Articolo metodologico

Epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto

DOI:

10.3791/62349

⸱

4 aprile 2021

 , 
1Harvard Medical School, 2Brigham and Women’s Hospital, 3Massachusetts General Hospital

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive la procedura per rimuovere il lobo ventrale del fegato nel pesce zebra adulto per consentire lo studio della rigenerazione epatica.

Abstract

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L'insufficienza epatica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo e la mortalità per malattie croniche del fegato sta aumentando bruscamente negli Stati Uniti. I fegati sani sono in grado di rigenerarsi da danni tossici, ma nelle malattie epatiche avanzate, la naturale capacità del fegato di rigenerarsi è compromessa. Zebrafish è emerso come un potente sistema sperimentale per lo studio della rigenerazione. Sono un modello ideale per studiare la rigenerazione epatica dall'epatomia parziale, una procedura con rilevanza clinica diretta in cui parte del fegato viene rimossa chirurgicamente, lasciando intatto il resto. Non esiste un protocollo standard per l'epatotomia parziale; studi precedenti che utilizzano questo modello hanno utilizzato protocolli leggermente diversi e riportato risultati disparati. Qui descritto è un protocollo efficiente e riproducibile per eseguire un'epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto. Usiamo questa tecnica per dimostrare che i pesci zebra sono in grado di rigenerazione epimorfica del lobo reinsediato. Questo protocollo può essere utilizzato per interrogare ulteriormente i meccanismi necessari per la rigenerazione epatica nel pesce zebra.

Introduzione

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Tra gli organi solidi nell'uomo, il fegato è l'unico organo in grado di rigenerazione1. Questo è fondamentale, in quanto il fegato è un organo essenziale, responsabile delle principali funzioni metaboliche, conservazione dell'energia, disintossicazione del sangue, secrezione di proteine plasmatiche e produzione di bile2. Gli epatociti persi a causa di danni tossici o infiammatori vengono sostituiti principalmente attraverso la divisione degli epatociti rimanenti1. Un modello sperimentale classico per lo studio della rigenerazione epatica è l'epatomia parziale, in cui vengono rimossi i singoli lobi....

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Protocollo

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Zebrafish sono stati allevati e allevati secondo procedure standard. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Brigham and Women's Hospital (2016N000405). I pesci zebra adulti sono stati digiunati per 24 ore prima dell'inizio del protocollo. L'acqua del sistema si riferisce all'acqua nei serbatoi di alloggiamento del pesce zebra nella struttura acquatica.

1. Preparazione e anestesizzazione

  1. Preparare la soluzione di Tricaine 0,016% nell'acqua del sistema.
    ATTENZIONE: La tricaina è irritante se viene a contatto con gli occhi, la pelle o le vie respiratorie.
  2. Pre....

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Risultati

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Al fine di esaminare il potenziale rigenerativo del fegato di zebrafish adulto, abbiamo eseguito un'epatotectomia parziale (PHX) nel pesce zebra adulto. In generale, sono stati selezionati grandi adulti (30-40 mm di lunghezza), che vanno da 1,5 a 2,5 anni. All'interno dei singoli esperimenti, gli animali venivano selezionati dallo stesso serbatoio e corrispondevano all'età e alle dimensioni. Come controllo appropriato, abbiamo utilizzato interventi chirurgici fittizi in cui l'animale è stato anestetizzato e ha ricevuto u.......

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Discussione

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Le differenze anatomiche tra zebrafish e modelli di mammiferi per la rigenerazione del fegato presentano sfide uniche per la resezione epatica. Il fegato nei pesci zebra è nelle immediate vicinanze del cuore e dell'intestino; inavvertitamente dannoso per entrambi gli organi si traduce in un aumento della mortalità. Il fegato di zebrafish non è incapsulato, rendendo più difficile separarsi dall'intestino. Il fegato riceve sangue ricco di nutrienti dall'intestino attraverso le vene portale. Nei mammiferi, le vene che lasci.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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I.M.O. è supportato dal NIAAA (F32AA027135). W.G. è supportato da R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 e dal Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. è uno studioso di scienze biomediche di Pew.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione acquosa di paraformaldeide al 16%,microscopia elettronica15700
Provette per centrifuga Falcon da 50 mL, polipropilene, sterileCorning352098
AS 82/220.R2 PLUS Bilancia analiticaBilancia analitica Bay State Scale & Sistemi, INC.WL-104-1051
Dumont #55 PinzeStrumenti per le scienze fini11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Pinze per campioni Microscopiaelettronica Scienze72997-07
Microscopio per epifluorescenzaZeissDiscovery.V8
Mastertop Spugna per pulizia in cellulosaAmazonB07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4LEMD Millipore6505-4L
Micro forbici super fini, 3 1/4" dritteStrumenti di ricerca biomedica11-1020
Tricaina metansolfonatoSyndelTRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagentsFischer ScientificBP337-500
di grado EM Sciences

Riferimenti

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  1. Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
  2. Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver ....

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Rigenerazione epaticaModello zebrafishRimozione del lobo ventraleRapporto fegato corpoMicroscopia a fluorescenzaMicroscopio da dissezioneStrumenti geneticiMalattie epatiche

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