipide totale può essere determinato prendendo la somma delle classi lipidiche misurate individualmente separate dalla cromatografia6. Un estratto lipidico marino può contenere più di una dozzina di classi da fonti biogeniche e antropogeniche. L'ampia varietà di strutture lipidiche significa che molte informazioni possono essere ottenute determinando singoli raggruppamenti di strutture. Le classi lipidiche individualmente, o in alcuni gruppi, sono state utilizzate per segnalare la presenza di alcuni tipi di organismi, nonché il loro stato fisiologico e l'attività2. Sono stati anche utilizzati come indicatore delle origini del materiale organico, compresa la materia organica disciolta (DOM) e i contaminanti idrofobici.

Triacilgliceroli, fosfolipidi e steroli sono tra le più importanti classi lipidiche biogeniche. I primi due sono biochimicamente correlati in quanto possiedono una spina dorsale di glicerolo a cui sono esterificati due o tre acidi grassi (Figura 1). I triacilgliceroli, insieme agli esteri di cera, sono sostanze di stoccaggio molto importanti, mentre altre classi lipidiche contenenti acidi grassi come diacilgliceroli, acidi grassi liberi e monoacilgliceroli sono generalmente costituenti minori. Gli acidi grassi liberi sono presenti a concentrazioni più basse negli organismi viventi, in quanto quelli insaturi possono essere tossici7. Anche gli steroli (sia nelle loro forme libere che esterificate) e gli alcoli grassi sono inclusi tra i lipidi meno polari, mentre i glicolipidi e i fosfolipidi sono lipidi polari. I lipidi polari hanno un gruppo idrofilo, che consente la formazione di doppi strati lipidici presenti nelle membrane cellulari. Gli steroli liberi sono anche componenti strutturali della membrana e, se assunti in rapporto ai triacilgliceroli, forniscono una condizione o un indice nutrizionale (TAG: ST) che è stato ampiamente utilizzato8. Se presi in rapporto ai fosfolipidi (ST: PL) possono essere utilizzati per indicare la sensibilità delle piante al sale: valori più alti mantengono l'integrità strutturale e diminuiscono la permeabilità della membrana9. L'inverso di questo rapporto (PL: ST) è stato studiato nei tessuti bivalvi durante l'adattamento della temperatura10.

Le classi lipidiche marine possono essere separate mediante cromatografia a strato sottile (TLC) su barre rivestite in gel di silice (fase 4 del protocollo) e quindi rilevate e quantificate mediante rilevamento della ionizzazione di fiamma (FID) in uno scanner FID automatico. TLC / FID è diventato abitualmente utilizzato per i campioni marini in quanto fornisce rapidamente dati di classe lipidica sinottica da piccoli campioni e, prendendo la somma di tutte le classi, un valore per i lipidi totali. TLC/FID è stato sottoposto a una valutazione di garanzia della qualità (QA) ed è risultato che soddisfa gli standard richiesti per una calibrazione esterna coerente, spazi vuoti bassi e analisi di replica precisa11. I coefficienti di variazione (CV) o le deviazioni standard relative sono intorno al 10% e i dati lipidici totali dello scanner FID sono normalmente circa il 90% di quelli ottenuti con metodi gravimetrici e altri metodi2. La gravimetria dà lipidi totali più elevati probabilmente perché lo scanner FID misura solo composti non volatili e anche come risultato della possibile inclusione di materiale non lipidico nelle misurazioni gravimetriche.

Le informazioni fornite dall'analisi della classe lipidica sono particolarmente utili se combinate con le determinazioni degli acidi grassi come individui, o steroli, o i due in combinazione. Il primo passo verso queste analisi prevede il rilascio di tutti gli acidi grassi componenti insieme agli steroli negli estratti lipidici (fase 5 del protocollo). L'ampia varietà di strutture e funzioni lipidiche significa che hanno visto un ampio uso in studi ecologici e biogeochimici che valutano la salute dell'ecosistema e la misura in cui sono stati influenzati da input antropogenici e terrestri. Sono stati utilizzati per misurare la biosintesi di sostanze di valore dietetico per la fauna marina e per indicare la qualità dei campioni di acqua. La misurazione dei lipidi nei campioni di carote di sedimenti aiuta a mostrare la sensibilità dei sedimenti ai cambiamenti nell'uso del suolo umano vicino al margine terra-mare.

