Strategie per l'ottimizzazione dell'acquisizione dei dati della tomografia elettronica criogenica

Summary

La crescente domanda di raccolta dati su larga scala nella tomografia elettronica criogenica richiede routine di acquisizione delle immagini ad alto rendimento. Qui è descritto un protocollo che implementa i recenti sviluppi di strategie di acquisizione avanzate volte a massimizzare l'efficienza temporale e il throughput della raccolta dei dati tomografici.

Abstract

La tomografia elettronica criogenica (cryoET) è un metodo potente per studiare la struttura 3D di campioni biologici in uno stato vicino al nativo. L'attuale crioET all'avanguardia combinato con l'analisi della media dei subtomogrammi consente la determinazione strutturale ad alta risoluzione di complessi macromolecolari presenti in più copie all'interno di ricostruzioni tomografiche. Gli esperimenti tomografici di solito richiedono una grande quantità di serie di inclinazione da acquisire per mezzo di microscopi elettronici a trasmissione di fascia alta con importanti costi operativi di gestione. Sebbene il throughput e l'affidabilità delle routine di acquisizione dati automatizzate siano costantemente migliorati negli ultimi anni, il processo di selezione delle regioni di interesse in cui verrà acquisita una serie di inclinazione non può essere facilmente automatizzato e si basa ancora sull'input manuale dell'utente. Pertanto, l'applicazione di una sessione di raccolta dati su larga scala è una procedura dispendiosa in termini di tempo che può ridurre considerevolmente il tempo rimanente del microscopio disponibile per l'acquisizione della serie tilt. Qui, il protocollo descrive le implementazioni sviluppate di recente basate sul pacchetto SerialEM e sul software PyEM che migliorano significativamente l'efficienza temporale dello screening della griglia e della raccolta di dati della serie tilt su larga scala. Il protocollo presentato illustra come utilizzare le funzionalità di scripting SerialEM per automatizzare completamente la mappatura della griglia, la mappatura dei quadrati della griglia e l'acquisizione delle serie di inclinazione. Inoltre, il protocollo descrive come utilizzare PyEM per selezionare ulteriori obiettivi di acquisizione in modalità off-line dopo l'avvio della raccolta automatica dei dati. Per illustrare questo protocollo, viene descritta la sua applicazione nel contesto della raccolta di dati di fascia alta della serie di inclinazione Sars-Cov-2. La pipeline presentata è particolarmente adatta a massimizzare l'efficienza temporale degli esperimenti di tomografia che richiedono un'attenta selezione degli obiettivi di acquisizione e allo stesso tempo una grande quantità di serie di inclinazione da raccogliere.

Introduction

I metodi di microscopia elettronica criogenica (cryoEM) si basano sull'imaging di campioni biologici mediante un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) dopo la loro rapida vetrificazione, un processo di preparazione del campione che preserva le strutture molecolari e cellulari dei campioni in uno stato vicino al nativo e idrato^1,2. Nella tomografia elettronica criogenica (cryoET) si ottiene un modello 3D del campione vitrificato acquisendo un numero di immagini della stessa regione di interesse da diversi orientamenti, la cosiddetta serie tilt, seguita dalla ricostruzione computazionale del volume tomografico^3. Questa tecnica di imaging avanzata è maturata in un potente metodo per l'indagine strutturale dei processi biologici nel contesto dei loro ambienti cellulari nativi^4,5,6.

Oltre all'analisi ultrastrutturale del campione vitrificato, è possibile ottenere ricostruzioni ad alta risoluzione di complessi macromolecolari presenti in più copie all'interno del volume tomografico applicando subtomogrammi con una media di⁵. Questo approccio di ricostruzione si basa sull'allineamento iterativo e sulla media dei sotto-volumi contenenti la struttura di interesse ed è finalizzato ad aumentare il rapporto segnale-rumore e la risoluzione della ricostruzione finale^7,8. La media dei sottotomogrammi si basa sulla raccolta e l'elaborazione di una grande quantità di dati che spesso richiede l'acquisizione di centinaia di serie di inclinazione per mezzo di TEM di fascia alta con onerosi costi operativi di gestione.

Attualmente la configurazione di tali sessioni crioET automatizzate è un processo che richiede tempo e che di solito si basa sull'input manuale dell'utente^9,10,11. In genere, gli obiettivi vengono identificati mediante ispezione visiva della griglia mappata e successivamente impostati per la raccolta automatica dei dati. L'efficienza dell'utente nell'identificare i punti di acquisizione è spesso influenzata dalla natura del campione, diventando particolarmente impegnativa quando si analizzano macromolecole purificate con concentrazione non ottimale o nel caso di eventi rari all'interno di ambienti cellulari affollati, implicando l'uso di approcci correlativi¹². Inoltre, i flussi di lavoro attuali richiedono l'acquisizione di immagini durante il set-up a vari ingrandimenti che verranno successivamente utilizzati per la localizzazione e il centraggio precisi del target durante l'acquisizione automatizzata^11,13,14. Questi passaggi di ricon allineamento ad alta precisione sono fondamentali per le applicazioni ad alta risoluzione, che richiedono che l'imaging venga eseguito con ingrandimenti elevati e richiedono passaggi di centrating accurati per mantenere la regione di interesse all'interno del piccolo campo visivo risultante. Complessivamente, diverse ore di ogni sessione di raccolta dati sono impegnate per questa procedura dispendiosa in termini di tempo durante la quale il TEM non è impegnato nell'acquisizione di serie tilt. Pertanto, a seconda della quantità di serie di inclinazione richiesta, l'identificazione e la configurazione dei punti di acquisizione possono avere un impatto considerevole sul tempo del microscopio disponibile per la raccolta dei dati durante una sessione crioET.

