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Articolo metodologico

Analisi del trascrittoma ad alto rendimento per indagare le interazioni ospite-patogeno

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DOI:

10.3791/62324

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5 marzo 2022

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1Laboratory of Pathology of Infectious Diseases, Department of Pathology, Medical School, University of São Paulo, 2Scientific Platform Pasteur USP, 3Department of Clinical and Toxicological Analyses, School of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, 4Hospital Israelita Albert Einstein

In questo articolo

Sommario

Il protocollo qui presentato descrive una pipeline completa per analizzare i dati del trascrittoma di sequenziamento dell'RNA dalle letture grezze all'analisi funzionale, compresi i passaggi di controllo della qualità e pre-elaborazione per approcci analitici statistici avanzati.

Abstract

Gli agenti patogeni possono causare un'ampia varietà di malattie infettive. I processi biologici indotti dall'ospite in risposta all'infezione determinano la gravità della malattia. Per studiare tali processi, i ricercatori possono utilizzare tecniche di sequenziamento ad alto rendimento (RNA-seq) che misurano i cambiamenti dinamici del trascrittoma dell'ospite in diverse fasi dell'infezione, esiti clinici o gravità della malattia. Questa indagine può portare a una migliore comprensione delle malattie, oltre a scoprire potenziali bersagli e trattamenti farmacologici. Il protocollo qui presentato descrive una pipeline completa per analizzare i dati di sequenziamento dell'RNA dalle letture grezze all'analisi funzionale. La pipeline è suddivisa in cinque fasi: (1) controllo di qualità dei dati; (2) mappatura e annotazione dei geni; (3) analisi statistica per identificare geni differenzialmente espressi e geni co-espressi; (4) determinazione del grado molecolare della perturbazione dei campioni; e (5) analisi funzionale. Il passaggio 1 rimuove gli elementi tecnici che potrebbero influire sulla qualità delle analisi a valle. Nel passaggio 2, i geni vengono mappati e annotati secondo i protocolli standard della libreria. L'analisi statistica nella fase 3 identifica i geni che sono differenzialmente espressi o co-espressi in campioni infetti, rispetto a quelli non infetti. La variabilità del campione e la presenza di potenziali valori anomali biologici sono verificate utilizzando l'approccio del grado molecolare di perturbazione nella fase 4. Infine, l'analisi funzionale nella fase 5 rivela i percorsi associati al fenotipo della malattia. La pipeline presentata mira a supportare i ricercatori attraverso l'analisi dei dati RNA-seq da studi di interazione ospite-patogeno e guidare futuri esperimenti in vitro o in vivo , che sono essenziali per comprendere il meccanismo molecolare delle infezioni.

Introduzione

Gli arbovirus, come la dengue, la febbre gialla, la chikungunya e la zika, sono stati ampiamente associati a diversi focolai endemici e sono emersi come uno dei principali agenti patogeni responsabili dell'infezione umana negli ultimi decenni1,2. Gli individui infettati dal virus chikungunya (CHIKV) hanno spesso febbre, mal di testa, eruzione cutanea, poliartralgia e artrite3,4,5. I virus possono sovvertire l'espressione genica della cellula e influenzare varie vie di segnalazione dell'ospite. Recentemente, gli studi sul trascrittoma del sangue hanno utilizzato RNA-seq per identificare i geni differenzialmente espressi (DEG) associati all'infezione acuta da CHIKV rispetto alla convalescenza6 o ai controlli sani7. I bambini infetti da CHIKV avevano geni up-regolati che sono coinvolti nell'immunità innata, come quelli relativi ai sensori cellulari per l'RNA virale, la segnalazione JAK / STAT e le vie di segnalazione del recettore toll-like6. Gli adulti acutamente infettati da CHIKV hanno anche mostrato l'induzione di geni correlati all'immunità innata, come quelli correlati ai monociti e all'attivazione delle cellule dendritiche, e alle risposte antivirali7. Le vie di segnalazione arricchite con geni down-regolati includevano quelle relative all'immunità adattativa, come l'attivazione e la differenziazione e l'arricchimento delle cellule T nelle cellule T e B7.

