Questo documento descrive un protocollo dettagliato per l'utilizzo di sonde di tensione basate sul DNA per visualizzare le forze recettoriali applicate dalle cellule immunitarie. Questo approccio può mappare le forze recettoriali >4.7pN in tempo reale e può integrare le forze nel tempo.
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Articolo metodologico
Sonde di tensione del DNA per mappare le forze transitorie del recettore di Piconewton da parte delle cellule immunitarie
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le forze meccaniche trasmesse alla giunzione tra due cellule vicine e alla giunzione tra le cellule e la matrice extracellulare sono fondamentali per regolare molti processi che vanno dallo sviluppo all'immunologia. Pertanto, lo sviluppo di strumenti per studiare queste forze su scala molecolare è fondamentale. Il nostro gruppo ha sviluppato una suite di sensori di tensione molecolare per quantificare e visualizzare le forze generate dalle cellule e trasmesse a ligandi specifici. La classe più sensibile di sensori di tensione molecolare è costituita da forcine ad anello stelo di acido nucleico. Questi sensori utilizzano coppie fluoroforo-quencher per segnalare l'estensione meccanica e lo sviluppo delle forcine del DNA sotto forza. Una sfida con i sensori di tensione a forcina del DNA è che sono reversibili con un rapido ripiegamento della forcina al termine della tensione e quindi le forze transitorie sono difficili da registrare. In questo articolo, descriviamo i protocolli per la preparazione di sensori di tensione del DNA che possono essere "bloccati" e impediti di ripiegarsi per consentire la "memorizzazione" di informazioni meccaniche. Ciò consente la registrazione di forze piconewton altamente transitorie, che possono essere successivamente "cancellate" dall'aggiunta di acidi nucleici complementari che rimuovono la serratura. Questa capacità di alternare tra la mappatura della tensione in tempo reale e la memorizzazione di informazioni meccaniche rivela forze deboli, di breve durata e meno abbondanti, che sono comunemente impiegate dalle cellule T come parte delle loro funzioni immunitarie.
Introduzione
Le cellule immunitarie difendono dagli agenti patogeni e dalle cellule tumorali strisciando e scansionando continuamente le superfici delle cellule bersaglio alla ricerca di antigeni, costellando la loro superficie 1,2. Il riconoscimento dell'antigene viene avviato al momento del legame tra il recettore delle cellule T (TCR) e il complesso di istocompatibilità peptide-maggiore MHC (pMHC) espresso sulla superficie delle cellule bersaglio. Poiché il riconoscimento TCR-pMHC avviene alla giunzione tra due cellule mobili, è stato a lungo sospettato di sperimentare forze meccaniche. Inoltre, questo ha portato al mod....
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Protocollo
I topi transgenici OT-1 sono ospitati presso la Division of Animal Resources Facility della Emory University. Tutti gli esperimenti sono stati approvati ed eseguiti nell'ambito del protocollo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Preparazione di oligonucleotidi
- Sciogliere il DNA del filamento del ligando in acqua (resistività 18,2 MΩ, utilizzata in tutto il protocollo). Vortice e far girare la soluzione con una centrifuga da tavolo. Sintonizzare il volume d'acqua in modo tale che la concentrazione finale sia di 1 mM. Convalidare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro a nanogoccia per misurare l'assorb....
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Risultati
Qui mostriamo immagini rappresentative del controllo della qualità della superficie (Figura 4). Una superficie di alta qualità dovrebbe avere uno sfondo pulito nel canale RICM (Figura 4B) e un'intensità di fluorescenza uniforme nel canale Cy3B (Figura 4C). Con le stesse apparecchiature di imaging e identiche condizioni di acquisizione dell'imaging a fluorescenza, l'intensità della fluorescenza di fondo dovrebbe essere coerente e rip.......
