Articolo metodologico

Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata

DOI:

10.3791/62334

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17 febbraio 2022

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1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive la metodologia per il tracciamento non invasivo delle cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico in vivo con una piattaforma clinicamente disponibile.

Abstract

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Le cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico (CAR) hanno mostrato risultati senza precedenti in studi clinici registrativi per pazienti con tumori maligni delle cellule B o mieloma multiplo (MM). Tuttavia, numerosi ostacoli limitano l'efficacia e vietano l'uso diffuso di terapie con cellule T CAR a causa dello scarso traffico e infiltrazione nei siti tumorali e della mancanza di persistenza in vivo. Inoltre, le tossicità potenzialmente letali, come la sindrome da rilascio di citochine o la neurotossicità, sono le principali preoccupazioni. L'imaging e il tracciamento efficienti e sensibili delle cellule T CAR consentono la valutazione del traffico, dell'espansione e della caratterizzazione in vivo delle cellule T e consentono lo sviluppo di strategie per superare gli attuali limiti della terapia con cellule T CAR. Questo documento descrive la metodologia per incorporare il symporter di ioduro di sodio (NIS) nelle cellule T CAR e per l'imaging delle cellule T CAR utilizzando la tomografia ad emissione di tetrafluoroborato-positrone [18F] tetrafluoroborato ([18F] TFB-PET) in modelli preclinici. I metodi descritti in questo protocollo possono essere applicati ad altri costrutti CAR e geni bersaglio oltre a quelli utilizzati per questo studio.

Introduzione

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La terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico T (CAR T) è un approccio rapidamente emergente e potenzialmente curativo nelle neoplasie ematologiche1,2,3,4,5,6. Risultati clinici straordinari sono stati riportati dopo la terapia con cellule T CAR T (CART19) o CON l'antigene di maturazione delle cellule B (BCMA) CAR T2. Ciò ha portato all'approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti delle cellule CART19 per il linfoma aggressivo a cellule B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 e lisocabtagene maraleucel)7, leucemia linfoblastica acuta (Tisa-Cel)5,8, linfoma a cellule del mantello (brexucabtagene autoleuce)9 e linfoma follicolare (Axi-Cel)10 . Più recentemente, la FDA ha approvato la terapia con cellule T CAR diretta da BCMA in pazienti con mieloma multiplo (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Inoltre, la terapia con cellule T CAR per la leucemia linfocitica cronica (LLC) è in fase avanzata di sviluppo clinico e dovrebbe ricevere l'approvazione della FDA entro i prossimi tre anni1.

Nonostante i risultati senza precedenti della terapia con cellule T CAR, il suo uso diffuso è limitato da 1) insufficiente espansione in vivo delle cellule T CAR o scarso traffico verso i siti tumorali, che porta a tassi più bassi di risposta duratura12,13 e 2) lo sviluppo di eventi avversi potenzialmente letali, tra cui la sindrome da rilascio di citochine (CRS)14,15 . I segni distintivi della CRS includono non solo l'attivazione immunitaria con conseguente livelli elevati di citochine/chemochine infiammatorie, ma anche la massiccia proliferazione delle cellule T dopo infusione di cellule T CAR15,16. Pertanto, lo sviluppo di una strategia convalidata di livello clinico per l'immagine delle cellule T CAR in vivo consentirebbe 1) il tracciamento delle cellule T CAR in tempo reale in vivo per monitorare il loro traffico verso i siti tumorali e scoprire potenziali meccanismi di resistenza e 2) il monitoraggio dell'espansione delle cellule T CAR e potenzialmente prevedere le loro tossicità come lo sviluppo di CRS.

Le caratteristiche cliniche della CRS lieve sono febbre alta, affaticamento, mal di testa, eruzione cutanea, diarrea, artralgia, mialgia e malessere. Nella CRS più grave, i pazienti possono sviluppare tachicardia/ipotensione, perdita capillare, disfunzione cardiaca, insufficienza renale/epatica e coagulazione intravascolare disseminata17,18. In generale, il grado di elevazione delle citochine, tra cui interferone-gamma, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi, interleuchina (IL)-10 e IL-6, ha dimostrato di essere correlato alla gravità dei sintomi clinici17,19. Tuttavia, l'ampia applicazione del monitoraggio delle citochine sieriche "in tempo reale" per prevedere la CRS è difficile a causa dell'elevato costo e della disponibilità limitata. Per sfruttare le caratteristiche benefiche della terapia con cellule T CAR, l'imaging non invasivo delle cellule T adottive può essere potenzialmente utilizzato per prevedere l'efficacia, la tossicità e la ricaduta dopo l'infusione di cellule T CAR.