Diversi metodi possono essere utilizzati per analizzare i dati del trascrittoma dei geni dell'ospite e del patogeno. Spesso, la preparazione della libreria RNA-seq inizia con l'arricchimento di trascritti poli-A maturi. Questo passaggio rimuove la maggior parte dell'RNA ribosomiale (rRNA) e in alcuni casi gli RNA virali / batterici. Tuttavia, quando la questione biologica coinvolge il rilevamento del trascritto patogeno e l'RNA viene sequenziato indipendentemente dalla selezione precedente, molti altri trascritti diversi potrebbero essere rilevati mediante sequenziamento. Ad esempio, gli mRNA subgenomici hanno dimostrato di essere un fattore importante per verificare la gravità delle malattie8. Inoltre, per alcuni virus come CHIKV e SARS-CoV-2, anche le librerie arricchite di poly-A generano letture virali che possono essere utilizzate nelle analisi a valle9,10. Quando si concentrano sull'analisi del trascrittoma dell'ospite, i ricercatori possono studiare la perturbazione biologica tra i campioni, identificare geni differenzialmente espressi e percorsi arricchiti e generare moduli di co-espressione7,11,12. Questo protocollo evidenzia le analisi del trascrittoma di pazienti con infezione da CHIKV e individui sani utilizzando diversi approcci bioinformatici (Figura 1A). I dati di uno studio precedentemente pubblicato7 composto da 20 individui sani e 39 CHIKV acutamente infetti sono stati utilizzati per generare i risultati rappresentativi.

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Protocollo

I campioni utilizzati in questo protocollo sono stati approvati dai comitati etici sia del Dipartimento di Microbiologia dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo che dell'Università Federale di Sergipe (Protocolli: 54937216.5.0000.5467 e 54835916.2.0000.5546, rispettivamente).

1. Installazione desktop Docker

NOTA: i passaggi per preparare l'ambiente Docker sono diversi tra i sistemi operativi (OS). Pertanto, gli utenti Mac devono seguire i passaggi elencati come 1.1, gli utenti Linux devono seguire i passaggi elencati come 1.2 e gli utenti Windows devono seguire i passaggi elencati come 1.3.