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Discussione
Con le procedure dettagliate fornite qui, è possibile preparare substrati di sonda di tensione a forcina di DNA per mappare e quantificare la tensione del recettore prodotta dalle cellule immunitarie. Quando le cellule vengono placcate sul substrato della sonda di tensione della forcina del DNA, atterrano, si attaccano e si diffondono mentre i recettori percepiscono i ligandi sia chimicamente che meccanicamente, l'ultimo dei quali viene rilevato dalle nostre sonde. Tuttavia, in alcuni casi le cellule potrebbero non riusc.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 e NSF CAREER 1350829. Ringraziamo il NIH Tetramer Facility per i ligandi pMHC. Questo studio è stato supportato, in parte, dall'Emory Comprehensive Glycomics Core.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| acido 3-idrossipicolinico (3-HPA) | Sigma | 56197 | matrice maldi-TOF-MS |
| nbsp; mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | preparazione della superficie |
| (3-amminopropil)trietossisilano | Acros | AC430941000 | preparazione della superficie |
| 10x tampone per lisi dei globuli rossi | Biolegend | 00-4333-57 | tampone |
| 8,8 nm nanoparticelle d'oro, acido tannico | Nanocomposix | personalizzato | preparazione della superficie |
| Atto647N NHS estere | Sigma | 18373-1MG-F | fluoroforo, oligo prep |
| Attofluor Camera cellulare, per microscopia | Thermo Fisher Scientific | A7816 | imaging |
| BD Siringhe solo con Luer-Lok | BD bioscience cellule | 309657 | |
| biotinilato anti-topo CD3e | ebioscience | 13-0031-82 | anticorpo/ligando |
| pMHC biotinilato (SIINFEKL) | NIH Tetramer Core Facility presso la Emory University | Anticorpo NA | /ligando |
| albumina sierica bovina | Sigma | 735078001 | blocca interazioni non specifiche |
| Filtri cellulari | Biologix | 15-1100 | cellule |
| Coverslip Mini-Rack, teflon | Thermo Fisher Scientific | C14784 | preparazione della superficie |
| Cy3B NHS estere | GE Healthcare | PA63101 | fluoroforo, oligo prep |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) | Corning | 21-031-CM | etanolo tampone |
| Sigma | 459836 preparazione della superficie | ||
| Hank' sali bilanciati (HBSS)Perossido | tampone | Sigma | H8264 |
| Preparazione della superficie | Sigma | H1009 | |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | preparazione della superficie |
| Kit di avvio Midi MACS (LS) Miltenyi | Biotec | 130-042-301 | cellule |
| di isolamento delle cellule T CD8+ del topo | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | cellule |
| Dispositivi centrifughi Nanosep MF | Pall laboratory | ODM02C35 | oligo prep |
| No. 2 vetrini coprioggetti rotondi VWR | 48382-085 | preparazione della superficie | |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | preparazione della superficie |
| P2 gel | Bio-rad | 1504118 | oligo prep |
| acido suforico | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | superficie |
| Sulfo-NHS | acetato Thermo Fisher Scientific | 26777 | preparazione della superficie |
| Attrezzatura | |||
| Colonna Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18, 4,6 x 150 mm, 2,7 &; m | 653950-702 | preparazione di oligonucleotidi | |
| Barnstead Sistema di purificazione dell'acqua nanopura | Thermo Fisher | acqua | |
| CFI Apo 100&volte; NA 1.49 obiettivo | Nikon | Microscopia | |
| Cy5 cube | CHROMA | Microscopia | |
| evolve dispositivo ad accoppiamento di carica moltiplicatrice di elettroni (EMCCD) | Microscopia fotometrica | ||
| Cromatografia liquida ad alte prestazioni | Preparazione di oligonucleotidi | Agilent 1100 | |
| epifluorescenza a luce intensa | Nikon | Microscopia | |
| Spettrometro di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF-MS)Preparazione | oligonucleotidi | Voyager STR | |
| Spettrofotometro UV-Vis Nanodrop 2000 | Preparazione di oligonucleotidi | Thermo Fisher | |
| Microscopio invertito Nikon Eclipse Ti | Microscopia Nikon | ||
| Sistema di messa a fuoco perfetta | Nikon | Microscopia | |
| Software NIS Elements | Nikon | Microscopy | |
| quad band TIRF 405/488/561/647 cubo | Microscopia CHROMA | Microscopia | |
| RICM cubo CHROMA | Lanciatore | ||
| TIRF con 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) e 640 nm | Microscopia | ||
| TRITC cubo | CHROMA | ||
| oligo name | 5' modifica / 3' modifica | sequence (da 5' a 3') | Use |
| 15mer ammina locking strand | 5' modifica: nessuna modifica 3' modifica: /3AmMO/ | AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | blocco segnale di tensione in tempo reale |
| 15mer Atto647N bloccaggio strand | 5' modifica: Atto647N 3' modifica: /3AmMO/ | AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | blocco segnale di tensione in tempo reale |
| 15mer trefolo | di bloccaggio non fluorescente5' modifica: nessuna modifica 3' modifica: nessuna modifica | A AAA AAC ATT TAT Blocco AC | di tensione in tempo reale per analisi quantitativa |
| 4.7 pN hairpin strand | 5' modifica: nessuna modifica 3' modifica: nessuna modifica | GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC Sonda a | forcina |
| filamento del ligando dell'ammina strand | 5' modifica: /5AmMC6/ 3' modifica: /3Bio/ | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | sonda a forcina |
| BHQ2 filo di | ancoraggio5' modifica: /5ThiolMC6-D/ 3' modifica: /3BHQ_2/ | TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | Sonda a forcina |
| Cy3B ligando filamento | 5' modifica: Cy3B 3' modifica: /3Bio/ | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | sblocco della sonda a forcina |
| < | forte>5' modifica: nessuna modifica 3' modifica: nessuna modifica | TAG, GTA, GGG, TAT, AAA, TGT, TTT, TTT, C, sblocco | segnale di tensione accumulata |
Riferimenti
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).
- Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.
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Ristampe e permessi