Lo strumento principale per identificare e quantificare i singoli composti lipidici è stato tradizionalmente la gascromatografia (GC) con FID. Prima dell'analisi, tuttavia, questi composti sono resi più volatili dalla derivatizzazione. Gli acidi grassi vengono rilasciati in presenza di un catalizzatore acido (H2SO4) dalle classi lipidiche acilice (Figura 1). In chimica organica, il gruppo acilico (R-C = O) è solitamente derivato da un acido carbossilico (R-COOH). Vengono quindi riesterificati in esteri metilici degli acidi grassi (FAME) che danno migliori separazioni sulle colonne GC (fase del protocollo 5).

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Protocollo

NOTA: Per pulire bicchieri, strumenti e filtri per analisi lipidiche, lavarli 3 volte con metanolo seguito da 3 lavaggi con cloroformio o riscaldarli a 450°C per almeno 8 ore.

1. Procedura di filtrazione per i lipidi disciolti e particolati dell'acqua di mare

NOTA: La particolare frazione di interesse è definita operativamente dalla procedura di filtrazione. In questo caso la dimensione dei pori è di 1,2 μm.

  1. Impostare il collettore di filtrazione senza filtro e risciacquare la configurazione con acqua di mare filtrata.
  2. Utilizzando una pinca pulita, inserire un filtro in fibra di vetro (GF/C) da 47 mm, che è stato lavato, nel sistema di filtrazione pulito.
  3. Prendi il campione e ruota delicatamente per risospendare qualsiasi materiale che potrebbe essersi depositato sul fondo del contenitore di raccolta. Misurare con precisione un volume noto, in questo caso 1 L, e filtrarlo attraverso il filtro.
    NOTA: il volume dipenderà dalla quantità di particolato nel campione: di solito tra 250 ml e 5 L a seconda della stagione e della posizione.
  4. Quando il campione è stato misurato, bagnare delicatamente il filtro con acqua di mare filtrata. Aggiungere lentamente l'intero campione al sistema di filtrazione e risciacquare il cilindro graduato con acqua di mare filtrata per assicurarsi che tutte le particelle vengano aggiunte al filtro. Risciacquare la configurazione con acqua di mare filtrata sui lati per assicurarsi che tutte le particelle vengano risciacquate sul filtro.
    1. Lasciare che tutta l'acqua di mare passi attraverso il filtro ma non lasciare asciugare completamente il filtro in quanto può interrompere le celle sul filtro; rompere l'aspirazione quando l'ultima dell'acqua scompare.
  5. Usando una pinna pulita e una pipetta pulita, piegare il filtro a metà, poi in terzi e poi a metà longitudinalmente per arrotolare il filtro in un tubo. Metterlo in un flaconcino di vetro pulito ed etichettato da 10 ml.
  6. Coprire il filtro con 2 ml di cloroformio. Riempire lo spazio della testa con azoto e sigillare con nastro in PTFE. Mettere in una griglia in un congelatore a -20 °C. I campioni saranno stabili a questa temperatura fino a un anno.
    NOTA: per correlare le concentrazioni lipidiche alle concentrazioni di massa totale, è necessaria anche una misurazione del peso secco. Ciò comporta l'inserimento di un filtro pre-pesato da 24 mm in una configurazione di filtrazione a peso secco, mescolando il campione e prendendo un piccolo sottocampione che viene filtrato sul piccolo filtro. Quando il filtro è quasi asciutto, circa 10 ml di formate di ammonio al 3,5% vengono aggiunti al filtro. Il filtro viene piegato a metà, restituito a una capsula di Petri etichettata e posto in un congelatore.

