Un approccio microfluidico per l'indagine funzionale delle oscillazioni di segnalazione che governano la somitogenesi

Sommario

Viene fornito un protocollo per la coltura e la manipolazione del tessuto embrionale di topo su un chip microfluidico. Applicando impulsi di modulatori di percorso, questo sistema può essere utilizzato per controllare esternamente le oscillazioni di segnalazione per lo studio funzionale della somitogenesi del topo.

Abstract

La segmentazione periodica del mesoderma presomitico di un embrione di topo in via di sviluppo è controllata da una rete di vie di segnalazione. Si ritiene che le oscillazioni e i gradienti di segnalazione controllino rispettivamente la temporizzazione e la spaziatura della formazione dei segmenti. Mentre le vie di segnalazione coinvolte sono state ampiamente studiate negli ultimi decenni, sono mancate prove dirette della funzione delle oscillazioni di segnalazione nel controllo della somitogenesi. Per consentire l'indagine funzionale della dinamica di segnalazione, la microfluidica è uno strumento precedentemente stabilito per la modulazione sottile di queste dinamiche. Con questo approccio di trascinamento basato sulla microfluidica, le oscillazioni di segnalazione endogena sono sincronizzate da impulsi di modulatori di percorso. Ciò consente la modulazione, ad esempio, del periodo di oscillazione o della relazione di fase tra due vie oscillanti. Inoltre, gradienti spaziali di modulatori di pathway possono essere stabiliti lungo il tessuto per studiare come cambiamenti specifici nei gradienti di segnalazione influenzano la somitogenesi.

Il presente protocollo ha lo scopo di aiutare a stabilire approcci microfluidici per gli utenti per la prima volta della microfluidica. Vengono descritti i principi di base e le attrezzature necessarie per impostare un sistema microfluidico e viene fornito un progetto di chip, con il quale uno stampo per la generazione di chip può essere comodamente preparato utilizzando una stampante 3D. Infine, viene discusso come coltivare il tessuto primario del topo su un chip microfluidico e come intrappolare le oscillazioni di segnalazione agli impulsi esterni dei modulatori di percorso.

Questo sistema microfluidico può anche essere adattato per ospitare altri sistemi modello in vivo e in vitro come gastruloidi e organoidi per l'indagine funzionale delle dinamiche di segnalazione e dei gradienti morfogeni in altri contesti.

Introduzione

Lo sviluppo è controllato dalla comunicazione intercellulare attraverso vie di segnalazione. Esiste solo un numero limitato di vie di segnalazione che orchestrano la complessa formazione dei tessuti e la corretta differenziazione cellulare nello spazio e nel tempo. Per regolare questa moltitudine di processi, le informazioni possono essere codificate nella dinamica di una via di segnalazione, il cambiamento di una via nel tempo, come la frequenza o la durata di un ^segnale1,2.

Durante la somitogenesi, il tessuto somitico viene periodicamente segmentato dal mesoderma presomitico (PSM)³. Il PSM è organizzato spazialmente per gradienti di Wnt, fibroblast growth factor (FGF) e segnalazione dell'acido retinoico. Nel PSM anteriore sul fronte di determinazione, dove i segnali Wnt e FGF sono bassi, le cellule sono innescate per la differenziazione in somiti. La differenziazione si verifica quando un'onda di attivazione trascrizionale raggiunge questo fronte di determinazione. All'interno del PSM, Wnt, FGF e Notch oscillano i segnali. Le cellule vicine oscillano leggermente fuori fase, il che si traduce in onde di attivazione trascrizionale oscillatoria a valle delle vie Wnt, FGF e Notch che viaggiano dal PSM posteriore a quello anteriore. Negli embrioni di topo, un'onda trascrizionale raggiunge il fronte di determinazione circa ogni 2 ore e avvia la formazione di somiti. Studiare la somitogenesi perturbando o attivando le vie di segnalazione può illustrare l'importanza di queste vie4,5,6,7,8,9. Tuttavia, per essere in grado di indagare la funzione delle dinamiche di segnalazione nel controllo del comportamento cellulare, è essenziale modulare sottilmente le vie di segnalazione invece di attivarle o inibirle in modo permanente.

Per modulare temporalmente l'attività della via di segnalazione all'interno dell'embrione di topo segmentante, Sonnen et al. hanno sviluppato un sistema microfluidico10. Questo sistema consente lo stretto controllo dei flussi di fluido all'interno dei microcanali di un chip che contiene il campione ^biologico11. Per studiare l'importanza della dinamica di segnalazione per una corretta segmentazione del PSM, questa configurazione microfluidica viene utilizzata per modulare la dinamica di segnalazione dell'orologio di segmentazione del mouse ex vivo. Pulsando sequenzialmente attivatori o inibitori della via nella camera di coltura, si ottiene il controllo esterno della dinamica della segnalazione Wnt, FGF e ^Notch10. Ad esempio, è possibile modificare il periodo delle singole vie e la relazione di fase tra più vie di segnalazione oscillatoria. Utilizzando l'imaging simultaneo in tempo reale di reporter di segnalazione dinamica, è possibile analizzare l'effetto del trascinamento sui percorsi stessi, sulla differenziazione e sulla formazione di somiti. Utilizzando questo livello di controllo sulle dinamiche di segnalazione, è stata evidenziata l'importanza della relazione di fase tra le vie di segnalazione Wnt e Notch durante la somitogenesi10.