Diversi ricercatori hanno sviluppato strategie per utilizzare l'imaging a base di radionuclidi con tomografia ad emissione di positroni (PET) o tomografia computerizzata a emissione di singolo fotone (SPECT), che fornisce alta risoluzione e alta sensibilità20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 per il visualizzazione e monitoraggio in vivo del traffico di cellule T CAR. Tra queste strategie di imaging basate su radionuclidi, il symporter di ioduro di sodio (NIS) è stato sviluppato come modalità sensibile per l'immagine di cellule e virus utilizzando scansioni PET31,32. L'imaging delle cellule T NIS+CAR con [18F]TFB-PET è una tecnologia sensibile, efficiente e conveniente per valutare e diagnosticare l'espansione, il traffico e la tossicità delle cellule T CAR30. Questo protocollo descrive 1) lo sviluppo di cellule T NIS+CAR attraverso la doppia trasduzione ad alta efficacia e 2) una metodologia per l'imaging di cellule T NIS+CAR con scansione [18F]TFB-PET. Le cellule T BCMA-CAR per MM sono utilizzate come modello proof-of-concept per descrivere NIS come reporter per l'imaging delle cellule T CAR. Tuttavia, queste metodologie possono essere applicate a qualsiasi altra terapia con cellule T CAR.

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Protocollo

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Il protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board della Mayo Clinic, del Comitato istituzionale per la biosicurezza e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic.

1. Produzione di cellule T NIS+ BCMA-CAR

NOTA: Questo protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board della Mayo Clinic (IRB 17-008762) e dell'Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04).