  1. Installa su MacOS.
    1. Accedere al sito Web Get Docker (Table of Materials), fare clic su Docker Desktop per Mac e quindi fare clic sul collegamento Scarica da Docker Hub .
    2. Scaricare il file di installazione facendo clic sul pulsante Ottieni Docker .
    3. Eseguire il file Docker.dmg per aprire il programma di installazione, quindi trascinare l'icona nella cartella Applicazioni . Localizzare ed eseguire il Docker.app nella cartella Applicazioni per avviare il programma.
      NOTA: il menu specifico del software nella barra di stato superiore indica che il software è in esecuzione e che è accessibile da un terminale.
  2. Installare il programma contenitore sul sistema operativo Linux.
    1. Accedere al sito Web Get Docker Linux (Table of Materials) e seguire le istruzioni per l'installazione utilizzando la sezione repository disponibile sul collegamento Docker Linux Repository .
    2. Aggiorna tutti i pacchetti Linux usando la riga di comando:
      sudo apt-get aggiornamento
    3. Installare i pacchetti richiesti in Docker:
      sudo apt-get install apt-transport-https ca-certificates curl gnupg lsb-release
    4. Creare un file portachiavi di archivio software:
      curl -fsSL https://download.docker.com/linux/ubuntu/gpg | sudo gpg --dearmor -o /usr/share/portachiavi/docker-archive-keyring.gpg
    5. Aggiungi informazioni deb Docker nel file source.list:
      echo "deb [arch=amd64 signed-by=/usr/share/keyrings/docker-archive-keyring.gpg] https://download.docker.com/linux/ubuntu $(lsb_release -cs) stable" | sudo tee /etc/apt/sources.list.d/docker.list > /dev/null
    6. Aggiorna di nuovo tutti i pacchetti, inclusi quelli aggiunti di recente:
      sudo apt-get aggiornamento
    7. Installare la versione desktop:
      sudo apt-get install docker-ce docker-ce-cli containerd.io
    8. Selezionare l'area geografica e il fuso orario per completare il processo di installazione.
  3. Installare il programma contenitore sul sistema operativo Windows.
    1. Accedi al sito Web Get Docker (Table of Materials) e fai clic su Inizia. Trova il programma di installazione per Docker Desktop per Windows. Scaricare i file e installarli localmente sul computer.
    2. Dopo il download, avviare il file di installazione (.exe) e mantenere i parametri predefiniti. Assicurarsi che le due opzioni Installa componenti di Windows necessari per WSL 2 e Aggiungi collegamento al desktop siano contrassegnate .
      NOTA: in alcuni casi, quando questo software tenta di avviare il servizio, viene visualizzato un errore: l'installazione di WSL è incompleta. Per capire questo errore, accedere al sito Web WSL2-Kernel (Table of Materials).
    3. Scaricare e installare l'ultimo kernel WSL2 Linux.
    4. Accedere al terminale PowerShell come amministratore ed eseguire il comando:
      dism.exe /online /enable-feature /featurename:Microsoft-Windows-Subsystem-Linux /all /norestart
    5. Assicurarsi che il software Docker Desktop sia installato correttamente.
  4. Scaricare l'immagine dal repository CSBL sull'hub Docker (Table of Materials).
    1. Apri Docker Desktop e verifica che lo stato sia "in esecuzione" in basso a sinistra della barra degli strumenti.
    2. Passare alla riga di comando del terminale di Windows PowerShell. Scaricare l'immagine Linux Container per questo protocollo dal repository CSBL nell'hub Docker. Eseguire il seguente comando per scaricare l'immagine:
      docker pull csblusp/transcriptome
      NOTA: dopo aver scaricato l'immagine, il file può essere visualizzato nel desktop Docker. Per creare il contenitore, gli utenti Windows devono seguire il passaggio 1.5, mentre gli utenti Linux devono seguire il passaggio 1.6.
  5. Inizializzare il contenitore del server sul sistema operativo Windows.
    1. Visualizza il file immagine Docker in Gestione app desktop dalla barra degli strumenti e accedi alla pagina Immagini.
      NOTA: se l'immagine della pipeline è stata scaricata correttamente, sarà disponibile un'immagine csblusp/transcriptome.
    2. Avviare il contenitore dall'immagine csblusp/transcriptome facendo clic sul pulsante Esegui . Espandere Impostazioni facoltative per configurare il contenitore.
    3. Definire il nome del contenitore (ad esempio, server).
    4. Associare una cartella nel computer locale alla cartella all'interno della finestra mobile. A tale scopo, determinare il percorso host. Impostare una cartella nel computer locale per memorizzare i dati elaborati che verranno scaricati alla fine. Impostare il percorso del contenitore. Definire e collegare la cartella del contenitore csblusp/transcriptome al percorso del computer locale (utilizzare il nome "/opt/transferdata" per il percorso del contenitore).
    5. Successivamente, fare clic su Esegui per creare il contenitore csblusp / transcriptome.
    6. Per accedere al terminale Linux dal contenitore csblusp/transcriptome, fare clic sul pulsante CLI.
    7. Digita il terminale bash per avere un'esperienza migliore. Per questo, esegui il comando:
      Bash
    8. Dopo aver eseguito il comando bash, assicurarsi che il terminale mostri (root@:/#):
      root@ac12c583b731:/ #
  6. Inizializzare il contenitore server per il sistema operativo Linux.
    1. Eseguire questo comando per creare il contenitore Docker in base all'immagine:
      docker run -d -it --rm --name server -v :/opt/transferdata csblusp/transcriptome
      NOTA: : definire un percorso del computer delle cartelle locali.
    2. Eseguire questo comando per accedere al terminale di comando del contenitore Docker:
      docker exec -it server bash
    3. Garantire la disponibilità di un terminale Linux per eseguire qualsiasi programma / script utilizzando la riga di comando.
    4. Dopo aver eseguito il comando bash, assicurarsi che il terminale mostri (root@:/#):
      root@ac12c583b731:/ #
      NOTA: la password di root è "transcriptome" per impostazione predefinita. Se lo si desidera, la password di root può essere modificata eseguendo il comando:
      passwd
