Analisi del trascrittoma ad alto rendimento per indagare le interazioni ospite-patogeno

Summary

Il protocollo qui presentato descrive una pipeline completa per analizzare i dati del trascrittoma di sequenziamento dell'RNA dalle letture grezze all'analisi funzionale, compresi i passaggi di controllo della qualità e pre-elaborazione per approcci analitici statistici avanzati.

Abstract

Gli agenti patogeni possono causare un'ampia varietà di malattie infettive. I processi biologici indotti dall'ospite in risposta all'infezione determinano la gravità della malattia. Per studiare tali processi, i ricercatori possono utilizzare tecniche di sequenziamento ad alto rendimento (RNA-seq) che misurano i cambiamenti dinamici del trascrittoma dell'ospite in diverse fasi dell'infezione, esiti clinici o gravità della malattia. Questa indagine può portare a una migliore comprensione delle malattie, oltre a scoprire potenziali bersagli e trattamenti farmacologici. Il protocollo qui presentato descrive una pipeline completa per analizzare i dati di sequenziamento dell'RNA dalle letture grezze all'analisi funzionale. La pipeline è suddivisa in cinque fasi: (1) controllo di qualità dei dati; (2) mappatura e annotazione dei geni; (3) analisi statistica per identificare geni differenzialmente espressi e geni co-espressi; (4) determinazione del grado molecolare della perturbazione dei campioni; e (5) analisi funzionale. Il passaggio 1 rimuove gli elementi tecnici che potrebbero influire sulla qualità delle analisi a valle. Nel passaggio 2, i geni vengono mappati e annotati secondo i protocolli standard della libreria. L'analisi statistica nella fase 3 identifica i geni che sono differenzialmente espressi o co-espressi in campioni infetti, rispetto a quelli non infetti. La variabilità del campione e la presenza di potenziali valori anomali biologici sono verificate utilizzando l'approccio del grado molecolare di perturbazione nella fase 4. Infine, l'analisi funzionale nella fase 5 rivela i percorsi associati al fenotipo della malattia. La pipeline presentata mira a supportare i ricercatori attraverso l'analisi dei dati RNA-seq da studi di interazione ospite-patogeno e guidare futuri esperimenti in vitro o in vivo , che sono essenziali per comprendere il meccanismo molecolare delle infezioni.

Introduction

Gli arbovirus, come la dengue, la febbre gialla, la chikungunya e la zika, sono stati ampiamente associati a diversi focolai endemici e sono emersi come uno dei principali agenti patogeni responsabili dell'infezione umana negli ultimi ^decenni1,2. Gli individui infettati dal virus chikungunya (CHIKV) hanno spesso febbre, mal di testa, eruzione cutanea, poliartralgia e artrite3,4,5. I virus possono sovvertire l'espressione genica della cellula e influenzare varie vie di segnalazione dell'ospite. Recentemente, gli studi ....

Protocol

I campioni utilizzati in questo protocollo sono stati approvati dai comitati etici sia del Dipartimento di Microbiologia dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo che dell'Università Federale di Sergipe (Protocolli: 54937216.5.0000.5467 e 54835916.2.0000.5546, rispettivamente).

1. Installazione desktop Docker

NOTA: i passaggi per preparare l'ambiente Docker sono diversi tra i sistemi operativi (OS). Pertanto, gli utenti Mac devono seguire i passaggi elencati come 1.1, gli utenti Linux devono seguire i passaggi elencati come 1.2 e gli utenti Windows devono seguire i passaggi e....

Results

L'ambiente di calcolo per le analisi del trascrittoma è stato creato e configurato sulla piattaforma Docker. Questo approccio consente agli utenti Linux principianti di utilizzare sistemi terminali Linux senza conoscenze di gestione a priori. La piattaforma Docker utilizza le risorse del sistema operativo host per creare un contenitore di servizi che include strumenti specifici per gli utenti (Figura 1B). È stato creato un contenitore basato sulla distribuzione Ubuntu 20.04 del sistema opera.......

Discussion

La preparazione delle librerie di sequenziamento è un passo cruciale per rispondere alle domande biologiche nel miglior modo possibile. Il tipo di trascrizioni di interesse dello studio guiderà quale tipo di libreria di sequenziamento sarà scelta e guiderà le analisi bioinformatiche. Ad esempio, dal sequenziamento di un agente patogeno e dell'interazione ospite, in base al tipo di sequenziamento, è possibile identificare sequenze da entrambi o solo dai trascritti dell'ospite.

Le apparecchiatur.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CEMiTool	Computational Systems Biology Laboratory	1.12.2	Scoperta e analisi di moduli genici di co-espressione in modo completamente automatico, fornendo al contempo un rapporto HTML di facile utilizzo con grafici di alta qualità.
EdgeR	Bioconductor (Maintainer: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])	3.30.3	Analisi dell'espressione differenziale dei profili di espressione di RNA-seq con replicazione biologica
EnhancedVolcano	Bioconductor (Maintainer: Kevin Blighe [kevin at clinicalbioinformatics.co.uk])	1.6.0	Grafici vulcanici pronti per la pubblicazione con colorazione ed etichettatura migliorate
FastQC	Babraham Bioinformatics	0.11.9	Mira a fornire un modo semplice per eseguire alcuni controlli di qualità sui dati di sequenza grezzi provenienti dal sequenziamento ad alto rendimento
FeatureCounts	Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research	2.0.0	Assegna letture di sequenziamento mappate a caratteristiche genomiche specificate
	MDP Computational Systems Biology Laboratory	1.8.0	Molecular Degree of Perturbation calcola i punteggi per i campioni di dati del trascrittoma in base alla loro perturbazione dai controlli
R	R Core Group	4.0.3	Linguaggio di programmazione e ambiente software libero per il calcolo statistico e la grafica
STAR	Bioinformatics Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research	2.7.6a	Allineatore progettato per affrontare in modo specifico molte delle sfide della mappatura dei dati RNA-seq utilizzando una strategia per tenere conto degli allineamenti giuntati
Bowtie2	Johns Hopkins University	2.4.2	Strumento ultraveloce ed efficiente in termini di memoria per allineare le letture di sequenziamento a lunghe sequenze di riferimento
Trimmomatic	THE USADEL LAB	0.39	Attività di sequenza dell'adattatore di rifilatura per dati Illumina paired-end e single-ended
Scarica Docker	Docker	20.10.2	Creare un ambiente bioinformatico riproducibile e prevedibile (https://docs.docker.com/get-docker/)
WSL2-Kernel	Windows	NA	https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel
Get Docker Linux	Docker	NA	https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/
Docker Linux Repository	Docker	NA	https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository
Sito MDP	Laboratorio di Biologia dei Sistemi Computazionali	NA	https://mdp.sysbio.tools
Enrichr Sito Web	MaayanLab	NA	https://maayanlab.cloud/Enrichr/
webCEMiTool	Laboratorio di Biologia dei Sistemi Computazionali	NA	https://cemitool.sysbio.tools/
gProfiler	Gruppo di Bioinformatica, Algoritmica e Data Mining	NA	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost
goseq	Bioconductor (Maintainer: Matthew Young [my4 at sanger.ac.uk])	NA	http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html
SRA NCBI studio	NCBI	NA	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/