  1. Produzione di BCMA-CAR, NIS e lentivirus codificanti per la proteina fluorescente verde luciferasi (GFP).
    NOTA: Un costrutto BCMA-CAR di seconda generazione è stato sintetizzato de novo (vedi la Tabella dei materiali) e clonato in un vettore lentivirale di terza generazione sotto il controllo di un promotore alfa (EF-1α) del fattore di allungamento-1. Il costrutto BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) includeva la costimulazione 4-1BB e un frammento variabile a catena singola (scFv) derivato da un clone di anticorpi BCMA anti-umani C11D5.333,34. Il NIS è sotto il controllo del promotore EF-1α e si lega al gene di resistenza alla puromicina tramite peptidi auto-scissioni (P2A). Il vettore lentivirale che codifica per la luciferasi-GFP (vedi la Tabella dei materiali) viene utilizzato per trasdurre le cellule tumorali, che poi esprimono GFP e luciferasi.
    1. Preparare plasmidi vettori lentivirali: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) e pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      NOTA: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro e pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro contengono il gene della resistenza alla puromicina. Pertanto, le cellule trasdotte da NIS o luciferasi-GFP possono essere selezionate con 1 μg/mL o 2 μg/mL di puromicina dicloridrato, come descritto in precedenza14,35.
    2. Seminare 20 × 106 di cellule 293T in un matraccio T175 e incubare per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO2. Confermare che le cellule 293T sono distribuite uniformemente sul pallone al 70-90% di confluenza mediante visualizzazione diretta al microscopio.
    3. Preparare un mix principale di 15 μg del vettore di espressione (ad esempio, CAR, NIS o DNA lineare luciferasi-GFP), 7 μg del vettore di inviluppo (VSV-G) e 18 μg del vettore di imballaggio (gag, pol, rev e tat). Diluire la miscela master di DNA in 4,5 mL del mezzo di trasfezione, quindi aggiungere 111 μL del reagente pre-complessante (Miscela A).
    4. Preparare un nuovo tubo e diluire 129 μL del reagente di trasfezione liposomiale in 4,5 mL del mezzo di trasfezione (Miscela B).
    5. Unire le miscele A e B e scorrere il tubo per mescolare il contenuto. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
    6. Dopo l'incubazione, è sufficiente aspirare il surnatante cellulare senza staccare le cellule e aggiungere 16 ml di un mezzo di crescita contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina-glutammina. Quindi, aggiungere la miscela di miscele A e B su celle 293T a goccia. Infine, incubare le cellule trasfettate a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
    7. Nei giorni 1 e 2 post-trasfezione, raccogliere il surnatante di 293T, girare a 900 × g per 10 minuti e filtrare attraverso un filtro in nylon da 0,45 μm. Concentrare il filtrato a 24 e 48 ore per ultracentrifugazione a 112.700 × g per 2 ore e congelare a -80 °C.
  2. Ex-vivo Isolamento delle cellule T (Figura 1)
    NOTA: Eseguire tutti i lavori di coltura cellulare in un armadio a flusso laminare utilizzando la tecnica asettica e i dispositivi di protezione individuale. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) vengono raccolte dal sangue di un donatore volontario sano raccolto durante l'aferesi36. Lo screening dei patogeni è stato eseguito su cellule umane utilizzate in questo studio.
    1. Utilizzare la tecnica del gradiente di densità standard per isolare i PBMC.
      1. Aggiungere delicatamente 15 mL di gradiente di densità medio (densità di 1,077 g/mL) (contenente alfa-D-glucopiranoside, beta-D-fruttofuranosil omopolimero e 3-(acetilammino)-5-(acetilmetilammino)-sale monosodico dell'acido alfa-D-4,6-triodobenzoico) a un tubo di separazione a gradiente di densità di 50 ml senza creare bolle d'aria (vedere la tabella dei materiali).
      2. Per evitare l'intrappolamento cellulare, diluire il campione di sangue con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 0,2 g/L di cloruro di potassio, 0,2 g/L di fosfato di potassio monobasico, 8 g/L di cloruro di sodio e 1,15 g/L di fosfato di sodio bibasico) contenente il 2% di FBS con un rapporto di volume 1:1. Trasferire delicatamente il sangue diluito sulla parte superiore del mezzo gradiente di densità senza rompere l'interfaccia tra i due. Spin down a 1.200 × g per 10 minuti a RT.