I design personalizzati dei chip consentono una miriade di opzioni per le perturbazioni spaziotemporali all'interno dell'ambiente locale, ad esempio formazione di gradienti stabili12,13,14,15, attivazione/inibizione pulsatile10,16,17,18 o perturbazioni ^{localizzate19,20} . La microfluidica può anche consentire una lettura più riproducibile e una maggiore produttività grazie all'automazione della movimentazione sperimentale21,22,23. Il presente protocollo ha lo scopo di portare la microfluidica e il trascinamento delle oscillazioni di segnalazione endogena all'interno dei tessuti in ogni laboratorio standard di scienze della vita. Anche in assenza di apparecchiature sofisticate per la generazione di chip, come camere bianche e apparecchiature per la litografia soft, i chip microfluidici possono essere prodotti e utilizzati per affrontare questioni biologiche. Gli stampi possono essere progettati utilizzando software CAD (Computer-Aided Design) liberamente disponibile. Uno stampo per la generazione di chip microfluidici, solitamente costituito da polidimetilsilossano (PDMS), può essere stampato con una stampante 3D o essere ordinato da aziende di stampa. In questo modo, i chip microfluidici possono essere prodotti entro un giorno senza la necessità di costose ^{apparecchiature24}. Qui viene fornito un progetto di chip, con il quale è possibile stampare uno stampo per il trascinamento dell'orologio di segmentazione del mouse in colture bidimensionali (2D) ex ^vivo25 con una stampante 3D.

Le colture su chip e le perturbazioni precise, rese possibili dalla microfluidica, hanno un potenziale eccezionale nello svelare i meccanismi molecolari di come le vie di segnalazione controllano il comportamento multicellulare. La dinamica di segnalazione e i gradienti morfogeni sono necessari per molti processi in fase di sviluppo. In precedenza, i laboratori avevano coltivato cellule, tessuti e organismi interi in chip microfluidici e protocolli per la perturbazione spaziotemporale di colture cellulari principalmente 2D sono forniti altrove12,26,27,28,29. L'applicazione della microfluidica per modulare gli ambienti locali nei sistemi multicellulari apre nuove prospettive per perturbazioni spaziotemporali ad alto rendimento e precise. Il campo della microfluidica ha ora raggiunto un punto in cui è diventato uno strumento non specialistico, economico e facilmente applicabile per i biologi dello sviluppo.

Qui viene fornito un protocollo per il trascinamento dell'orologio di segmentazione del mouse agli impulsi di un inibitore della segnalazione Notch. Tale esperimento consiste nelle seguenti fasi: (1) generazione di chip microfluidici, (2) preparazione di tubi e rivestimento del chip e (3) l'esperimento microfluidico stesso (Figura 1A). La ricerca che coinvolge sistemi modello di vertebrati richiede la previa approvazione etica da parte della commissione competente.

Protocollo

La ricerca qui presentata è stata approvata dal comitato etico ^EMBL10 e dal comitato olandese per la ricerca sugli animali (dierenexperimentencommissie, DEC) e segue le linee guida Hubrecht per la cura degli animali.

Indossare guanti mentre si lavora con PDMS liquido. Coprire superfici e attrezzature. Rimuovere immediatamente eventuali fuoriuscite, poiché la pulizia diventa difficile una volta indurita.

1. Generazione del chip

NOTA: I chip microfluidici sono generati dalla fusione di PDMS (polidimetilsilossano) in uno stampo. Gli stampi possono essere progettati utilizzando software CAD (ad esempio, uFlow o ^3DμF30). Un archivio di progetti gratuiti è fornito dal MIT (Metafluidics.org). Gli stampi vengono stampati con una stampante 3D o possono essere generati mediante litografia morbida utilizzando una fotomaschera che contiene il design desiderato (per ulteriori informazioni vedere, ad esempio, Qin et al., ²⁰¹⁰³¹). Qui, viene fornito un design per uno stampo che può essere stampato con una stampante 3D per la coltura su chip del tessuto embrionale di topo (Figura 1B, C, File supplementari 1 e 2). Per consentire la stampa con stampanti 3D a bassa risoluzione, il design è stato modificato rispetto a quello precedentemente ^pubblicato10. Viene fornito uno stampo senza trappole a bolle d'aria e uno con trappole a bolle d'aria (file supplementari 1 e 2, rispettivamente). Poiché la procedura di stampa dipende dalla stampante disponibile, i dettagli per la stampa non verranno descritti. Tuttavia, è necessario assicurarsi che tutta la resina non polimerizzata sia completamente rimossa. Spesso è necessario eseguire un lavaggio extra con solventi per rimuovere la resina non polimerizzata dai piccoli fori < 200 μm all'interno della camera microfluidica. Questi fori formeranno pilastri PDMS per intrappolare il tessuto embrionale all'interno del chip durante l'esperimento. PDMS è generalmente utilizzato per la microfluidica, in quanto è economico, biocompatibile e trasparente e ha una bassa autofluorescenza. Dopo la polimerizzazione, il chip PDMS viene tagliato fuori dallo stampo e incollato su una diapositiva di vetro. Il trattamento al plasma sia del vetro che del chip PDMS attiva le superfici e consente la formazione di legami covalenti, quando messi a contatto.