2. Estrazione liquido-liquida di acqua di mare o campioni liquidi

  1. Preparazione del campione
    1. Misurare un volume noto di filtrato in un cilindro graduato di vetro lipidico pulito. Posizionare questo campione in un imbuto separatore pulito da 1 L. Quindi aggiungere 20 ml di cloroformio al campione e agitare per 2 minuti, sfogando frequentemente.
  2. Rimozione del primo estratto e aggiunta di acido dopo la prima separazione
    1. Avvolgere l'imbuto in un foglio di alluminio e attendere da 5 a 10 minuti per la separazione. Staccare il fondo della lamina per vedere i due strati. Raccogliere lo strato organico inferiore attraverso il rubinetto in un pallone rotondo pulito, facendo attenzione a non includere nessuno degli strati superiori. Tappare il matraccio a fondo tondo sotto azoto e metterlo nel congelatore.
    2. Aggiungere 0,25 ml di H2SO4 concentrato per ogni litro di campione, al campione nell'imbuto separatore e agitare delicatamente l'imbuto.
    3. Aggiungere 10 ml di cloroformio e agitare vigorosamente per 2 minuti mentre si sfiata frequentemente. Lascia che la separazione avvenga.
  3. Seconda e terza separazione
    1. Attendere la separazione e aggiungere lo strato inferiore nel pallone a fondo tondo.
    2. Aggiungere un terzo 10 ml di cloroformio e agitare per 2 minuti, di nuovo sfogando frequentemente. Dopo la separazione, aggiungere lo strato inferiore al pallone a fondo tondo.
    3. Trasferire l'estratto nel matraccio a fondo tondo in un evaporatore rotante, evaporare e trasferirlo in un flaconcino da 2 ml.

3. Protocollo di estrazione per solidi (estrazione folch et al.3 modificata)

  1. Apparecchio
    NOTA: la configurazione di estrazione richiede un contenitore isolato pieno di ghiaccio. I solventi includono metanolo, acqua estratta dal cloroformio e cloroformio 2:1:metanolo. Tutti i solventi devono essere posti sul ghiaccio in modo che siano freddi al momento dell'inizio delle estrazioni. I campioni vanno anche sul ghiaccio, in modo che tutto rimanga freddo.
    1. Risciacquare tutti i tubi e i tappi rivestiti in PTFE 3 volte con metanolo e poi 3 volte con cloroformio. Per ogni estrazione sono necessari un tubo centrifuga e un flaconcino da 15 ml con tappo.
    2. Posizionare il campione in una provetta di centrifuga contenente 2 ml di cloroformio. La dimensione del campione dipende dalla quantità di lipidi presenti, circa 5-10 mg di lipidi preferiti.
  2. Rettifica ed estrazione
    1. Aggiungere circa 1 mL di metanolo ghiacciato e macinare rapidamente il campione in una polpa con un omogeneizzatore pulito o un'asta in PTFE/metallo.
    2. Lavare di nuovo l'asta nel tubo con circa 1 mL di cloroformio 2:1 ghiacciato: metanolo e poi con 1/2 ml di acqua estratta dal cloroformio ghiacciato. Se necessario, utilizzare un set pulito di pinne di forza per forzare le particelle nel flaconcino prima del lavaggio. Tappare il tubo e sonicare la miscela per 4 minuti in un bagno ad ultrasuoni (35 - 42 kHz).
  3. Doppio pipettaggio: Centrifugare il campione per 2 minuti a 1800 × g. Raccogliere l'intero strato organico (strato inferiore) utilizzando la tecnica del doppio pipettaggio in cui una pipetta da 5 3/4 "con il bulbo liberamente acceso viene delicatamente spinta attraverso i due strati, mentre si spreme il bulbo, causando l'uscita di bolle.
    1. Quando viene raggiunto il fondo del secondo strato, utilizzare il pollice per rimuovere la lampadina senza disegnare lo strato organico nella pipetta. Posizionare una pipetta da 9" all'interno di quella da 5 3/4" e rimuovere lo strato inferiore attraverso la pipetta da 5 3/4".
    2. Mettere l'estratto in un flaconcino pulito. Continua a togliere lo strato inferiore fino a quando non viene rimosso tutto.
  4. Pipette di lavaggio: Risciacquare la pipetta da 9" nel flaconcino contenente lo strato organico utilizzando 1,5 mL di cloroformio ghiacciato per lavare l'esterno della pipetta e 1,5 ml per lavare l'interno. Ruotare delicatamente la pipetta durante il lavaggio e assicurarsi che tutto il cloroformio scega lungo la pipetta in flaconcino.
    1. Risciacquare la pipetta da 5 3/4" nel tubo contenente lo strato acquoso nello stesso modo.
  5. Sonicare e centrifugare i campioni e doppia pipetta quando separati, utilizzando ogni volta nuove pipette. Ripeti almeno tre volte e raggruppati tutti gli strati organici. Dopo aver rimosso lo strato organico per la terza volta, lavare entrambe le pipette nel flaconcino contenente lo strato organico.
  6. Utilizzando un delicato flusso di azoto, concentrare fino al volume, quindi sigillare con nastro in PTFE e conservare in un congelatore.