        NOTA: un tubo di separazione del gradiente di densità di 50 mL può essere utilizzato per l'isolamento di 4-17 mL di un campione di sangue. Il tubo di separazione del gradiente di densità di 50 ml (vedi tabella dei materiali) utilizzato in questo protocollo non richiede il "brake off" durante la centrifugazione. Tuttavia, quando si utilizzano tubi standard da 50 ml, il freno deve essere spento e richiede una centrifugazione di 30 minuti.
      3. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo conico da 50 mL, lavare con PBS + 2% FBS riempiendo fino a 50 mL, quindi girare verso il basso a 300 × g per 8 minuti a RT.
      4. Aspirare il surnatante e risospendere le celle pellettate in 50 ml di PBS + 2% FBS. Contare il numero di celle e quindi girare verso il basso a 300 × g per 8 minuti a RT. Ripetere il passaggio precedente per un totale di 2 lavaggi.
    2. Aspirare il surnatante e risospesciare le cellule pellettate ad una concentrazione di 50 × 106 cellule/ml con PBS + 2% FBS.
    3. Eseguire l'isolamento delle cellule T dai PBMC utilizzando un kit di perline magnetiche a selezione negativa.
      NOTA: Un kit di selezione negativo ideale include perline magnetiche attaccate agli anticorpi contro gli antigeni espressi su cellule diverse dalle cellule T. Un kit comunemente usato contiene anticorpi coniugati a perline magnetiche contro CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 e CD16 (vedi Tabella dei materiali).
      1. Trasferire i PBMC in un tubo a fondo tondo in polistirene da 14 mL. Quindi, posizionare i PBMC e il cocktail di anticorpi di selezione negativa in un separatore cellulare completamente automatizzato ed eseguire l'isolamento delle cellule T secondo il protocollo del produttore.
  3. Stimolazione delle cellule T ed espansione delle cellule T (Figura 1)
    1. Per coltivare le cellule T isolate, preparare il mezzo di espansione delle cellule T (MTC) realizzato con mezzo cellulare ematopoietico privo di siero integrato con il 10% di albumina sierica umana e l'1% di penicillina-streptomicina-glutammina14. Dopo l'isolamento delle cellule T, contare le cellule e la coltura ad una concentrazione di 2 × 106 cellule / mL con MTC.
    2. Lavare le perline anti-CD3/CD28 tre volte con TCM prima di coltivarle con cellule T.
      1. Mescolare il flaconcino contenente le perline ruotando. Quindi, pipettare il volume richiesto di perline (3:1 perline:cellule) (ad esempio, quando si stimolano 1,0 × 106 cellule di cellule T, utilizzare 3,0 × 106 di perline anti-CD3/CD28) in un tubo microcentrifuga sterile (1,5 ml) e risospesso in 1 mL di MTC.
    3. Posizionare il tubo microcentrifuga con le perline su un magnete per 1 minuto e aspirare il surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete e risospesciare le perline lavate in 1 mL di MTC. Ripetere i due passaggi precedenti per un totale di 3 lavaggi.
    4. Risospendare le perline in 1 mL di MTC e trasferirle alle cellule T. Quindi, diluire le cellule T ad una concentrazione finale di 1,0 × 106 cellule / mL con MTC. Trasferire la sospensione di cellule T/perline in una piastra a 6 pozzetti trattata con colture tissutali e posizionarla nell'incubatore (37 °C, 5% CO2).
  4. Titolazione dei lentivirus (Figura 2)
    1. Preparare le cellule T per il test di titolazione. Assicurarsi che siano disponibili circa 1,0 x 106 cellule per titolare un tipo di virus.
    2. Stimolare le cellule T come descritto al paragrafo 1.3.2.
    3. La piastra 1.0 × 105 cellule di cellule T stimolate in una piastra a 96 pozzetti (piastra del titolo) e incubare a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore (Figura 2A). Isolare e stimolare le cellule T come descritto al paragrafo 1.2.
    4. Preparare una piastra di diluizione (piastra a 96 pozzetti) aggiungendo 100 μL di MTC nei pozzetti delle colonne designate e dei pozzetti di controllo non trasdotti (Figura 2B).
    5. Scongelare una fiala di particelle lentivirali sul ghiaccio e pipettare delicatamente su e giù per mescolare bene. Trasferire 50 μL del surnatante virale nei pozzetti della colonna 6 della piastra a 96 pozzetti (diluizione 3) (Figura 2B). Pipetta su e giù per mescolare bene.
    6. Eseguire diluizioni seriali (diluizione seriale 2 volte): trasferire 50 μL dal pozzo A6 al pozzo B6 e poi 50 μL dal pozzo B6 al pozzo C6; ripetere fino a G6. Quindi, aggiungere 50 μL del virus diluito alla piastra del titolo (Figura 2B).
    7. Incubare la piastra del titolo a 37 °C, 5% CO2 per 48 ore e determinare le percentuali di cellule CAR-, NIS-, o GFP-positive mediante citometria a flusso (Figura 2C).
      1. Lavare i pozzetti ruotando la piastra del titolo due volte a 650 × g a 4 °C per 3 minuti.