1. Preparare la quantità richiesta di PDMS mescolando il monomero con il catalizzatore in un rapporto 9:1 (w:w) per indurre la polimerizzazione. Usa strumenti usa e getta per mescolare, come bicchieri di plastica e forchette. Assicurarsi che la miscelazione sia correttamente raggiunta.
2. Posizionare la miscela PDMS in un essiccatore e applicare il vuoto per circa 30 minuti per rimuovere l'aria dalla miscela PDMS. A causa del vuoto all'interno dell'essiccatore, l'aria verrà rimossa dalla miscela PDMS.
   NOTA: Coprire l'interno dell'essiccatore con fazzoletti nel caso in cui il PDMS scorra.
3. Versare la miscela PDMS nello stampo del chip (è sufficiente uno strato PDMS di circa 3-5 mm).
4. Riposizionare lo stampo riempito con PDMS nell'essiccatore e applicare il vuoto per rimuovere eventuali bolle rimanenti. Assicurarsi che l'aria venga rimossa da tutte le strutture più piccole dello stampo.
5. Polimerizzare lo stampo mettendolo in un forno a 65 °C (o inferiore a seconda del materiale dello stampo) durante la notte. Tagliare il chip dallo stampo usando un bisturi. Tagliare il PDMS temprato dallo stampo con spazio sufficiente (1-2 cm) attorno al design per consentire un successivo incollaggio. Assicurati di tagliare completamente il PDMS per evitare la rottura del chip quando lo estrai. Sollevare il chip PDMS con attenzione, prima con l'estremità smussata del bisturi e, quando possibile, con le mani.
6. Fori di ingresso e di uscita, a partire dall'interno della camera microfluidica utilizzando un punzone per biopsia da 1 mm.
7. Pulire brevemente il chip PDMS con aria compressa e nastro adesivo adesivo su entrambi i lati per rimuovere eventuali frammenti di PDMS e polvere bloccati e mantenerlo pulito fino a nuovo utilizzo.
   NOTA: Il chip può essere conservato in questo modo fino a un ulteriore utilizzo.
8. Pulire la slitta di vetro con aria compressa. Fai attenzione che non si rompa. Rimuovere il nastro adesivo dal chip PDMS.
9. Legare il chip al vetrino usando un forno al plasma. Le seguenti istruzioni sono ottimizzate per il plasma d'aria.
   NOTA: Consultare il manuale del forno al plasma del laboratorio e ottimizzare la procedura per l'esperimento specifico.
   1. Posizionare il chip e il vetrino nel forno al plasma con i lati da incollare rivolti verso l'alto.
   2. Posizionare il coperchio sul forno al plasma e tenerlo in posizione durante l'applicazione del vuoto e attendere che il vuoto si sia stabilito.
   3. Accendere il gas premendo il pulsante Gas e attendere circa 1 minuto (la pressione dovrebbe essere di circa 0,37 mbar).
   4. Generare plasma premendo Generator (Potenza: 9.0, Tempo: 1 min).
   5. Al termine, spegnere la pompa e il gas; ventilare e aprire la porta.
   6. Legare il chip al vetro posizionando le superfici attivate l'una sull'altra e applicando la pressione in modo uniforme. Fare attenzione che il vetro non si rompa.
      NOTA: è possibile eseguire un test dell'acqua per confermare che il trattamento al plasma ha funzionato. Posizionare una goccia d'acqua sulla superficie del vetro. Se il trattamento al plasma ha funzionato, l'acqua dovrebbe diffondersi immediatamente invece di formare una goccia.
10. Mettere il truciolo incollato in forno a 65 °C per 5 minuti.
11. Sigillare il lato esposto del chip con nastro adesivo per evitare che la polvere penetri nelle prese.
    NOTA: Il chip può essere conservato fino all'uso. Le aperture devono essere chiuse con nastro adesivo fino ad allora.

2. Preparazione dell'esperimento di microfluidica

NOTA: per eseguire l'esperimento di microfluidica sono necessarie le seguenti fasi preparatorie: in primo luogo, quando si esegue l'esperimento di microfluidica, viene creato un flusso di fluido dalle entrate alle uscite. Eventuali fori nel chip funzioneranno come uscite a causa dell'accumulo di pressione dalle prese. Pertanto, tutti i fori che non vengono utilizzati devono essere chiusi; ad esempio, fori che vengono utilizzati per caricare il tessuto sul chip. Se questi non sono chiusi, il tessuto potrebbe fuoriuscire con il fluido. Per chiudere questi fori, vengono utilizzati tubi riempiti di PDMS. Il tubo riempito con PDMS può essere conservato a tempo indeterminato e, pertanto, non dovrà essere preparato separatamente per ogni esperimento di microfluidica, ma può essere realizzato in lotti più grandi. In secondo luogo, prima dell'inizio dell'esperimento microfluidico, i tubi, i tubi riempiti con PDMS e il chip, necessario per l'esperimento, vengono preparati e sterilizzati ai raggi UV. Infine, il chip deve essere rivestito con fibronectina, in modo che il tessuto embrionale possa attaccarsi al ^vetro25.