Qui è descritto un protocollo ottimizzato basato sul pacchetto software SerialEM¹⁵ e sull'ultima versione del software PyEM¹⁶ per mappare griglie, mappare quadrati di griglia, selezionare target e impostare l'acquisizione automatica dei dati per la raccolta di serie tilt su larga scala. Il concetto chiave di questo approccio è quello di fornire a SerialEM immagini generate computazionalmente da PyEM per ogni elemento di acquisizione, denominate mappe virtuali, per la localizzazione e la centratizzazione accurate del target. Per ottenere il tempo di acquisizione effettivo, la selezione dei target e la creazione delle mappe virtuali vengono eseguite off-line utilizzando una seconda istanza fittizia di SerialEM, disaccoppiando il processo di selezione degli obiettivi di acquisizione dalle operazioni TEM. Pur non affrontando come aumentare la qualità dei dati^13,17 o la velocità di acquisizione della serie tilt^18,19,questo protocollo si concentra principalmente sulle strategie per ottimizzare l'efficienza temporale della configurazione delle sessioni cryoET automatizzate su larga scala. Pertanto, l'implementazione del protocollo presentato è destinata a quegli scienziati che stabiliscono flussi di lavoro di raccolta dati crioET che desiderano massimizzare la resa dell'acquisizione automatica dei dati aumentando il tempo del microscopio disponibile per l'acquisizione della serie tilt.

Protocol

Il protocollo qui descritto fa parte di un documento più completo prodotto dalla piattaforma di servizi EMBL CryoEM che include istruzioni dettagliate passo-passo e schermate che illustrano l'intera procedura di una tipica sessione crioET, incluso il caricamento del campione, la mappatura della griglia, la sintonizzazione del microscopio, l'impostazione dei punti di acquisizione e la raccolta automatica dei dati. Il protocollo completo può essere scaricato al seguente link: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download

1. Prerequisiti

1. Installare SerialEM versione 3.8 e impostare per controllare il microscopio e il rilevatore (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm).
2. Installare un'istanza fittizia di SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).
3. Installare PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).

2. Mappatura della griglia

1. Caricare una cassetta con griglie nel caricatore automatico del microscopio.
2. Impostare condizioni di imaging adatte per mappare l'intera griglia. Fallo al minimo ingrandimento possibile tenendo conto del campo visivo sul rilevatore utilizzato (EFTEM SA 2250x). Salva le condizioni di imaging come stato di imaging SerialEM per rendere le cose convenienti per un uso successivo.
3. Impostare il montaggio completo
   1. Aprite il menu SerialEM Navigator.
   2. Seleziona Montaggio e griglie.
   3. Selezionare Imposta montaggio completo.
4. Avviare lo script Grid_Mapping. Attendere che lo script attenda che il caricatore automatico si raffreddi; fare un inventario e quindi mappare ogni griglia trovata dalla procedura di inventario. Inserisci un'e-mail tramite il menu Tilt Series per consentire allo script di inviare comodamente un'e-mail al termine.
5. Salva Navigatore.
6. Ispezionate tutte le mappe della griglia da SerialEM Navigator e scegliete quale griglia mappare ulteriormente a un ingrandimento più elevato.
   NOTA: Molte TEM dotate di un sistema di caricamento automatico mostreranno una rotazione della griglia quando vengono ricaricate. È meglio rimappare qualsiasi griglia dopo averla ricaricata. I sistemi alternativi di solito subiscono solo alcuni spostamenti, che possono essere corretti in SerialEM con una procedura Shift To Marker.

3. Impostare serialEM a basso dosaggio

1. Impostare l'ingrandimento delle modalità Di visualizzazione e Anteprima serialEM a basso dosaggio (questo è necessario per il passaggio 6).
2. Acquisire un'immagine Visualizza e salvarla come mappa nel Navigatore.
3. Acquisire un'immagine di anteprima e salvarla come mappa nel Navigatore.
   1. Impostare entrambe le modalità sullo stesso binning (si consiglia di binning 4). Ciò consente di salvare le due mappe in un'unica pila di immagini.
   2. Nella finestra SerialEM Navigator, modificate l'etichetta della mappa Visualizza in Visualizza e l'etichetta della mappa anteprima in Anteprima.
   3. Salvare e chiudere il file del navigatore.
      NOTA: non è necessaria alcuna destinazione per le immagini di visualizzazione e anteprima iniziali, PyEM utilizzerà semplicemente le impostazioni di imaging.