      2. Macchiare le cellule T trasdotte come descritto nei passaggi da 1.5.3 a 1.5.9.
      3. Determinare i titoli in base alle percentuali di cellule CAR-, NIS- o GFP-positive usando la formula (1):
        Titoli = Percentuale di cellule T BCMA-CAR+ o NIS+ × conta delle cellule T alla trasduzione × diluizione / volume specifico (1)
  5. Trasduzione di lentivirus e NIS+Espansione delle cellule T BCMA-CAR
    1. Da ventiquattro a 48 ore dopo la stimolazione delle cellule T, eseguire la trasduzione lentivirale sulle cellule T stimolate (le cellule T dovrebbero formare cluster).
      1. Scongelare i lentivirus congelati che codificano CAR o NIS a 4 °C.
      2. Mescolare bene le cellule T stimolate per rompere i cluster e aggiungere semplicemente il virus appena scongelato a una molteplicità di infezione (MOI) di 5,0 (quando si trasducono 1,0 × 106 cellule T, utilizzare 5,0 × 106 di lentiviri). Incubare le cellule trasdotte a 37 °C, 5% CO2.
      3. Nei giorni 3, 4 e 5, contare le cellule T trasdotte utilizzando un ematocitometro37 o un contatore cellulare completamente automatizzato38 e regolare la concentrazione cellulare a 1,0 × 106 cellule / mL aggiungendo MTC fresca e preriscaldata. Per le cellule T trasdotte da NIS che trasportano il gene di resistenza alla puromicina, trattare le cellule con 1 μg / mL di puromicina dicloridrato nei giorni 3, 4 e 5.
    2. Il giorno 6, rimuovere le perle anti-CD3/CD28 dalle cellule T trasdotte (dal passo 1.3.4) mescolando bene per rompere i cluster di cellule T e mettendole in un magnete per 1 minuto. Quindi, è sufficiente riposizionare le cellule T trasdotte raccolte in coltura ad una concentrazione di 1,0 × 106 cellule / ml. Dopo aver rimosso le perline dalle cellule T, valutare l'espressione di CAR e NIS mediante citometria a flusso.
      NOTA: Poiché il frammento variabile a catena singola del BCMA-CAR è derivato dal topo, può essere colorato con IgG anti-topo di capra (H + L) coniugato con Alexa Fluor 647. I NIS possono essere rilevati utilizzando ETNL anti-umano [peptide sintetico corrispondente ad aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)]. Questo anticorpo riconosce il C-terminus citosolico di NIS. Pertanto, le cellule T devono essere permeabilizzate prima dell'incubazione con un anticorpo anti-umano NIS.
    3. Eseguire la colorazione superficiale di BCMA-CAR utilizzando IgG anti-topo di capra (H + L).
      1. Prelevare un'aliquota della coltura (ad esempio, 50.000 cellule T) e lavare con tampone di flusso (PBS, 1% FBS e 1% azide di sodio). Successivamente, risospese le cellule con 50 μL di tampone di flusso e colorare le cellule con 1 μL di anticorpo anti-topo di capra per rilevare l'espressione di CAR e 0,3 μL di acqua morta viva per escludere le cellule morte.
      2. Incubare per 15 minuti al buio a RT, lavare le cellule aggiungendo 150 μL di tampone di flusso e centrifugare le celle a 650 × g per 3 minuti a 4 °C.
    4. Dopo la colorazione CAR superficiale, fissare e permeabilizzare le cellule aggiungendo 100 μL di mezzo di fissazione (PBS con formaldeide al 4,21%) e incubare per 20 minuti a 4 °C. Lavare le cellule due volte con 100 μL di un tampone che contiene un agente permeabilizzante cellulare come la saponina (650 × g per 3 minuti a 4 °C).
    5. Risospendare le cellule fisse/permeabilizzate in 50 μL di tampone permeabilizzante. Quindi, aggiungere 0,3 ng di anticorpo anti-umano ETNL NIS in 50 μL di tampone di flusso e incubare per 1 ora a 4 °C.
    6. Aggiungere 150 μL di flow buffer e centrifugare le celle a 650 × g per 3 min a 4 °C. Incubare le cellule con 2,5 μL di anticorpo secondario anti-coniglio in 50 μL di flow buffer per 30 min a 4 °C, lavare le cellule aggiungendo 150 μL di flow buffer e centrifugare a 650 × g per 3 min a 4 °C.
    7. Infine, sospendere 200 μL di tampone di flusso ed eseguire la citometria a flusso per determinare l'efficienza di trasduzione (Figura 3A,B).
    8. Il giorno 8, contare e far girare le cellule T a 300 × g per 8 minuti a 4 °C. Risospendare le cellule T con mezzo di congelamento (90% FBS + 10% dimetilsolfossido [DMSO]) ad una concentrazione di 10 × 106/mL, quindi trasferire 1 mL ciascuna a crioviali marcate.
    9. Mettere i flaconcini in un congelatore a -80 °C per 48 ore. Dopo 48 ore (ed entro il giorno 10), trasferire le cellule T in azoto liquido.
      NOTA: vedere la Figura 1 per una panoramica della produzione di cellule T NIS+ CAR. La Figura 3D rappresenta esempi di espansione ex vivo delle cellule T da tre diversi donatori.