1. Realizzazione di tubi riempiti di PDMS.
   1. Prendi ±1 m di tubo. Più tubi possono essere riempiti con PDMS prendendo più pezzi di tubo.
   2. Preparare la quantità richiesta di PDMS mescolando il monomero con il catalizzatore in un rapporto 9:1 (w:w) per indurre la polimerizzazione.
      NOTA: utilizzare strumenti usa e getta per mescolare, come bicchieri di plastica e forchette. Mescolare correttamente.
   3. Posizionare la miscela PDMS in un essiccatore e applicare il vuoto per circa 30 minuti per rimuovere l'aria dalla miscela PDMS.
      NOTA: Coprire l'interno dell'essiccatore con fazzoletti nel caso in cui il PDMS scorra.
   4. Riempire una siringa da 3 ml con PDMS. Riempire con attenzione per evitare la formazione di bolle d'aria nella miscela.
   5. Utilizzare una pinza per inserire la punta di un ago da 22 G nel tubo.
      NOTA: Fare attenzione a non perforare il tubo o le dita con l'ago.
   6. Attaccare il tubo alla siringa riempita di PDMS tramite l'ago. Utilizzare la pompa a siringa per riempire il tubo, con una portata di circa 500 μL/h. Fare attenzione a non applicare una pressione troppo elevata per evitare la rottura della pompa.
   7. Una volta che il tubo è interamente riempito con PDMS, metterlo in un piatto di 15 cm e polimerizzare a temperatura ambiente (almeno durante la notte).
2. Preparare il tubo e il chip per l'esperimento.
   NOTA: per l'esperimento è necessario il seguente tubo: in primo luogo, circa 50 cm di tubo per uscita e in secondo luogo, circa 2-3 m per ingresso (la dimensione esatta dipende dall'organizzazione spaziale delle pompe, dell'incubatore o del microscopio utilizzati in seguito). Il tubo di ingresso deve essere lungo per consentire al terreno di coltura di equilibrarsi con _CO2 per la coltura embrionale durante l'esperimento.
   1. Tagliare il tubo con un angolo di 45° in modo da creare estremità appuntite; questo renderà più facile inserire il tubo nei fori del chip. Attaccare un ago a ciascuno dei tubi di ingresso. Vedere il passaggio 2.1.5.
   2. Tagliare tubi riempiti di PDMS in tappi ±1 cm. Tagliare con un angolo di 45° in modo da creare estremità appuntite; questo renderà più facile inserire il tubo nei fori del chip. Sono necessari abbastanza tappi per riempire ogni foro che non è collegato a nessun tubo.
   3. Rimuovere il nastro adesivo dal chip.
   4. Posizionare tutto il tubo con gli aghi attaccati, il chip e i tappi in un piatto e sterilizzare esponendo alla luce UV per ±15 minuti. È possibile utilizzare qualsiasi cappa di coltura cellulare con possibilità di sterilizzazione UV.
3. Rivestimento di chip con fibronectina.
   NOTA: Per la coltura di colture 2D ex vivo di PSM posteriore, rivestire il chip con fibronectina.
   1. Posizionare il chip in un becher contenente PBS + 1% Penicillina / Streptomicina a temperatura ambiente. Assicurarsi che il chip sia completamente coperto da PBS. Lavare il chip con PBS per rimuovere l'aria con una pipetta P200.
      NOTA: Tutta l'ulteriore manipolazione del chip verrà eseguita in questo becher fino all'inizio dell'esperimento per impedire l'ingresso di aria nel chip. Fare attenzione a non rompere la diapositiva di vetro del chip.
   2. Preparare 2 ml di fibronectina 1:20 in PBS e riempire un becher.
   3. Caricare una siringa da 3 ml per ogni camera del chip. Con una pinza, inserire un ago da 22 G nel tubo di uscita. Attaccare l'ago alla siringa contenente fibronectina.
   4. Collegare la siringa alla pompa della siringa. Lavare il tubo, fino a quando non c'è aria rimasta nel tubo.
   5. Collegare il tubo di uscita all'uscita del chip. Assicurati di spingere il tubo fino in fondo. Impostare una portata bassa per rivestire il chip. Tutte le altre aperture possono rimanere aperte. Lasciare funzionare la pompa della siringa per almeno 2 ore, può funzionare anche durante la notte.
   6. Arrestare la pompa. Tagliare il tubo subito dopo l'ago. Il tubo rimanente servirà come uscita durante l'esperimento successivo.

3. Esperimento di microfluidica

NOTA: Qui viene presentato un protocollo per il trascinamento dell'orologio di segmentazione del mouse in colture 2D ex vivo applicando impulsi dell'inibitore di segnalazione Notch DAPT. L'applicazione di impulsi con un periodo di 130 minuti, vicino al periodo naturale dell'orologio di segmentazione del mouse (137 ^min25), consente un trascinamento efficiente. Vengono applicati impulsi di 100 min di mezzo e 30 min di 2 μM DAPT (Figura 2A). La presenza di farmaco all'interno del chip viene monitorata utilizzando un colorante fluorescente. Gli spettri di eccitazione ed emissione di questo colorante e del segnalatore di segnalazione fluorescente devono essere abbastanza diversi da prevenire il sanguinamento durante l'imaging in tempo reale a fluorescenza. Quando le proteine fluorescenti gialle vengono utilizzate come reporter di segnalazione, come il reporter di segnalazione Notch ^LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe), il colorante, Cascade Blue, può essere applicato. Per identificare altre possibili combinazioni di colorante fluorescente e reporter, è possibile utilizzare un visualizzatore di spettri liberamente disponibile. L'effetto del trascinamento può essere rilevato dall'imaging in tempo reale dei segnalatori di segnalazione dinamica5,10,32. Ogni chip ha due camere di incubazione. Ciò consente il confronto diretto degli impulsi dei farmaci (DAPT) per controllare gli impulsi (DMSO).

