Questo protocollo descrive la metodologia per il tracciamento non invasivo delle cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico in vivo con una piattaforma clinicamente disponibile.
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Articolo metodologico
Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell'antigene chimerico (CAR) hanno mostrato risultati senza precedenti in studi clinici registrativi per pazienti con tumori maligni delle cellule B o mieloma multiplo (MM). Tuttavia, numerosi ostacoli limitano l'efficacia e vietano l'uso diffuso di terapie con cellule T CAR a causa dello scarso traffico e infiltrazione nei siti tumorali e della mancanza di persistenza in vivo. Inoltre, le tossicità potenzialmente letali, come la sindrome da rilascio di citochine o la neurotossicità, sono le principali preoccupazioni. L'imaging e il tracciamento efficienti e sensibili delle cellule T CAR consentono la valutazione del traffico, dell'espansione e della caratterizzazione in vivo delle cellule T e consentono lo sviluppo di strategie per superare gli attuali limiti della terapia con cellule T CAR. Questo documento descrive la metodologia per incorporare il symporter di ioduro di sodio (NIS) nelle cellule T CAR e per l'imaging delle cellule T CAR utilizzando la tomografia ad emissione di tetrafluoroborato-positrone [18F] tetrafluoroborato ([18F] TFB-PET) in modelli preclinici. I metodi descritti in questo protocollo possono essere applicati ad altri costrutti CAR e geni bersaglio oltre a quelli utilizzati per questo studio.
Introduzione
La terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico T (CAR T) è un approccio rapidamente emergente e potenzialmente curativo nelle neoplasie ematologiche1,2,3,4,5,6. Risultati clinici straordinari sono stati riportati dopo la terapia con cellule T CAR T (CART19) o CON l'antigene di maturazione delle cellule B (BCMA) CAR T2. Ciò ha portato all'approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti delle cellule CART19....
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Protocollo
Il protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board della Mayo Clinic, del Comitato istituzionale per la biosicurezza e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Mayo Clinic.
1. Produzione di cellule T NIS+ BCMA-CAR
NOTA: Questo protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board della Mayo Clinic (IRB 17-008762) e dell'Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04).
- Produzione di BCMA-CAR, NIS e lentivirus codificanti per la proteina fluorescente verde luciferasi (GFP).
NOTA: Un costrutto BCMA-CAR di seconda generazione è stato ....
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Risultati
La Figura 1 illustra le fasi di generazione delle cellule T NIS+BCMA-CAR. Il giorno 0, isolare i PBMC e quindi isolare le cellule T mediante selezione negativa. Quindi, stimolare le cellule T con perline anti-CD3 / CD28. Il giorno 1, trasdurre le cellule T con lentivirus NIS e BCMA-CAR. Nei giorni 3, 4 e 5, contare le cellule T e nutrirsi con i mezzi per regolare la concentrazione in modo che sia 1,0 × 106 / ml. Per le cellule T trasdotte da NIS, aggiungere 1 μg/mL di p.......
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Discussione
Questo documento descrive una metodologia per incorporare NIS nelle cellule T CAR e l'imaging infuso di cellule T CAR in vivo attraverso [18F] TFB-PET. Come prova di concetto, le cellule T NIS + BCMA-CAR sono state generate tramite doppia trasduzione. Abbiamo recentemente riferito che l'incorporazione di NIS nelle cellule T CAR non compromette le funzioni e l'efficacia delle cellule T CAR in vivo e consente il traffico e l'espansione delle cellule T CAR30. P.......
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Dichiarazioni
SSK è un inventore di brevetti nell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Novartis (attraverso un accordo tra Mayo Clinic, University of Pennsylvania e Novartis) e Mettaforge (attraverso Mayo Clinic). RS, MJC e SSK sono inventori di brevetti nel campo dell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Humanigen. SSK riceve finanziamenti per la ricerca da Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs e Lentigen. Le figure sono state create con BioRender.com.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato in parte supportato attraverso la pipeline Mayo Clinic K2R (SSK), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) e la Predolin Foundation (RS). Le figure 1, 2 e 4 sono state create con BioRender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ago da 22 gauge | Siringa da insulina Covidien | 8881250206 | |
| 28 gauge | BD | 329461 | |
| piastra da 96 pozzetti | Corning | 3595 | |
| Anti-umano (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL si lega al C-terminale citosolico di NIS |
| Anti-umano BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Anticorpo Flow |
| Anti-umano CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow anticorpo |
| Anti-topo CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow anticorpo |
| Anti-coniglio IgG | R& D | F0110 | Anticorpo secondario per la colorazione NIS |
| BCMA-CAR costrutto, IDT di seconda generazione | , Coralville, IA | ||
| BD Kit di soluzioni per fissazione/permeabilizzazione Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anticorpo monoclonale CD3 (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CTS (sistemi di terapia cellulare) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| Sistema CytoFLEX B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | citometro a flusso |
| dimetilsolfossido | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| siringhe monouso con punte Luer-Lok | BD | 309646 | |
| D-luciferina, sale di potassio | oro Biotecnologia | LUCK-1G | |
| D-PBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco) | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's Soluzione salina tamponata con fosfato | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (concentratore di particelle magnetiche) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Kit di isolamento delle cellule T umane | STEMCELL Technologies | 17951 | perline magnetiche a selezione negativa; 17951RF include punte e tampone |
| Siero fetale bovino | Millipore Sigma | F8067 | |
| Capra anti-topo IgG (H+L) Anticorpo secondario adsorbito incrociato, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| Inveon Scanner PET/CT multimodale | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
| Isoflurano liquido | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
| IVIS Lumina S5 Sistema di imaging | PerkinElmer | CLS148588 | |
| IVIS® Sistema di imaging in vivo a spettro | PerkinElmer | ||
| Reagente per trasfezione Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000075 | |
| Kit per colorante a cellule morte Aqua fissabile LIVE/DEAD, per eccitazione a 405 nm | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Filtro sottovuoto Nalgene Rapid-Flow 500 mL, 0,22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
| Filtro sottovuoto Nalgene Rapid-Flow 500 mL, 0,45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
| OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | linea cellulare di mieloma multiplo |
| pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | vettore lentivirale codificante luciferasi-GFP |
| Penicillina-Streptomicina-Glutammina (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| software PMOD | PMOD | PPFA e P3D | |
| innovativa | derivata dal plasma sierico umano AB aggregato | IPLA-SERAB-H-100ML | |
| Puromicina dicloridrato | MP Biomedicals, Inc. | ||
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Separatore cellulare completamente automatizzato |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | Provette di separazione a gradiente di densità |
| Aziduro di sodio, 5% (p/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| Pallone T175 | Corning | 353112 | |
| Terrell (isoflurano, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| X-VIVO 15 Medium a cellule ematopoietiche senza siero | Lonza | 04-418Q |
Riferimenti
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
- Raje, N., et al.
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Ristampe e permessi
![Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg&w=3840&q=75)