    5. Innanzitutto, esegui il comando di origine per addpath.sh per assicurarti che tutti gli strumenti siano disponibili. Eseguire il comando:
      source /opt/addpath.sh
  7. Controllare la struttura della cartella di sequenziamento dell'RNA.
    1. Accedi alla cartella degli script della pipeline del trascrittoma e assicurati che tutti i dati del sequenziamento dell'RNA siano memorizzati all'interno della cartella: /home/transcriptome-pipeline/data.
    2. Assicurarsi che tutti i risultati ottenuti dall'analisi siano memorizzati all'interno della cartella del percorso /home/transcriptome-pipeline/results.
    3. Assicurarsi che i file di riferimento del genoma e dell'annotazione siano memorizzati all'interno della cartella del percorso /home/transcriptome-pipeline/datasets. Questi file aiuteranno a supportare tutte le analisi.
    4. Assicurarsi che tutti gli script siano memorizzati nella cartella del percorso /home/transcriptome-pipeline/scripts e separati da ogni passaggio come descritto di seguito.
  8. Scarica l'annotazione e il genoma umano.
    1. Accedere alla cartella degli script:
      cd /home/transcriptome-pipeline/scripts
    2. Eseguire questo comando per scaricare il genoma umano di riferimento:
      bash downloadGenome.sh
    3. Per scaricare l'annotazione, eseguire il comando:
      bash downloadAnnotation.sh
  9. Modificare l'annotazione o la versione del genoma di riferimento.
    1. Apri downloadAnnotation.sh e downloadGenome.sh per modificare l'URL di ogni file.
    2. Copia i file downloadAnnotation.sh e downloadGenome.sh nell'area di trasferimento e modificali nel sistema operativo locale.
      cd /home/transcriptome-pipeline/scripts
      cp downloadAnnotation.sh downloadGenome.sh /opt/transferdata
    3. Aprire la cartella Percorso host , selezionata per il collegamento tra host e contenitore Docker nel passaggio 1.5.4.
    4. Modifica i file utilizzando il software di editor preferito e salva. Infine, inserisci i file modificati nella cartella dello script. Eseguire il comando:
      cd /opt/transferdata
      cp downloadAnnotation.sh downloadGenome.sh /home/transcriptome-pipeline/scripts
      NOTA: Questi file possono essere modificati direttamente utilizzando vim o nano Linux editor.
  10. Quindi, configura lo strumento fastq-dump con la riga di comando:
    vdb-config --interattivo
    NOTA: consente di scaricare i file di sequenziazione dai dati di esempio.
    1. Spostarsi nella pagina Strumenti utilizzando il tasto TAB e selezionare l'opzione cartella corrente. Passare all'opzione Salva e fare clic su OK. Quindi, esci dallo strumento fastq-dump.
  11. Avviare il download delle letture dall'articolo pubblicato in precedenza7. È richiesto il numero di adesione SRA di ciascun campione. Ottenere i numeri SRA dal sito Web SRA NCBI (Table of Materials).
    NOTA: per analizzare i dati RNA-Seq disponibili nei database pubblici, seguire il passaggio 1.12. Per analizzare i dati privati di RNA-seq, seguire il passaggio 1.13.
  12. Analizza dati pubblici specifici.
    1. Accedi al sito web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) e cerca parole chiave per un argomento specifico.
    2. Clicca sul link Risultato per BioProject nella sezione Genomi .
    3. Scegli e fai clic su uno studio specifico. Fare clic su Esperimenti SRA. Si apre una nuova pagina, che mostra tutti i campioni disponibili per questo studio.
    4. Fare clic sul numero di adesione "Invia a:" sopra. Nell'opzione "Scegli destinazione" selezionare l'opzione File e formato , selezionare RunInfo. Fare clic su "Crea file" per esportare tutte le informazioni della libreria.
    5. Salvare il file SraRunInfo.csv nel percorso Host definito nel passaggio 1.5.4 ed eseguire lo script di download:
      cp /opt/transferdata/SraRunInfo.csv /home/transcriptome-pipeline/data
      cd /home/transcriptome-pipeline/scripts
      bash downloadAllLibraries.sh
  13. Analizza dati di sequenziamento privati e non pubblicati.
    1. Organizzare i dati di sequenziazione in una cartella denominata Reads.
      NOTA: all'interno della cartella Letture , creare una cartella per ogni esempio. Queste cartelle devono avere lo stesso nome per ogni esempio. Aggiungere i dati di ogni campione all'interno della relativa directory. Nel caso in cui si tratti di un RNA-Seq accoppiato, ogni directory di esempio deve contenere due file FASTQ, che devono presentare nomi che terminano secondo i modelli {sample}_1.fastq.gz e {sample}_2.fastq.gz, sequenze avanti e indietro, rispettivamente. Ad esempio, un esempio denominato "Healthy_control" deve avere una directory con lo stesso nome e file FASTQ denominati Healthy_control_1.fastq.gz e Healthy_control_2.fastq.gz. Tuttavia, se la sequenziazione della libreria è una strategia single-end, è necessario salvare un solo file di lettura per l'analisi a valle. Ad esempio, lo stesso esempio, "Controllo integro", deve avere un file FASTQ univoco denominato Healthy_control.fastq.gz.
    2. Creare un file fenotipico contenente tutti i nomi di esempio: denominare la prima colonna come 'Campione' e la seconda colonna come 'Classe'. Riempire la colonna Campione con i nomi dei campioni, che devono avere lo stesso nome per le directory dei campioni e riempire la colonna Classe con il gruppo fenotipico di ciascun campione (ad esempio, controllo o infetto). Infine, salva un file con il nome "metadata.tsv" e invialo alla directory /home/transcriptome-pipeline/data/. Controllare il metadata.tsv esistente per comprendere il formato del file fenotipico.
      cp /opt/transferdata/metadata.tsv
      /home/transcriptome-pipeline/data/metadata.tsv
    3. Accedere alla directory Percorso host definita nel passaggio 1.5.4 e copiare i nuovi esempi di directory strutturate. Infine, spostate gli esempi da /opt/transferdata alla directory dei dati della pipeline.
      cp -rf /opt/transferdata/reads/*
      /home/transcriptome-pipeline/data/reads/
  14. Osservare che tutte le letture sono memorizzate nella cartella /home/transcriptome-pipeline/data/reads.