1. Fare media e degas.
   1. Il giorno dell'esperimento, preparare 50 ml di terreno di coltura (DMEM-F12 integrato con 0,5 mM di glucosio, 2 mM di glutammina e 1% di BSA, per ulteriori informazioni sulla coltura del bocciolo di coda del topo ^vedi25).
   2. Preparare le siringhe riempite con il mezzo per l'esperimento. Preparare il terreno di coltura nei becher: per intrappolare le oscillazioni di segnalazione Notch, preparare 6 mL di terreno con 1,2 μL di DMSO + 10 μM Cascade Blue; 6 mL di terreno di coltura con 2 μM DAPT + 10 μM Cascade Blue; due tubi con 6 ml di media ciascuno. Utilizzare almeno 6 ml di mezzo per siringa. Caricare le siringhe con il mezzo. Assicurarsi di etichettare le siringhe contenenti farmaco e DMSO.
   3. Degasare il chip all'interno di PBS e le siringhe contenenti il mezzo in un essiccatore. Posizionare le siringhe in un becher con la punta rivolta verso l'alto, in modo che l'aria possa fuoriuscire nella parte superiore. Potrebbe accadere che il chip galleggi ed è ancora pieno di bolle. Questi saranno rimossi successivamente.
   4. Prova a scovare / aspirare la maggior parte delle bolle d'aria dal chip usando una pipetta P200. Se rimane un po ' d'aria, questo verrà rimosso durante il seguente esperimento.
   5. Installare le siringhe nelle pompe e collegare i tubi di ingresso alle siringhe. Per intrappolare la segnalazione Notch, utilizzare due pompe a siringa, una che trasporta le siringhe medie, una che trasporta le siringhe del farmaco / DMSO. Lasciare che questo funzioni a una portata più elevata (0,5 ml / h) fino all'inizio dell'esperimento per rimuovere le bolle d'aria dal tubo. Fare attenzione a impostare correttamente i dettagli della siringa (diametro) nella pompa.
2. Caricamento del tessuto sul chip.
   1. Sezionare il tessuto embrionale di topo. Seziona la punta più posteriore della coda (bocciolo di coda). Posizionare il tessuto sezionato in terreno di coltura + 25 μM HEPES.
   2. Lavare il chip con terreno di coltura + 25 μM HEPES utilizzando un P200 per rimuovere PBS.
   3. Caricare il tissue nel chip utilizzando una pipetta P200 (Figura 1C). Assicurarsi di non introdurre bolle d'aria nel chip.
      NOTA: il caricamento efficiente richiede un po' di pratica. Se il tessuto non è orientato correttamente, potrebbe essere possibile girarlo aspirando con cura e lavando di nuovo. Tuttavia, questo spesso si traduce in una rapida morte cellulare.
   4. Dopo ogni fase di caricamento del tessuto, chiudere l'ingresso di carico del tessuto corrispondente utilizzando un pezzo di tubo riempito di PDMS. Assicurarsi che i tappi siano sufficientemente spinti verso il basso sul fondo del chip usando pinzette smussate.
   5. Dopo che tutti i campioni sono stati caricati, chiudere eventuali ingressi / uscite inutilizzati con pezzi di tubi riempiti di PDMS usando una pinza smussata.
3. Assemblaggio di setup microfluidico.
   1. Abbassare la portata delle pompe microfluidiche. 60-100 μL/h funziona bene per i boccioli di coda degli embrioni di topo. A portate più elevate, è stata osservata la morte cellulare, presumibilmente a causa di un taglio cellulare troppo elevato. La portata cumulativa di più pompe non deve superare questi 60-100 μL/h per camera microfluidica in un dato momento.
   2. Collegare il tubo al chip microfluidico. Fallo senza ottenere bolle d'aria all'interno del chip (questo può essere ottenuto assicurandoti che ci sia una goccia di mezzo presente all'estremità del tubo). Le prese sono ancora presenti dal rivestimento in fibronectina (vedere 2.3).
   3. Una volta che tutti i tubi sono attaccati al chip, estrarlo dal becher, asciugarlo correttamente, metterlo in un piatto e metterlo insieme con circa 1,5 m di tubo di ingresso in un incubatore (37 ° C, 20% _O2, 5% _CO2) per la coltura notturna. Il tubo è permeabile al gas; ciò consentirà l'equilibrio di _O2 e _CO2 nel mezzo. In alternativa, per l'imaging simultaneo in tempo reale a fluorescenza, il chip e il tubo di ingresso di circa 1,5 m vengono inseriti direttamente nel microscopio. Un supporto per il chip, che si adatta ai supporti standard a 96 pozzetti, è fornito nel file supplementare 3.
      NOTA: Assicurarsi che l'umidità sia abbastanza alta durante l'incubazione. Se necessario, aggiungere un tessuto umido alla camera di imaging o all'incubatore per evitare l'evaporazione nella configurazione microfluidica. Se l'umidità nell'incubatore del microscopio è troppo bassa, ciò si traduce nella formazione di bolle d'aria nel tubo e nel chip microfluidico. È quindi possibile utilizzare una scatola di imaging chiusa, in cui sono posizionati chip e tubi. Il modo più semplice per realizzare una tale scatola di imaging è posizionare un grande coperchio sopra il chip e aggiungere un tessuto bagnato, non deve essere chiuso completamente. Assicurarsi che la differenza di altezza tra pompa e chip non sia troppo grande e, se necessario, modificare le altezze lentamente per evitare la formazione di bolle d'aria dovute alla gravità.
   4. Lasciare che tutte le pompe scorrano a una portata di 20 μL/h per 20 minuti, dopo che la configurazione è stata posizionata nella sua posizione finale. Poiché la camera e la pompa si sono probabilmente spostate in altezza, ciò è necessario per ristabilire la pressione corretta nel tubo.
   5. Spegnere la pompa del farmaco, lasciare che solo la pompa media funzioni a 60 μL / h fino all'inizio dell'esperimento / imaging in tempo reale.
4. Inizio dell'esperimento.
   1. Avviare il programma di pompaggio pianificato per l'esperimento. Per intrappolare la segnalazione notch, utilizzare un programma di pompaggio di impulsi di droga medi di 100 minuti e 30 minuti, che viene ripetuto fino alla fine dell'esperimento, in genere per 24 ore.
      NOTA: è possibile utilizzare qualsiasi pompa microfluidica programmabile. Nel formato più semplice, le pompe possono essere programmate e avviate manualmente. In alternativa, le pompe possono essere controllate da un software per computer.
   2. Nel caso in cui venga eseguita l'imaging in tempo reale, avviare l'imaging dopo un periodo di almeno 30 minuti. Ciò consentirà alla temperatura del chip di adattarsi alla temperatura all'interno dell'incubatore e prevenire una deriva troppo forte durante l'imaging. L'autofocus è ancora utile.
   3. Eseguire l'imaging confocale standard tramite il vetrino del chip utilizzando un microscopio invertito. Utilizzare un intervallo di imaging di 10 minuti per rilevare sufficientemente le oscillazioni di segnalazione con un periodo di 130 minuti.
   4. Per periodi più brevi, accorciare l'intervallo per un campionamento sufficiente. Includi una traccia di imaging a bassa risoluzione per il rilevamento di Cascade Blue per visualizzare la presenza di farmaco sul chip.
   5. Per l'eccitazione di un reporter di Venere, utilizzare un laser a 515 nm o un laser a 2 fotoni a una lunghezza d'onda di 960 nm.
   6. Acquisire una pila z di 6-8 piani con una distanza di 8 μm attraverso un obiettivo di piano 20x (risoluzione 512 x 512 pixel, 1,38 μm / pixel). Usa uno stadio motorizzato per visualizzare più campioni all'interno di un esperimento.
   7. Eccita Cascade Blue con un laser a 405 nm e acquisisci un singolo piano z ogni 10 minuti (risoluzione 32 x 32 pixel, 22,14 μm/pixel).
      NOTA: Ulteriori informazioni sull'imaging e l'analisi delle immagini sono fornite nei risultati rappresentativi e sono disponibili nel ^{riferimento10}.