4. Sviluppo di sistemi e passaggi per la separazione TLC delle barre delle classi lipidiche marine

  1. Preparazione delle aste per TLC
    1. Scansione a vuoto delle aste nello scanner FID automatico tre volte
    2. Individuazione di un campione: Applicare campioni e standard con una siringa alle aste in posizione pari o appena al di sotto dell'origine. Erogare 0,5 μL e toccare la goccia sull'asta. Lasciare asciugare prima di posizionare la goccia successiva nello stesso punto. Individua tutti i campioni in una linea su aste.
    3. Messa a fuoco in acetone: Mettere a fuoco i campioni due volte (tre volte se i campioni sono molto concentrati) in 70 ml di acetone. Guarda il fronte del solvente mentre si arrampica sull'asta fino a quando il fondo del punto si fonde con la parte superiore. Rimuovere le aste, asciugarle per circa 5 s, quindi ripetere la procedura per produrre una stretta fascia di materiale lipidico vicino al fondo dell'asta.
    4. Asciugare e condizionare le aste in una camera di umidità costante per 5 minuti. Una camera di umidità costante è un essiccatore con una soluzione satura di cloruro di calcio sotto la piastra.
  2. Sequenza che porta al primo cromatogramma (da idrocarburi a chetoni)
    1. Primo sistema di sviluppo: Il primo sistema di sviluppo è l'acido esano:etere etilico:formico, 98.95:1:0.05. Utilizzare una siringa per aggiungere l'acido formico, ma prima risciacquare la siringa 3× con acido formico. Risciacquare l'acido formico dalla siringa subito dopo con cloroformio. Utilizzare 30 ml della miscela per bagnare la carta e risciacquare il serbatoio. Scartare la soluzione di risciacquo e aggiungere i restanti 70 ml al serbatoio.
      1. Prendi i rack e abbassali delicatamente nel serbatoio. Guardare fino a quando il fronte del solvente raggiunge i punti del campione, quindi avviare il timer. Dopo 25 minuti, rimuovere le aste dalla camera di sviluppo, asciugare nella camera di umidità costante per 5 minuti e riqualificare nella stessa soluzione per altri 20 minuti.
    2. Asciugare le aste per 5 minuti nello scanner FID automatico e quindi eseguire la scansione fino al punto più basso dietro il picco chetonico utilizzando una scansione PPS di 25.
  3. Sequenza che porta al secondo cromatogramma (da triacilglicerolo a diacilglicerolo):
    1. Condizionare le aste per 5 minuti nella camera di umidità costante.
    2. Secondo sistema di sviluppo: Il secondo sistema di sviluppo è l'acido esano:etere etilico:formico, 79:20:1. Aggiungere ~ 30 ml al serbatoio di sviluppo per bagnare la carta e risciacquare il serbatoio. Quindi scartare e sviluppare le aste per 40 minuti nei restanti 70 ml. Per la migliore separazione tra i picchi TAG (saturi) e TAG (polinsaturi) utilizzare una miscela di 79.9:20:0.1, ma per la separazione dei picchi ST e DAG utilizzare una miscela di 79:20:1.
    3. Asciugare e scansionare fino al punto più basso dietro il picco di diacilglicerolo in una seconda scansione parziale utilizzando una scansione PPS 11.
  4. Sequenza che porta al terzo cromatogramma (lipide polare acetone-mobile e fosfolipide)
    1. Condizionare le aste per 5 minuti nella camera di umidità costante.
    2. Sviluppare le aste due volte per 15 minuti in 70 ml di acetone. Tra uno sviluppo e l'altro asciugare all'aria le aste per circa 30 secondi.
    3. Condizionare le aste per 5 minuti nella camera di umidità costante.
    4. Terzo sistema di sviluppo: Il terzo sistema di sviluppo è una miscela di cloroformio, metanolo e acqua estratta dal cloroformio, 50:40:10. Sviluppare le aste due volte per 10 minuti in 70 ml della miscela. Tra uno sviluppo e l'altro, asciugare all'aria le aste per circa 30 secondi.
    5. Asciugare e scansionare l'intera lunghezza delle aste.