2. Controllo di qualità dei dati

NOTA: valutare, graficamente, la probabilità di errori nelle letture di sequenziamento. Rimuovere tutte le sequenze tecniche, ad esempio gli adattatori.

  1. Accedi alla qualità di sequenziamento delle librerie con lo strumento FastQC.
    1. Per generare i grafici di qualità, eseguire il programma fastqc. Eseguire il comando:
      bash FastQC.sh
      NOTA: i risultati verranno salvati nella cartella /home/transcriptome-pipeline/results/FastQC. Poiché gli adattatori di sequenza vengono utilizzati per la preparazione e il sequenziamento della libreria, in alcuni casi i frammenti della sequenza degli adattatori possono interferire con il processo di mappatura.
  2. Rimuovere la sequenza dell'adattatore e le letture di bassa qualità. Accedere alla cartella Scripts ed eseguire il comando per lo strumento Trimmomatic:
    cd /home/transcriptome-pipeline/scripts
    bash trimmomatic.sh
    NOTA: I parametri utilizzati per il filtro di sequenziamento sono: Rimuovi le basi iniziali di bassa qualità o 3 (al di sotto della qualità 3) (LEADING:3); Rimuovere le basi di bassa qualità o 3 (al di sotto della qualità 3) (TRAILING:3); Scansiona la lettura con una finestra scorrevole larga 4 basi, tagliando quando la qualità media per base scende al di sotto di 20 (SLIDINGWINDOW:4:20); e Drop legge sotto le 36 basi lunghe (MINLEN:36). Questi parametri possono essere modificati modificando il file di script Trimmomatic.
    1. Assicurarsi che i risultati vengano salvati nella seguente cartella: /home/transcriptome-pipeline/results/trimreads. Eseguire il comando:
      ls /home/transcriptome-pipeline/results/trimreads

3. Mappatura e annotazione dei campioni

NOTA: Dopo aver ottenuto le letture di buona qualità, queste devono essere mappate al genoma di riferimento. Per questo passaggio, il mappatore STAR è stato utilizzato per mappare i campioni di esempio. Lo strumento di mappatura STAR richiede 32 GB di memoria RAM per caricare ed eseguire le letture e la mappatura del genoma. Per gli utenti che non dispongono di 32 GB di memoria RAM, è possibile utilizzare letture già mappate. In questi casi saltare al passaggio 3.3 o utilizzare il mappatore Bowtie2. Questa sezione contiene script per STAR (risultati mostrati in tutte le figure) e Bowtie2 (mappatore richiesto a bassa memoria).

  1. Per prima cosa indicizza il genoma di riferimento per il processo di mappatura:
    1. Accedere alla cartella Scripts utilizzando la riga di comando:
      cd /home/transcriptome-pipeline/scripts
    2. Per IL mappatore STAR, eseguire:
      bash indexGenome.sh
    3. Per Bowtie mapper, eseguire:
      bash indexGenomeBowtie2.sh
  2. Eseguire il seguente comando per mappare le letture filtrate (ottenute dal passaggio 2) al genoma di riferimento (versione GRCh38). Entrambi i mappatori STAR e Bowtie2 vengono eseguiti utilizzando parametri predefiniti.
    1. Per IL mappatore STAR, eseguire:
      bash mapSTAR.sh
    2. Per il mappatore Bowtie2, eseguire:
      bash mapBowtie2.sh
      NOTA: i risultati finali sono file BAM (Binary Alignment Map) per ogni campione archiviato in /home/transcriptome-pipeline/results/mapreads.
  3. Annotare le letture mappate utilizzando lo strumento FeatureCounts per ottenere conteggi grezzi per ciascun gene. Eseguire gli script che annotano le letture.
    NOTA: lo strumento FeatureCounts è responsabile dell'assegnazione di letture di sequenziamento mappate alle feature genomiche. Gli aspetti più importanti dell'annotazione del genoma che possono essere modificati in seguito alla questione biologica includono, rilevamento di isoforme, letture multiple mappate e giunzioni esone-esone, corrispondenti ai parametri, GTF.attrType="gene_name" per gene o non specificare i parametri per il livello di meta-feature, allowMultiOverlap=TRUE e juncCounts=TRUE, rispettivamente.
    1. Accedere alla cartella degli script utilizzando la riga di comando:
      cd /home/transcriptome-pipeline/scripts
    2. Per annotare le letture mappate per ottenere conteggi grezzi per gene, eseguire la riga di comando:
      Annotazione Rscript. R
      NOTA: I parametri utilizzati per il processo di annotazione erano: return gene short name (GTF.attrType="gene_name"); consentire sovrapposizioni multiple (allowMultiOverlap = TRUE); e indicare che la libreria è paired-end (isPairedEnd=TRUE). Per la strategia single-end, utilizzare il parametro isPairedEnd=FALSE. I risultati verranno salvati nella cartella /home/transcriptome-pipeline/countreads.
  4. Normalizzare l'espressione genica.
    NOTA: La normalizzazione dell'espressione genica è essenziale per confrontare i risultati tra i risultati (ad esempio, campioni sani e infetti). La normalizzazione è necessaria anche per eseguire la co-espressione e il grado molecolare delle analisi di perturbazione.
    1. Accedere alla cartella Scripts utilizzando la riga di comando:
      cd /home/transcriptome-pipeline/scripts
    2. Normalizzare l'espressione genica. Per questo, esegui la riga di comando:
      Rscript normalizza i campioni. R
      NOTA: l'espressione dei conteggi non elaborati, in questo esperimento, è stata normalizzata utilizzando i metodi TMM (Trimmed Mean of M-values) e Count Per Million (CPM). Questo passaggio mira a rimuovere le differenze nell'espressione genica dovute all'influenza tecnica, eseguendo la normalizzazione delle dimensioni della libreria. I risultati verranno salvati nella cartella /home/transcriptome-pipeline/countreads.

