Articolo metodologico

Gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini

DOI:

10.3791/62335

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26 agosto 2021

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1Research Group Biomedical Physics, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 2Research Electronics Department, Max Planck Institute for Dynamics and Self-Organization, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 4Institute for Nonlinear Dynamics, Georg-August-University Goettingen, 5Department of Cardiology and Pneumology, University Medical Center Goettingen, 6German Center for Cardiovascular Research, DZHK e.V., partner site Goettingen, 7Laboratory Animal Science Unit, German Primate Center Leibniz Institute for Primate Research, 8Department of Microsystems Engineering (IMTEK), University of Freiburg, 9Cluster of Excellence BrainLinks-BrainTools, University of Freiburg

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo lavoro riporta un metodo per controllare il ritmo cardiaco di cuori murini intatti di topi transgenici channelrhodopsin-2 (ChR2) utilizzando la fotostimolazione locale con un array di micro-LED e la mappatura ottica simultanea del potenziale della membrana epicardica.

Abstract

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Le tachiaritmie ventricolari sono una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. La defibrillazione elettrica con scosse elettriche ad alta energia è attualmente l'unico trattamento per la fibrillazione ventricolare pericolosa per la vita. Tuttavia, la defibrillazione può avere effetti collaterali, tra cui dolore intollerabile, danno tissutale e peggioramento della prognosi, indicando una significativa necessità medica per lo sviluppo di strategie di gestione del ritmo cardiaco più delicate. Oltre agli approcci elettrici che riducono l'energia, l'optogenetica cardiaca è stata introdotta come un potente strumento per influenzare l'attività cardiaca utilizzando canali ionici a membrana sensibili alla luce e impulsi luminosi. Nel presente studio, verrà descritto un metodo robusto e valido per la fotostimolazione di successo di cuori murini intatti perfusi di Langendorff basato sulla stimolazione multi-sito applicando un array 3 x 3 di diodi micro emettitori di luce (micro-LED). La mappatura ottica simultanea delle onde di tensione della membrana epicardica consente di studiare gli effetti della stimolazione regionale-specifica e valuta l'attività cardiaca appena indotta direttamente in loco. I risultati ottenuti mostrano che l'efficacia della defibrillazione dipende fortemente dai parametri scelti per la fotostimolazione durante un'aritmia cardiaca. Sarà dimostrato che l'area illuminata del cuore svolge un ruolo cruciale per il successo della terminazione e come è possibile ottenere il controllo mirato dell'attività cardiaca durante l'illuminazione per modificare i modelli di aritmia. In sintesi, questa tecnica offre la possibilità di ottimizzare la manipolazione del meccanismo in loco sulla strada per il controllo del feedback in tempo reale del ritmo cardiaco e, per quanto riguarda la specificità della regione, nuovi approcci nel ridurre il potenziale danno al sistema cardiaco rispetto all'uso di applicazioni di scosse elettriche non specifiche.

Introduzione

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Le prime indagini sulle dinamiche spazio-temporali durante l'aritmia hanno rivelato che i complessi schemi elettrici durante la fibrillazione cardiaca sono guidati da onde di eccitazione rotanti simili a vortici1. Questa scoperta ha fornito nuove informazioni sui meccanismi alla base delle aritmie, che hanno poi portato allo sviluppo di nuove terapie di terminazione elettrica basate sull'eccitazione multi-sito del miocardio 2,3,4. Tuttavia, i trattamenti che utilizzano la stimolazione del campo elettrico non sono locali e possono innervare tutte le cel....

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti hanno seguito rigorosamente il regolamento sul benessere degli animali, in accordo con la legislazione tedesca, le disposizioni locali e in conformità con le raccomandazioni della Federazione delle associazioni europee di scienze degli animali da laboratorio (FELASA). La domanda di approvazione degli esperimenti sugli animali è stata approvata dall'autorità responsabile per il benessere degli animali e tutti gli esperimenti sono stati segnalati ai nostri rappresentanti per il benessere degli animali.

1. Preparazione dell'esperimento e materiali

  1. Configurazione della mappatura ottica
    NOTA: la configurazione ....

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Risultati

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Il protocollo consente l'induzione di aritmie ventricolari in cuori murini intatti utilizzando impulsi di fotostimolazione generati da LED 1 e LED 2 (Figura 1) con una frequenza f ind compresa tra 25 Hz e 35 Hz e una durata dell'impulso Wind compresa tra 2 ms e 10 ms. Si noti che lo scopo di tali impulsi luminosi rapidi non è quello di catturare il ritmo cardiaco, ma piuttosto di sbilanciare l'attività cardiaca in modo che possano essere generate onde elettriche irregol.......

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Discussione

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Un trattamento efficace delle tachiaritmie cardiache è la chiave per la terapia cardiaca. Tuttavia, i meccanismi biofisici alla base dell'inizio, della perpetuazione e della cessazione dell'aritmia non sono completamente compresi. Pertanto, la ricerca cardiaca mira a ottimizzare la terapia con scosse elettriche verso una cessazione più delicata delle aritmie, aumentando così la qualità della vita dei pazienti 28,29,30,31.