5. Derivatizzazione FAME con H2SO4 in MeOH

  1. Produzione del reagente Hilditch
    1. Preparazione del metanolo: Mettere 100 ml di MeOH in un matraccio volumetrico pulito e quindi cospargere delicatamente di NaSO4 anidro fino a coprire il fondo del matraccio. Una volta coperto, invertire due volte in modo che l'acqua nel metanolo venga assorbita dal NaSO4. Dopo aver invertito e agitato, lasciare riposare per almeno 5 minuti.
    2. Aggiunta dell'acido: Decantare lentamente il metanolo in un barattolo di vetro (ormai il NaSO4 è un nodulo duro sul fondo del pallone) e viene aggiunto l'H2SO4. Aggiungere lentamente 1,5 ml di acido solforico al metanolo usando una pipetta. Aggiungere qualche goccia alla volta e una volta aggiunto tutto l'acido, tappare e mescolare delicatamente per mescolare. La soluzione è ora pronta per essere utilizzata per i derivati, ma deve essere costituita su base settimanale.
  2. Fare i derivati
    1. Trasferire circa 200 μg di lipidi da una fiala di estratto che ha portato il volume a una quantità nota, in un flaconcino pulito da 15 ml ed evaporare sotto azoto a secco. La quantità rimossa sarà determinata dalla concentrazione del campione da TLC/FID. Utilizzare una pipetta pulita per rimuovere il campione.
    2. Quando il campione si è asciugato, aggiungere 1,5 mL di diclorometano e 3 mL del reagente Hilditch appena prodotto.
    3. Vortice del campione e sonicarlo in un bagno ad ultrasuoni per 4 minuti per rimuovere i lipidi che hanno aderito alla fiala di vetro. Riempire il flaconcino con azoto, tappo e sigillarlo con nastro in PTFE e riscaldare a 100°C per 1 ora.
  3. Fermare la reazione
    1. Lasciare raffreddare completamente i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti dopo la rimozione dal forno, quindi aprire accuratamente i flaconcini.
    2. Aggiungere lentamente circa 0,5 mL di soluzione satura di bicarbonato di sodio (9 g/100 mL di acqua estratta dal cloroformio), quindi 1,5 mL di esano. Agitare o vorticosamente la fiala, quindi lasciare riposare in modo che si separi in 2 strati.
  4. Collezionare i FAME
    1. Rimozione dello strato superiore: Una volta che la derivatizzazione è stata interrotta e vi è una chiara separazione, rimuovere la fase organica superiore e porre in un flaconcino lipidico pulito da 2 ml.
    2. Evaporare il solvente nel flaconcino da 2 mL a secco e riempirlo con esano a circa 0,5 mL.
    3. Riempire lo spazio della testa della fiala con azoto, tappare e sigillare la fiala con nastro in PTFE, sonicare per altri 4 minuti per sospendere di ripiendere gli acidi grassi, quindi è pronto per andare al GC.
      NOTA: Se sono necessarie concentrazioni di acidi grassi, lo strato acquoso deve essere lavato tre volte con esano e tutti gli strati organici raggruppati nel flaconcino da 2 ml. Ciò comporta l'aggiunta di 2 ml di esano, la vorticosità del campione, la centrifugazione e la rimozione dello strato organico, il tutto ripetuto 3 volte.