4. Geni differenzialmente espressi e geni co-espressi

  1. Identificare i geni differenzialmente espressi utilizzando il pacchetto EdgeR open source. Ciò comporta la ricerca di geni la cui espressione è superiore o inferiore rispetto al controllo.
    1. Accedere alla cartella Scripts utilizzando la riga di comando:
      cd /home/transcriptome-pipeline/scripts
    2. Per identificare il gene differenzialmente espresso, eseguire lo script DEG_edgeR R utilizzando la riga di comando:
      Rscript DEG_edgeR.R
      NOTA: I risultati contenenti i geni differenzialmente espressi verranno salvati nella cartella /home/transcriptome-pipeline/results/degs. I dati possono essere trasferiti su un personal computer.
  2. Scaricare i dati dal contenitore csblusp/transcriptome.
    1. Trasferire i dati elaborati dalla pipeline /home/transcriptome alla cartella /opt/transferdata (computer locale).
    2. Copiare tutti i file nel computer locale eseguendo la riga di comando:
      cp -rf /home/transcriptome-pipeline/risultati /opt/transferdata/pipeline
      cp -rf /home/transcriptome-pipeline/data /opt/transferdata/pipeline
      NOTA: ora passare al computer locale per assicurarsi che tutti i risultati, i set di dati e i dati siano disponibili per il download nel percorso host.
  3. Identificare i moduli di co-espressione.
    1. Accedere al sito Web Co-Expression Modules Identification Tool (CEMiTool) (Tabella di
      Materiali      ). Questo strumento identifica i moduli di coespressione dai set di dati di espressione forniti dagli utenti. Nella pagina principale, fai clic su Esegui in alto a destra. Si aprirà una nuova pagina per caricare il file di espressione.
    2. Fai clic su Scegli file sotto la sezione File di espressione e carica la matrice di espressione genica normalizzata "tmm_expression.tsv" dal percorso host.
      NOTA: Passaggio 4.4. non è obbligatorio.
  4. Esplora il significato biologico dei moduli di co-espressione.
    1. Fare clic su Scegli file nella sezione Fenotipi di esempio e caricare il file con fenotipi di esempio metadata_cemitool.tsv dal passaggio Scarica dati 4.2.2. eseguire un'analisi di arricchimento del set genico (GSEA).
    2. Premere Scegli file nella sezione Interazioni geniche per caricare un file con interazioni geniche (cemitool-interactions.tsv). È possibile utilizzare il file delle interazioni geniche fornito come esempio da webCEMiTool. Le interazioni possono essere interazioni proteina-proteina, fattori di trascrizione e i loro geni trascritti o vie metaboliche. Questo passaggio produce una rete di interazione per ogni modulo di co-espressione.
    3. Fare clic su Scegli file nella sezione Set genetici per caricare un elenco di geni funzionalmente correlati in un file in formato GMT (Gene Matrix Transposed). Il file Gene Set consente allo strumento di eseguire l'analisi di arricchimento per ciascun modulo di co-espressione, ovvero un'analisi di sovrarappresentazione (ORA).
      NOTA: questo elenco di geni può comprendere percorsi, termini GO o geni bersaglio di miRNA. Il ricercatore può utilizzare i moduli di trascrizione del sangue (BTM) come set genetici per questa analisi. Il file BTM (BTM_for_GSEA.gmt).
  5. Impostare i parametri per l'esecuzione di analisi di co-espressione e ottenere i relativi risultati.
    1. Quindi espandere la sezione Parametro , facendo clic sul segno più per visualizzare i parametri predefiniti. Se necessario, modificarli. Seleziona la casella Applica VST .
    2. Scrivi l'e-mail nella sezione Email per ricevere i risultati come email. Questo passaggio è facoltativo.
    3. Premere il pulsante Esegui CEMiTool .
    4. Scarica il report di analisi completo facendo clic su Scarica report completo in alto a destra. Scaricherà un file compresso cemitool_results.zip.
    5. Estrarre il contenuto del cemitool_results.zip con WinRAR.
      NOTA: la cartella con il contenuto estratto comprende diversi file con tutti i risultati dell'analisi e i relativi parametri stabiliti.