Risultati

Con questo protocollo, viene presentato un metodo per il trascinamento esterno delle oscillazioni di segnalazione dell'orologio di segmentazione del mouse utilizzando la microfluidica. Applicando impulsi dell'inibitore della segnalazione di Notch, le oscillazioni di segnalazione in colture embrionali indipendenti vengono sincronizzate tra ^loro10. Un prerequisito per l'applicazione di questo sistema per studiare la funzionalità del clock di segmentazione è che le dinamiche di segnalazione e la segmentazione siano ancora presenti su chip. È stato dimostrato in precedenza che sia le dinamiche di segnalazione Wnt che Notch sono mantenute nonostante il flusso medio costante e la formazione del confine fisico persista nelle colture 2D periferiche, che rappresentano ^PSM10 anteriore.

Per confermare il trascinamento delle oscillazioni di segnalazione a impulsi di farmaci esterni, viene eseguita l'imaging in tempo reale, ad esempio, del reporter di segnalazione Notch LuVeLu5, che esprime la proteina fluorescente gialla Venere, durante l'esperimento microfluidico. Poiché l'orientamento delle colture 2D su chip è difficile da controllare, vengono analizzate le oscillazioni di segnalazione nel tessuto anteriore. La periferia della cultura 2D può essere rilevata in modo riproducibile. L'orientamento delle sezioni di tessuto su chip non può essere controllato a piacimento e l'intera superficie interna del chip viene rivestita con fibronectina. Pertanto, occasionalmente accade che le colture si attacchino ai lati o al soffitto del chip. Nel caso in cui i campioni si spostino fuori dal campo visivo (in direzione x, y e z) o si attacchino con l'estremità posteriore della coda rivolta verso il basso, generalmente questi campioni sono esclusi.

Per ulteriori analisi, vengono combinati più di tali esperimenti di trascinamento. Esperimenti indipendenti possono essere allineati tra loro utilizzando la tempistica degli impulsi del farmaco visualizzati dal colorante, Cascade Blue, a circa 400 nm. Per analizzare e visualizzare la sincronizzazione, le oscillazioni quantificate possono essere detrended (Figura 2B, D) e quindi visualizzate come deviazione media e standard o possono essere calcolate fasi delle oscillazioni. Ciò consente l'analisi della relazione di fase tra le oscillazioni di colture embrionali posteriori indipendenti tra loro e con gli impulsi esterni del farmaco (Figura 2C,E). Il programma basato su python ^pyBOAT33 è uno strumento semplice e intuitivo per determinare il periodo, la fase e l'ampiezza di tali oscillazioni di segnalazione. Per confermare il trascinamento, si può, ad esempio, determinare il periodo delle oscillazioni di segnalazione endogene. Quando si applicano impulsi con un periodo di 130 minuti, le oscillazioni di segnalazione Notch mostrano anche un periodo di 130 minuti (Figura 2F)¹⁰. Inoltre, utilizzando gli impulsi Cascade Blue, esperimenti indipendenti con diversi segnalatori di segnalazione possono essere allineati tra loro. In questo modo è possibile determinare indirettamente la relazione di fase tra le oscillazioni di più segnalatori ^{di segnalazione10}.

Pertanto, il sistema microfluidico presentato consente il controllo delle oscillazioni di segnalazione in colture ex vivo dell'embrione di topo in via di sviluppo. In combinazione con l'imaging di marcatori per la formazione e la differenziazione dei segmenti, questo sistema può ora essere applicato per analizzare come interagiscono i percorsi di segnalazione dell'orologio di segmentazione e come controllano la formazione di somiti.