2. Imaging delle cellule T NIS+ BCMA-CAR con scansione [ 18F]TFB-PET

NOTA: Questo protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic (IACUC A00001767-16), IRB e IBC (Bios00000006.04). OPM-2 è una linea cellulare BCMA+ MM, che viene spesso utilizzata come linea cellulare target per le cellule T BCMA-CAR39,40.

  1. Stabilire cellule di luciferasi + BCMA + OPM-2.
    1. Semina 500.000 cellule OPM-2 in una piastra a 24 pozzetti trattata con colture tissutali. Scongelare il lentivirus che codifica per la luciferasi-GFP a 4 °C.
    2. Aggiungere il virus appena scongelato a un MOI di 3.0 alle cellule OPM-2 e mescolare bene mediante pipettaggio. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, 5% CO2).
    3. Quarantotto ore dopo la trasduzione, aggiungere 2 μg/mL di puromicina per selezionare le cellule trasdotte. Quattro giorni dopo la trasduzione, valutare le cellule GFP-positive (luciferasi-positiva) mediante citometria a flusso (Figura 3E).
  2. Stabilire modelli murini di xenotrapianto BCMA+ OPM-2 (Figura 4).
    1. Contare le cellule di luciferasi + OPM-2 e ruotarle due volte per rimuovere tutto il terreno di coltura cellulare. Risospese le cellule OPM-2 ad una concentrazione di 10 × 106 cellule/mL con PBS.
    2. Il giorno -21, iniettare 100 μL (1,0 × 106 cellule) di cellule di luciferasi + OPM-2 nelle code di topi IMMUNOCOMPROMESSI NOD-SCID IL2rγnull (NSG) di 8-12 settimane (Figura 4).
    3. Il giorno 20 dopo l'iniezione di cellule OPM-2 (giorno -1 dell'iniezione di cellule T CAR), controllare il carico tumorale tramite imaging a bioluminescenza (BLI) (Figura 4).
      NOTA: le cellule OPM-2 formano un tumore a crescita lenta, che di solito richiede 2-3 settimane per attecchirsi.
    4. Somministrare 10 μL/g di D-luciferina a topi xenotrapianto OPM-2 tramite iniezione intraperitoneale (IP). Dopo 10 minuti, eseguire BLI sui topi sotto il 2% di gas isoflurano (Figura 5A). Dopo aver confermato l'attecchimento del tumore, randomizzare i topi in base al carico tumorale.
    5. Il giorno -1 dell'iniezione delle cellule T CAR, scongelare le cellule T NIS+BCMA-CAR e rimuovere il mezzo di congelamento mediante centrifugazione (300 × g, 8 min, 4 °C). Quindi, le cellule risospese con MTC a 2,0 × 106 cellule / mL e incubano durante la notte (37 ° C, 5% CO2).
    6. Il giorno 0, contare e centrifugare le cellule T NIS+BCMA-CAR (300 × g, 8 min, 4 °C). Sospendere le cellule T NIS+BCMA-CAR a 50 × 106 cellule/mL con PBS.
    7. Somministrare 100 μL (5,0 × 106 cellule) di cellule T NIS+BCMA-CAR tramite iniezione della vena della coda ai topi xenotrapianto OPM-2. Nei giorni 7 e 15, immagina i topi usando una scansione PET.
  3. Imaging in vivo delle cellule T NIS+BCMA-CAR utilizzando il modello murino con xenotrapianto BCMA+OPM-2.
    1. Pesare i mouse prima dell'imaging e rimuovere eventuali marchi auricolari metallici per eliminare gli artefatti relativi al metallo.
    2. Preparare [18F]TFB come descritto in precedenza41.
      NOTA: [18F]TFB deve essere prodotto il giorno del suo utilizzo. La purezza radiochimica deve essere >99% e l'attività molare >5 GBq/mmol.
    3. Iniettare 9,25 MBq [18F]TFB per via endovenosa tramite iniezione della vena della coda. Consentire un periodo di assorbimento di ~ 40 minuti per la distribuzione del radiotracciante nel corpo e liberare il sangue.
    4. Anestetizzare il topo usando l'inalazione di isoflurano (2%).
      NOTA: L'isoflurano è l'anestetico inalato preferito in quanto ha un esordio e un recupero rapidi e affidabili.
    5. Prima di anestetizzare il mouse, pulire tutte le superfici della macchina per anestesia con detergenti disinfettanti.
    6. Posizionare il mouse all'interno della camera di induzione. Ruotare il quadrante del vaporizzatore al 2% e attendere che il mouse diventi reclinato e non reattivo entro 1-2 minuti.