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Marion Kunze e Tina Althaus per il loro eccellente supporto tecnico durante gli esperimenti. La ricerca che ha portato ai risultati ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro FP7/2007-2013 della Comunità europea con il numero di convenzione di sovvenzione HEALTH-F2-2009-241526. Il supporto è stato fornito anche dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, DZHK e.V. (progetto MD28), dal sito partner Goettingen, dalla Fondazione tedesca per la ricerca CRC 1002 (progetto C03) e dalla Max Planck Society. Questo lavoro è stato in parte supportato da BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence finanziato dalla German Rese....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Componenti
BlebbistatinTargetMolT603810 mM soluzione madre
BSA/AlbuminaSigma-AldrichA4919
Cloruro di calcioSigma-AldrichC1016CaCl2
CarbogenWestfalen50 l flacone
DI-4-ANBDQPQAAT Bioquest21499Colorante per mappatura ottica
GlucosioSigma-AldrichD9434
C6H12O6 EparinaLEO PharmaEparina-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, disponibile solo su prescrizione
medica Acido cloridricoMerck1.09057.1000HCl, 1 M soluzione madre
IsofluranoCP Pharma1 ml/ml, disponibile solo su prescrizione
Magnesio CloruroMerck8.14733.0500MgCl2
Fosfato monopotassicoSigma-Aldrich30407KH2PO4
Pinacidil monoidratoSigma-AldrichP154-500mg10 mM soluzione madre
Cloruro di potassioSigma-AldrichP5405KCl
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS5761NaHCO3
Sodio CloruroSigma-AldrichS5886NaCl
Idrossido di sodioMerck1.09137.1000NaOH, 1 M soluzione madre
Configurazione elettrica
Biopac MP150Biopac SystemsMP150WSWsistema di acquisizione e analisi dei dati
ECG personalizzato, ECG100C alternativaBiopac SystemsECG100CAmplificatore per elettrocardiogramma
Riscaldatore a bagno d'acqua su misura con cavo scaldanteSistema di riscaldamento RMSHK-5,0-12Cavo scaldante 120W
Driver LED esagonali a bagno
AlimentatoreThorlabsKPS10115 V, 2,4 A Alimentatore con connettore jack da 3,5 mm per un K-Cube o T.
Driver LED LEDD1BDriver LED ThorlabsLEDD1BT-Cube, corrente di pilotaggio massima 1200 mA
MAP, elettrodo ECGHugo Sachs ElektronikBS4  73-0200Elettrodo mini-ECG per cuori isoaltici
Driver micro-LED, ad es. AFGAgilent InstrumentsA-2230Generatore di funzioni arbitrarie (AFG)
Generatore di segnaliAgilent InstrumentsA-2230AFG
micro-LED Array Componenti
Colla epossidicaTecnologia epossidicaEPO-TEK 353NDEpossidica
bicomponenteFluoropolimero  Asahi Glass Co., Ltd.Cytop 809MFluoropolimero ad alta trasparenza
Fotoresist di inversione di immagineMerck KGaAAZ 5214EResistenza di inversione di immagine per
chip LED Cree Inc.C460TR2227-S2100Fotoresist micro-LED blu
Merck KGaAAZ 9260Fotoresist positivi spessi
PoliimmideUBE Industries Ltd.U-Varnish SSoluzione di poliimmide
SiliconeNuSil Technology LLCMED-6215Elastomero siliconico a bassa viscosità
Adesivo senza solventiJohn P. Kummer GmbHEpo-Tek 301-2Resina epossidica a bassa viscosità
Mappatura ottica Filtro
bluChroma Technology CorporationET470/40xFiltro
FotocameraFotometricaCascade 128+Telecamera EMCCD ad alte prestazioni
Obiettivo della fotocameraNavitarDO-5095Gli obiettivi a lunghezza focale fissa ad alta velocità Navitar funzionano con telecamere CCD e CMOS
Specchio dicroicoSemrockFF685-Di02-25x36685 nm edge BrightLine® splitter dicroico standard a epifluorescenza a bordo singolo
Filtro EmmisionSemrockFF01-775/140-25775/140 nm BrightLine® filtro passa-banda a banda singola
Dissipatore di caloreAdvanced Thermal SolutionsATSEU-077A-C3-R0Dissipatori di calore - LED STAR Dissipatore di calore, diametro 45 mm, 68 mm, nero/argento, piastra di base non filettata
Hardware LED 1 e LED 2LED Engin OsramLZ4-00B208LED ad alta potenza - Colore singolo Blu, 460 nm 130 lm, 700mA
LED 3ThorlabsM625L3625 nm, 700 mW (min) LED montato, 1000
mA LentiLED Engin OsramLLNF-2T06-HLenti di illuminazione a LED Gruppi LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM
Fotodiodo per misuratore di potenzaThorlabsS120VCFotodiodo standard Sensore di potenza
Misuratore di potenzaThorlabsPM100DContatore compatto di potenza ed energia
Filtro rossoSemrockFF02-628/40-25BrightLine® filtro passa-banda a banda singola
chimicid'acqua ad alta risoluzione di eccitazione blu

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
  2. Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation....

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Optogenetica cardiacaTachiaritmia ventricolareMappaggio otticoArray di micro LEDPerfusione di LangendorffDefibrillazione cardiacaMappaggio del voltaggio epicardicoTerminazione dell aritmia

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