5. Determinazione del grado molecolare di perturbazione dei campioni

  1. Molecular Degree of Perturbation (MDP) versione web.
    1. Per eseguire MDP, accedere al sito Web MDP (Table of Materials). MDP calcola la distanza molecolare di ciascun campione dal riferimento. Fare clic sul pulsante Esegui .
    2. Nel collegamento Scegli file caricare il file di espressione tmm_expression.tsv. Quindi, caricare il file di dati fenotipico metadata.tsv dal passaggio Scarica dati 4.2.2. È anche possibile inviare un file di annotazione del percorso in formato GMT per calcolare il punteggio di perturbazione dei percorsi associati alla malattia.
    3. Una volta caricati i dati, definire la colonna Classe che contiene le informazioni fenotipiche utilizzate dall'MDP. Definire quindi la classe di controllo selezionando l'etichetta corrispondente alla classe di controllo.
      NOTA: esistono alcuni parametri facoltativi che influiscono sul modo in cui vengono calcolati i punteggi del campione. Se necessario, l'utente è in grado di modificare il metodo medio delle statistiche, la deviazione standard e la percentuale massima dei geni perturbati.
    4. Successivamente, premi il pulsante Esegui MDP e verranno visualizzati i risultati MDP. L'utente può scaricare le figure facendo clic sul diagramma di download in ogni grafico, nonché sul punteggio MDP sul pulsante Scarica file di punteggio MDP .
      NOTA: in caso di domande su come inviare i file o su come funziona MDP, basta consultare le pagine Web Tutorial e Informazioni.

6. Analisi dell'arricchimento funzionale

  1. Creare un elenco di DEG down-regulated e un altro di DEG up-regulated. I nomi dei geni devono essere secondo i simboli del gene Entrez. Ogni gene della lista deve essere posizionato su una riga.
  2. Salva gli elenchi dei geni nel formato txt o tsv.
  3. Accedi al sito Web di Enrichr (Table of Materials) per eseguire l'analisi funzionale.
  4. Seleziona l'elenco dei geni facendo clic su Scegli file. Selezionare uno degli elenchi DEI GRUPPI di investimento e premere il pulsante Invia .
  5. Fare clic su Pathways nella parte superiore della pagina Web per eseguire l'analisi dell'arricchimento funzionale con l'approccio ORA.
  6. Scegliere un database di percorsi. Il database dei percorsi "Reactome 2016" è ampiamente utilizzato per ottenere il significato biologico dei dati umani.
  7. Fare nuovamente clic sul nome del database dei percorsi. Seleziona Grafico a barre e controlla se è ordinato in base alla classificazione del valore p. In caso contrario, fare clic sul grafico a barre fino a quando non viene ordinato per valore p. Questo grafico a barre include i primi 10 percorsi in base ai valori p.
  8. Premere il pulsante Configurazione e selezionare il colore rosso per l'analisi dei geni up-regulated o il colore blu per l'analisi dei geni down-regulated. Salva il grafico a barre in diversi formati facendo clic su svg, png e jpg.
  9. Selezionare Tabella e fare clic su Esporta voci nella tabella in basso a sinistra del grafico a barre per ottenere i risultati dell'analisi di arricchimento funzionale in un file txt.
    NOTA: Questo file di risultati di arricchimento funzionale comprende in ogni riga il nome di un percorso, il numero di geni sovrapposti tra l'elenco DEG presentato e il percorso, il valore p, il valore p aggiustato, l'odds ratio, il punteggio combinato e il simbolo genetico dei geni presenti nell'elenco DEG che partecipano al percorso.
  10. Ripetere gli stessi passaggi con gli altri elenchi DIDG.
    NOTA: L'analisi con DEG down-regulated fornisce percorsi arricchiti per geni down-regolati e l'analisi con geni up-regolati fornisce percorsi arricchiti per geni up-regolati.