    7. Monitorare il mouse per evitare un'anestesia insufficiente o un'eccessiva depressione delle funzioni respiratorie. In breve, pizzicare la punta per confermare l'anestesia insufficiente.
      NOTA: la frequenza respiratoria normale è fino a 180 / min e il tasso di caduta accettabile è del 50%.
    8. Applicare unguento oftalmico per evitare l'essiccazione corneale e traumi.
    9. Acquisire immagini PET/CT 45 minuti dopo l'iniezione con il mouse anestetizzato in una workstation di imaging micro PET/CT (vedere la Tabella dei materiali). Successivamente, acquisire immagini PET statiche per 15 minuti seguite dall'acquisizione di immagini CT per 5 minuti con rotazione a 360 ° e 180 proiezioni a 500 μA, 80 keV e 200 ms di esposizione.
  4. Analisi dei dati di imaging acquisiti
    1. Analizzare le immagini utilizzando il software di elaborazione delle immagini PET (Figura 5B e Video supplementare S1).
    2. Definire il volume di interesse (VOI).
    3. Calcola il valore di assorbimento standardizzato (SUV) utilizzando la formula (2).
      SUV in VOI = Concentrazione di attività in VOI (MBq/mL) × peso corporeo (g) / dose somministrata (MBq) (2)
  5. Conferma del traffico di cellule T NIS+BCMA-CAR verso i siti tumorali con la citometria a flusso
    1. Dopo l'imaging [18F]TFB-PET, riposizionare il mouse nella gabbia. Dopo la cessazione dell'anestesia, monitorare gli animali fino a quando non sono in grado di muoversi in modo mirato e assicurarsi che abbiano accesso al cibo e all'acqua.
    2. Monitorare i topi fino al decadimento del [18F]TFB iniettato. Una volta che il radioisotopo non è rilevabile, eutanasizzare i topi con CO2.
    3. Per l'eutanasia, metti i topi nella gabbia (non più di 5 topi per gabbia).
    4. Esporre i topi alla CO2 fino alla completa cessazione della respirazione in circa 5-10 minuti.
      NOTA: Questo metodo di eutanasia deve essere coerente con le linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali (edizione 2020).
    5. Per garantire la morte dei topi, eseguire la lussazione cervicale afferrando la parte posteriore della testa e la base della coda dell'animale, quindi allontanando le mani l'una dall'altra.
    6. Raccogliere il midollo osseo per confermare che le cellule T NIS+BCMA-CAR trafficano in modo efficiente verso il sito tumorale.
    7. Trasferire i femori e le tibie raccolti in una piastra a 6 pozzetti contenente 5 ml di terreno di coltura cellulare. Rimuovere i muscoli e i tendini dai femori e dalla tibia e tagliare semplicemente entrambe le estremità (sopra le articolazioni) dei femori e della tibia.
    8. Riempire una siringa da insulina con il terreno di coltura cellulare e lavare il midollo osseo sulla piastra a 6 pozzetti. Per i femori, utilizzare aghi da 22 G e siringhe da 5 ml perché il diametro del femore è maggiore di quello della tibia.
    9. Utilizzare l'estremità piatta dello stantuffo per macinare il midollo osseo. Posizionare un filtro cellulare da 70 μm su un tubo conico sterile da 50 ml e filtrare il midollo osseo macinato. Quindi, riempire il tubo con il tampone di flusso e centrifugare il tubo a 300 × g per 8 minuti a 4 °C.
    10. Aspirare il surnatante e risospesciare il midollo osseo con 5 ml di tampone di flusso. Trasferire 200 μL di midollo osseo in una piastra a 96 pozzetti. Centrifugare la piastra a 300 × g per 3 min a 4 °C. Decantare il surnatante e risospescere le cellule con 50 μL di tampone di flusso.
    11. Macchiare il midollo osseo con anticorpi di flusso contro 0,25 μg di CD45 di topo, 0,03 μg di CD45 umano, 0,06 μg di CD3 umano, 0,24 μg di BCMA umano e 0,3 μL di acqua viva / morta. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
    12. Centrifugare la piastra a 300 × g per 3 min a 4 °C. Quindi, aggiungere 200 μL di buffer di flusso ed eseguire sul citometro a flusso (Figura 5C).