Figura 1: Panoramica schematica del protocollo microfluidico. (A) Gli stampi per chip possono essere progettati utilizzando un software CAD (Computer-Aided-Design). Viene fornito un progetto di chip per le oscillazioni di segnalazione del trascinamento in modelli ex vivo di somitogenesi del topo. Gli stampi possono, ad esempio, essere generati dalla stampa 3D o ordinati. I chip microfluidici sono prodotti mediante stampaggio di PDMS. Un chip PDMS indurito viene tagliato e legato covalentemente a un vetrino usando un forno al plasma. La superficie del vetro all'interno del chip è rivestita con fibronectina per consentire il fissaggio del tessuto sezionato. Il tessuto embrionale viene caricato sul chip tramite prese di carico, che vengono successivamente chiuse. Le pompe con diverse condizioni del fluido sono collegate alle prese del chip e viene inizializzato un programma di flusso. Il tessuto può essere ripreso utilizzando un microscopio confocale durante l'esperimento. (Kymographs adattato da Sonnen et al., 201810. Ristampato e modificato da Cell secondo Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.) (B) Disegno schematico di un disegno di stampo per la coltura su chip di tessuto embrionale di topo posteriore. L'altezza dei canali microfluidici è di 500 μm, sufficiente per la coltura delle code di topo embrionali posteriori. Il file per stampare questo stampo è fornito nel file supplementare 1 e un'alternativa è fornita nel file supplementare 2. (C) Immagine Brightfield di una coda di mouse sezionata E10.5 racchiusa da pilastri PDMS su chip. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risultati rappresentativi di un esperimento di microfluidica. (A) Rappresentazione schematica dell'esperimento di trascinamento con mezzo e pompa del farmaco. Gli impulsi del modulatore del percorso di segnalazione vengono applicati a colture ex vivo di embrioni di topo e le oscillazioni di segnalazione possono essere visualizzate mediante imaging in tempo reale di reporter di segnalazione dinamica (ad esempio, il reporter di segnalazione Notch LuVeLu5 e il reporter di segnalazione Wnt Axin2T2A10). Le linee tratteggiate indicano l'area utilizzata per le analisi nel tempo. (B-F) Le oscillazioni del reporter LuVeLu sono trascinate da impulsi periodici dell'inibitore di segnalazione Notch DAPT. (B,D) Quantificazioni delle oscillazioni di segnalazione Notch nel PSM anteriore al momento del trascinamento utilizzando DAPT o un controllo DMSO. (C,E) La relazione fase-fase traccia tra la fase delle oscillazioni di segnalazione di Notch e la temporizzazione degli impulsi DAPT/DMSO esterni. In caso di trascinamento, viene stabilita una relazione di fase stabile. (F) Quantificazione del periodo medio e SEM delle oscillazioni del reporter confrontando i campioni trascinati con gli impulsi DMSO e DAPT. (Figura adattata da Sonnenet al., 201810. Ristampato e modificato da Cell secondo Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Problema	Soluzione(e) suggerita(e)
Il PDMS non si lega al vetro.	- Assicurarsi che sia il PDMS che il vetro siano puliti.
	- Assicurati che ci sia abbastanza PDMS intorno alla camera per l'incollaggio.
	- Ottimizzare le impostazioni del forno al plasma.
Ci sono bolle d'aria sul mio chip.	- Controllare se la pompa è stata accesa.
	- Degasare il chip prima di caricare il tessuto sul chip.
	- Degas il mezzo prima dell'inizio dell'esperimento.
	- Assicurarsi che l'umidità nella camera di incubazione sia abbastanza alta.
Il tessuto muore all'inizio dell'esperimento.	- Aggiungere HEPES al mezzo durante il caricamento e l'assemblaggio del chip.
	- Non lavare il tessuto dentro e fuori troppo spesso durante il carico.
	- Controllare che la portata non sia troppo alta.
Il tessuto muore durante l'imaging.	- Assicurarsi che non vi sia fototossicità dall'imaging
	- Assicurarsi che non vi sia contaminazione.
	- La portata non deve essere troppo alta.
La messa a fuoco cambia durante l'imaging.	- Utilizzare l'autofocus durante l'imaging per regolare la deriva della diapositiva di imaging.
	- Lasciare che il chip si equilibri alla temperatura all'interno del microscopio per almeno 30 minuti.
Le uscite/ingressi si staccano.	- Spingere completamente tutti i tubi verso il basso.
Il vetro del chip si rompe.	- Stai più attento, il vetro è molto fragile.
	- Il vetro sottile è richiesto solo per l'imaging. Se l'imaging non viene eseguito, è possibile utilizzare un normale vetrino più spesso.
	- Se la rottura è al di fuori del chip, potrebbe non essere un problema. Se il sigillo di vetro al chip è rotto, il liquido fuoriuscirà e l'aria entrerà.
C'è una contaminazione sul mio chip.	- Aggiungere antibiotici al terreno di coltura.
	- Sterilizzare tutte le attrezzature e i tubi.
	- Lavora velocemente e pulito.

Tabella 1: Risoluzione dei problemi

Fascicolo complementare 1: File STL per la stampa di uno stampo con una stampante 3D. Questo stampo viene utilizzato per generare un chip microfluidico per la coltura su chip del tessuto embrionale posteriore (disegno mostrato nella Figura 1). Fare clic qui per scaricare questo file.

Fascicolo complementare 2: File STL per la stampa di uno stampo con una stampante 3D per generare un chip microfluidico per la coltura su chip del tessuto embrionale posteriore. A differenza del file supplementare 1 e del progetto mostrato nella Figura 1, questo progetto contiene trappole a bolle in tutte le prese d'ingresso per impedire a piccole quantità di aria di entrare nella camera microfluidica principale. Fare clic qui per scaricare questo file.

Fascicolo complementare 3: File di progettazione per la generazione di un supporto per posizionare il chip nel microscopio. Questo supporto ha le dimensioni di una piastra a 96 pozzetti e dovrebbe adattarsi ai supporti standard della maggior parte dei microscopi. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Come la dinamica di segnalazione controlli i sistemi multicellulari è stata una domanda di lunga data nel campo. L'indagine funzionale rappresenta una sfida chiave, perché queste dinamiche devono essere sottilmente modulate per ^{consentirlo11}. Tale controllo temporale sulle perturbazioni del percorso può in linea di principio essere ottenuto con l'optogenetica, che consente anche un elevato controllo ^spaziale34. Tuttavia, l'optogenetica richiede la creazione di sofisticati strumenti genetici per l'analisi di ciascuna via di segnalazione in questione. L'attuale protocollo qui descritto fornisce uno strumento altamente versatile per la perturbazione di qualsiasi via di segnalazione. L'esperimento di microfluidica consente l'applicazione di impulsi di farmaci controllati temporalmente per indagare funzionalmente la dinamica delle vie di segnalazione nelle colture tissutali. Qui, l'attenzione si concentra sullo studio della somitogenesi in colture ex vivo , ma il protocollo può essere adattato per adattarsi a qualsiasi altro sistema modello.