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Risultati

Essendo il settore della produzione alimentare in più rapida crescita, l'acquacoltura si sta evolvendo in termini di innovazioni tecnologiche e adattamenti per soddisfare le mutevoli esigenze. Uno di questi è ridurre la dipendenza dalla farina di pesce e dall'olio di pesce di origine selvatica, che forniscono ingredienti per mangimi per molte specie di acquacoltura. Gli oli vegetali terrestri sono stati studiati come sostituti sostenibili ed economici dell'olio di pesce negli aquafeed e il fegato è un tessuto bersaglio p...

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Discussione

La velocità con cui il sistema TLC-FID fornisce informazioni sulla classe lipidica sinottica da piccoli campioni rende TLC-FID uno strumento in grado di selezionare campioni marini prima di intraprendere procedure analitiche più coinvolte. Tali analisi di solito richiedono il rilascio di composti componenti da estratti lipidici e la derivatizzazione per aumentare la volatilità nel caso della gascromatografia. TLC-FID combinato con GC-FID è stato trovato per essere una potente combinazione per estratti di frutti di mare e...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) numero di sovvenzioni 105379 a C.C. Parrish. La rete Core Research Equipment & Instrument Training (CREAIT) della Memorial University ha contribuito a finanziare questa pubblicazione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fiale da 15 mlVWR66009-560
1-esadecanoloSigma258741-1G
1-Monopalmitoil-rac-gliceroloSigmaM1640-1g
Fiale da 2 mlVWR46610-722
Filtri in fibra di vetro da 25 mmFisher09 874 32A
Pipetta da 2 ml VWR82024-554
Filtri in fibra di vetro da 47 mmFisher09 874 32
5 pipette da 3/4"Fisher1367820A
Pipette da 9"Fisher1367820C
AcetoneVWRCAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890Agilent
Calcium Chloride ANHS 500gmVWRCACX0160-1
Tappi per fiale da 2 mlVWR46610-712
cloroformioVWRCACX1054-1
Colesteril palmitatoSigmaC6072-1G
Chromarod S5Shell USA3252
DiclorometanoVWRCADX0831-1
DL-a-fosfatidilcolina, dipalmotoilSigmaP5911-1g
Etere etilico, grado ACS anidr 4LVWRCAEX0190-4
Gliceril tripalmitatoSigmaT5888-100MG
Hamilton Siringa 702SNR 25µ lSigma58381
HeliumAir LiquideA0492781
HexaneVWRCAHX0296-1
Regolatore di idrogenoVWR55850-484
Iatroscan MK6Shell USA
KimwipesFisher066662
Medical AirAir LiquideA0464563
Guanti in nitrilemedi Fisher191301597C
Guanti in nitrile LVWRCA82013-782
AzotoAria LiquideA0464775
Regolatore di azotoVWR55850-474
NonadecaneSigma74158-1G
Acido palmiticoSigmaP0500-10G
Dosatore ripetutoSigma20943
Bicarbonato di sodio 1kgVWRCA97062-460
Solfato di sodio Anhy ACS 500grVWRCA71008-804
Acido solforicoVWRCASX1244-5
Nastro in teflonFisher14610120
tissue master 125 115V con omogeneizzatore da 7 mmOMNI InternationalTM125-115
Serbatoio di sviluppo TLCShell USA3201
UHP idrogenoAir LiquideA0492788
VWR solvente repippetterVWR82017-766
Timer VWR LED lampeggiante 2 canaliVWR89140-196
Zebron ZB-Wax GC colonnaPhenomenex7HM-G013-11

Riferimenti

  1. Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
  2. Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045(2013).
  3. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  4. Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
  5. Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
  6. Parrish, C. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. Arts, M. T., ainman, B. C. , Springer-Verlag. New York. 4-20 (1999).
  7. Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
  8. Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
  9. Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49(2016).
  10. Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
  11. Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
  12. Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
  13. Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
  14. Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024(2013).
  15. Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178(2017).
  16. Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
  17. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
  18. Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
  19. Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
  20. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
  21. Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
  22. Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
  23. Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645(2017).

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