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Risultati

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La Figura 1 illustra le fasi di generazione delle cellule T NIS+BCMA-CAR. Il giorno 0, isolare i PBMC e quindi isolare le cellule T mediante selezione negativa. Quindi, stimolare le cellule T con perline anti-CD3 / CD28. Il giorno 1, trasdurre le cellule T con lentivirus NIS e BCMA-CAR. Nei giorni 3, 4 e 5, contare le cellule T e nutrirsi con i mezzi per regolare la concentrazione in modo che sia 1,0 × 106 / ml. Per le cellule T trasdotte da NIS, aggiungere 1 μg/mL di p...

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Discussione

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Questo documento descrive una metodologia per incorporare NIS nelle cellule T CAR e l'imaging infuso di cellule T CAR in vivo attraverso [18F] TFB-PET. Come prova di concetto, le cellule T NIS + BCMA-CAR sono state generate tramite doppia trasduzione. Abbiamo recentemente riferito che l'incorporazione di NIS nelle cellule T CAR non compromette le funzioni e l'efficacia delle cellule T CAR in vivo e consente il traffico e l'espansione delle cellule T CAR30. P...

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Dichiarazioni

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SSK è un inventore di brevetti nell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Novartis (attraverso un accordo tra Mayo Clinic, University of Pennsylvania e Novartis) e Mettaforge (attraverso Mayo Clinic). RS, MJC e SSK sono inventori di brevetti nel campo dell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Humanigen. SSK riceve finanziamenti per la ricerca da Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs e Lentigen. Le figure sono state create con BioRender.com.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato in parte supportato attraverso la pipeline Mayo Clinic K2R (SSK), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) e la Predolin Foundation (RS). Le figure 1, 2 e 4 sono state create con BioRender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago da 22 gaugeSiringa da insulina Covidien8881250206
28 gaugeBD329461
piastra da 96 pozzettiCorning3595
Anti-umano (ETNL) NISImanisREA009ETNL si lega al C-terminale citosolico di NIS
Anti-umano BCMA, clone 19F2, PE-Cy7BioLegend357507Anticorpo Flow
Anti-umano CD45, clone HI30, BV421BioLegend304032Flow anticorpo
Anti-topo CD45, clone 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Flow anticorpo
Anti-coniglio IgGR& DF0110Anticorpo secondario per la colorazione NIS
BCMA-CAR costrutto, IDT di seconda generazione, Coralville, IA
BD  Kit di soluzioni per fissazione/permeabilizzazione Cytofix/CytopermBD554714
Anticorpo monoclonale CD3 (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (sistemi di terapia cellulare) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
Sistema CytoFLEX  B5-R3-V5Beckman CoulterC04652citometro a flusso
dimetilsolfossidoMillipore SigmaD2650-100ML
siringhe monouso con punte Luer-LokBD309646
D-luciferina, sale di potassiooro BiotecnologiaLUCK-1G
D-PBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco)Gibco14190-144
Dulbecco's Soluzione salina tamponata con fosfatoGibco14190-144
Dynabeads MPC-S (concentratore di particelle magnetiche)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Kit di isolamento delle cellule T umaneSTEMCELL Technologies17951perline magnetiche a selezione negativa; 17951RF include punte e tampone
Siero fetale bovinoMillipore SigmaF8067
Capra anti-topo IgG (H+L) Anticorpo secondario adsorbito incrociato, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Scanner PET/CT multimodaleSiemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
Isoflurano liquidoPiramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 Sistema di imagingPerkinElmerCLS148588
IVIS® Sistema di imaging in vivo a spettroPerkinElmer 
Reagente per trasfezione Lipofectamine 3000InvitrogenL3000075
Kit per colorante a cellule morte Aqua fissabile LIVE/DEAD, per eccitazione a 405 nmInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Filtro sottovuoto Nalgene Rapid-Flow 500 mL, 0,22 uM, sterileThermo Scientific450-0020
Filtro sottovuoto Nalgene Rapid-Flow 500 mL, 0,45 uM, sterileThermo Scientific450-0045
NOD. Cg-Prkdcscid  Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratory05557
OPM-2DSMZCRL-3273linea cellulare di mieloma multiplo
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389vettore lentivirale codificante luciferasi-GFP
Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100x), LiquidGibco10378-016
software PMODPMODPPFA e P3D
innovativaderivata dal plasma sierico umano AB aggregatoIPLA-SERAB-H-100ML
Puromicina dicloridratoMP Biomedicals, Inc.
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Separatore cellulare completamente automatizzato
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450Provette di separazione a gradiente di densità
Aziduro di sodio, 5% (p/v)Ricca Chemical7144.8-16
Pallone T175Corning353112
Terrell (isoflurano, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 Medium a cellule ematopoietiche senza sieroLonza04-418Q
124262 Ricerca 0210055210

Riferimenti

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