Alcuni passaggi del protocollo sono fondamentali per eseguire un esperimento di microfluidica di successo (riassunto nella Tabella 1). I punti chiave sono discussi come segue. A causa del flusso medio durante il corso dell'esperimento, la coltura tissutale subisce uno stress da taglio. L'esposizione del sistema modello al flusso continuo può causare stress cellulare e in casi estremi morte cellulare a causa dell'effetto di taglio. Per le colture tissutali ex vivo di boccioli di coda di topo e l'attuale design del chip, è stato riscontrato che una portata di 60 μL/h (massimo 100 μL/h) funziona bene con un effetto di taglio minimo. Quando più pompe vengono accese contemporaneamente per lo stesso chip, la portata delle singole pompe deve essere regolata di conseguenza per non causare un aumento della portata totale. Quando il protocollo corrente viene adattato ad altri sistemi modello e progetti di chip, la portata deve essere ottimizzata. In alternativa, è possibile non lavare il mezzo in modo continuo, ma cambiare periodicamente il mezzo sul ^chip35. Tale configurazione può anche essere applicata per controllare le oscillazioni di segnalazione nella somitogenesi del topo (dati non pubblicati, non mostrati). Inoltre, si può anche immaginare una configurazione, in cui le colture tissutali non sono esposte al flusso diretto del fluido, ma i farmaci raggiungono il tessuto per diffusione da un canale vicino. Tali sistemi sono stati utilizzati con successo per applicare gradienti di fattori di crescita a modelli in vitro di differenziazione ^ESC14,36.

Uno dei principali problemi degli esperimenti microfluidici è il verificarsi di bolle d'aria su chip durante l'esperimento. Le bolle d'aria all'interno del chip o del tubo possono interferire con il flusso uniforme di liquido sul chip e possono portare alla rimozione della coltura dell'embrione dalla sua posizione. Per prevenire la presenza di bolle d'aria, sono indispensabili vari passaggi del protocollo. In primo luogo, il terreno di coltura all'interno delle siringhe e il chip microfluidico stesso devono essere degassati utilizzando un essiccatore (punto 3.1.3). In secondo luogo, quando si caricano campioni nelle prese di carico, si deve fare attenzione a non convogliare l'aria nel chip insieme al campione (punto 3.2.3). In terzo luogo, quando si riempie il tubo con il mezzo, tutte le bolle d'aria devono essere pompate fuori prima di collegare il chip (punto 3.3.2). Altrimenti, queste bolle verranno spinte nel chip principale durante l'esperimento. Infine, durante l'esperimento, il mezzo viene bilanciato all'interno della camera di imaging o dell'incubatore a causa del tubo semipermeabile. La permeabilità del tubo consente anche l'evaporazione del mezzo, quindi assicurarsi che l'umidità sia regolata durante l'esperimento per prevenire la formazione di nuove bolle nel tubo.

In generale, la microfluidica è uno strumento altamente versatile che può essere adattato alla domanda specifica del ricercatore. L'attuale approccio progettuale consente di acquisire fino a 12 colture ex vivo in parallelo per chip. Questo numero è principalmente limitato dal numero di embrioni per esperimento e dal tempo necessario per visualizzare ogni coltura embrionale con una risoluzione sufficiente. Se è necessario confrontare più condizioni in un singolo esperimento, è possibile montare più chip su una singola diapositiva di vetro. Viene fornito un progetto di chip, ideale per l'imaging di più espianti di tessuto in parallelo, ma i progetti personalizzati possono superare le limitazioni nel numero di campioni per consentire un'analisi ad alta produttività e aumentare la combinazione di più condizioni all'interno di un singolo ^{esperimento16,17}. La microfluidica è limitata ai modelli che possono essere coltivati su un chip e la cultura su chip dovrà essere ottimizzata per ciascun sistema modello individualmente27,37,38.

Negli ultimi 5-10 anni, la microfluidica è stata applicata per affrontare varie questioni biologiche grazie al suo potenziale per approcci ad alto rendimento e sottili modulazioni di dinamiche e gradienti di segnalazione. Al giorno d'oggi, la microfluidica è diventata uno strumento facilmente applicabile, economico e versatile che i laboratori possono stabilire con facilità. Qui, il protocollo attuale è ottimizzato per un'applicazione specifica, vale a dire, studiando le dinamiche di segnalazione che governano la somitogenesi. È semplice adattare questo protocollo e il design per soddisfare le singole domande di ricerca nella biologia dei tessuti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 10 ml	Becton, Dickinson and company	300912
184 Agente indurente per elastomeri siliconici	SYLGARD	1673921
184 Elastomero siliconico PDMS	SYLGARD	1673921
Siringhe da 3 ml Becton	, Dickinson and company	309657
Nastro			Scotch Magic o simili
Pinze a punta smussata Bochem 18/10 Acciaio inossidabile	Fisher Scientific	10663341
Siero bovino Albumina Liofilizzato pH~7	Biowest	P6154
Sistema
Piatto di cristallizzazione	VWR	10754-7	Sterilizzato
D-(+)-glucosio 45%	Sigma	G8769
Essiccatore	VWR	467-0104
Bicchieri monouso	Duni	173 941
Forchette monouso	Graffette	511514
Apparecchiature
DMEM/F12	Tecnologie di coltura cellulare	DMEM	/F-12 personalizzate, senza rosso fenolo, senza L-glutammina, senza glucosio
Fibronectina	Sigma	F1141-5MG
Cappa di flusso BioVanguard Greenline	CleanAir di Baker	511514	Per sorgente di luce UV
Vetrino No 1.5H ad alta precisione, 70x70 mm	Marienfeld	107999098
HEPES Buffer	Gibco	15630-056
L-glutammina	Gibco	25030024
Microscopio	Leica	SP8 MP
Aghi 22G	Becton, dickinson e azienda	z412139-100EA
Forno	VWR	390-09
PBS0
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15070063
Forno al plasma Femto	Diener elettronico
Punch & Oslash; 1mm	Uni-Core	WB100073
Scala	Sartorius	Entris
Pompa a siringa	WPI	AL-4000
Tubo & Oslash; 1mm	APT	AWG24T
Pompa a vuoto	VWR	181-0308