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Risultati

L'ambiente di calcolo per le analisi del trascrittoma è stato creato e configurato sulla piattaforma Docker. Questo approccio consente agli utenti Linux principianti di utilizzare sistemi terminali Linux senza conoscenze di gestione a priori. La piattaforma Docker utilizza le risorse del sistema operativo host per creare un contenitore di servizi che include strumenti specifici per gli utenti (Figura 1B). È stato creato un contenitore basato sulla distribuzione Ubuntu 20.04 del sistema opera...

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Discussione

La preparazione delle librerie di sequenziamento è un passo cruciale per rispondere alle domande biologiche nel miglior modo possibile. Il tipo di trascrizioni di interesse dello studio guiderà quale tipo di libreria di sequenziamento sarà scelta e guiderà le analisi bioinformatiche. Ad esempio, dal sequenziamento di un agente patogeno e dell'interazione ospite, in base al tipo di sequenziamento, è possibile identificare sequenze da entrambi o solo dai trascritti dell'ospite.

Le apparecchiatur...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

HN è finanziato da FAPESP (numeri di sovvenzione: #2017/50137-3, 2012/19278-6, 2018/14933-2, 2018/21934-5 e 2013/08216-2) e CNPq (313662/2017-7).

Siamo particolarmente grati alle seguenti sovvenzioni per i borsisti: ANAG (FAPESP Process 2019/13880-5), VEM (FAPESP Process 2019/16418-0), IMSC (FAPESP Process 2020/05284-0), APV (FAPESP Process 2019/27146-1) e, RLTO (CNPq Process 134204/2019-0).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CEMiToolComputational Systems Biology Laboratory1.12.2Scoperta e analisi di moduli genici di co-espressione in modo completamente automatico, fornendo al contempo un rapporto HTML di facile utilizzo con grafici di alta qualità.
EdgeRBioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])3.30.3Analisi dell'espressione differenziale dei profili di espressione di RNA-seq con replicazione biologica
EnhancedVolcanoBioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])1.6.0Grafici vulcanici pronti per la pubblicazione con colorazione ed etichettatura migliorate
FastQCBabraham Bioinformatics0.11.9Mira a fornire un modo semplice per eseguire alcuni controlli di qualità sui dati di sequenza grezzi provenienti dal sequenziamento ad alto rendimento
FeatureCountsBioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research2.0.0Assegna letture di sequenziamento mappate a caratteristiche genomiche specificate
MDP Computational Systems Biology Laboratory1.8.0Molecular Degree of Perturbation calcola i punteggi per i campioni di dati del trascrittoma in base alla loro perturbazione dai controlli
RR Core Group4.0.3Linguaggio di programmazione e ambiente software libero per il calcolo statistico e la grafica
STARBioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research2.7.6aAllineatore progettato per affrontare in modo specifico molte delle sfide della mappatura dei dati RNA-seq utilizzando una strategia per tenere conto degli allineamenti giuntati
Bowtie2Johns Hopkins University2.4.2Strumento ultraveloce ed efficiente in termini di memoria per allineare le letture di sequenziamento a lunghe sequenze di riferimento
TrimmomaticTHE USADEL LAB0.39Attività di sequenza dell'adattatore di rifilatura per dati Illumina paired-end e single-ended
Scarica DockerDocker20.10.2Creare un ambiente bioinformatico riproducibile e prevedibile (https://docs.docker.com/get-docker/)
WSL2-KernelWindowsNAhttps://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel
Get Docker LinuxDockerNAhttps://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/
Docker Linux RepositoryDockerNAhttps://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository
Sito MDPLaboratorio di Biologia dei Sistemi ComputazionaliNAhttps://mdp.sysbio.tools
Enrichr Sito WebMaayanLabNAhttps://maayanlab.cloud/Enrichr/
webCEMiToolLaboratorio di Biologia dei Sistemi ComputazionaliNAhttps://cemitool.sysbio.tools/
gProfilerGruppo di Bioinformatica, Algoritmica e Data MiningNAhttps://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost
goseqBioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])NAhttp://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html
SRA NCBI studioNCBINAhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/

Riferimenti

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  20. Chen, E. Y., et al. Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool. BMC Bioinformatics. 14, 128(2013).
  21. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  22. Raudvere, U., et al. g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update). Nucleic Acids Research. 47, 191-198 (2019).
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