4. Mappatura del quadrato della griglia

1. Impostare le condizioni di imaging per mappare i quadrati della griglia. È di grande importanza poter vedere il campione di interesse e la distribuzione di perle fiduciarie. Per garantire un contrasto ottimale per le mappe quadrate della griglia, eseguire la procedura seguente.
   1. Inserire un'apertura obiettivo.
   2. Se applicabile, inserire la fessura del filtro dell'energia.
   3. Utilizzare un defocus di -100 μm.
2. Schermo per buoni quadrati di griglia adatti per ulteriori mappature. Dopo l'ispezione visiva dei quadrati dalla mappa della griglia, scatta immagini di prova del quadrato con le condizioni di imaging da utilizzare per le mappe quadrate della griglia.
3. Quando viene identificato un buon quadrato, contrassegnarne il centro nell'immagine della mappa griglia utilizzando la funzione Aggiungi punti di SerialEM Navigator.
4. Una volta aggiunti tutti i punti, in SerialEM Navigator premere Maiusc + A sul primo punto, quindi premere Maiusc + A sull'ultimo punto.
   NOTA: tutti i punti aggiunti sono ora contrassegnati da una A, il che significa che sono tutti punti di acquisizione.
5. Premere MAIUSC + N (creare un nuovo file in punto) sul primo punto e poi di nuovo sull'ultimo punto. Nella finestra di dialogo visualizzata, selezionare Immagini montaged.
6. Quando viene visualizzata la finestra di dialogo di montaggio, impostate una dimensione di montaggio che copra un quadrato della griglia. Ciò dipende dall'ingrandimento e dalla dimensione delle maglie delle griglie utilizzate e in genere richiede montaggi da 2 x 2 a 4 x 4. Assegnagli un nome con un numero (ad esempio, squaremap_01.mrc) per consentire a SerialEM di numerare comodamente automaticamente tutti i file per quadrato della griglia.
7. Avviare la mappatura della griglia aprendo il menu SerialEM Navigator e fare clic su Acquisisci in elementi.
8. Nel menu a comparsa, seleziona le seguenti opzioni.
   1. Selezionate Eucentrismo approssimativo approssimativo.
   2. Selezionare Acquisisci immagine mappa.
   3. Selezionare Chiudi valvole a colonna all'estremità.
   4. Seleziona Invia e-mail alla fine.

5. Selezione degli obiettivi

1. Aprire un'istanza SerialEM fittizia. Questo può essere impostato sul PC SerialEM che controlla il microscopio o su un PC diverso (supporto) se entrambi i computer condividono una connessione di rete.
2. Una volta mappato il primo quadrato della griglia, utilizzare l'opzione di menu Unisci di SerialEM Navigator per visualizzare il montaggio nell'istanza SerialEM fittizia.
3. Fare doppio clic sulla finestra Navigatore per aprire la mappa quadrata della griglia.
4. Cerca nella mappa e utilizza l'opzione fittizia SerialEM Navigator Aggiungi punti per aggiungere punti di acquisizione immagini sul target di interesse.
5. Al termine e dopo aver mappato i nuovi quadrati, salvare il file Navigator e unire nuovamente il Navigatore; continuare fino a quando tutti i quadrati della griglia non sono mappati.

6. Genera mappe virtuali

1. Ancora una volta, unisci il file navigatore con l'istanza SerialEM fittizia.
2. Esegui lo script delle mappe virtuali PyEM dal menu SerialEM fittizio, Strumenti e seleziona Mappe di ancoraggio virtuali. Questa visualizzazione potrebbe richiedere del tempo a seconda delle dimensioni e della quantità delle mappe quadrate della griglia e del binning delle mappe Visualizza e Anteprima.
   NOTA: PyEM avvia una finestra di comando che si chiude automaticamente al termine, quindi è possibile aprire il nuovo file navigatore. Per ogni mappa montaged che contiene punti selezionati, PyEM scrive una singola mappa unita e tutte le sue mappe di visualizzazione e anteprima. Infine, scrive un nuovo file Navigator chiamato <navigatorfilename>_automaps.nav.

7. Sintonizzazione del microscopio

1. Controllare la sintonizzazione del microscopio. Per garantire prestazioni adeguate al microscopio, utilizzare lo stesso ingrandimento e la stessa configurazione delle dimensioni del fascio per l'acquisizione dei dati, nell'ordine seguente.
   1. Esegui l'allineamento senza coma SeriaLEM di CTF (Zemlin tableau).
   2. Inserire e centrare un'apertura dell'obiettivo.
   3. Esegui SerialEM Correct Astigmatism by CTF (auto-stigmate).
   4. Esegui GIF Quick Tune (cioè, solo messa a fuoco a fessura).
      NOTA: poiché i passaggi 7.1.1, 7.1.3 e 7.1.4 potrebbero richiedere una maggiore intensità di dose, è necessario cambiare solo la dimensione dello spot; la dimensione del fascio non deve essere modificata in quanto ciò causa l'inclinazione del fascio, il che rende le regolazioni errate. I passaggi 7.1.1, 7.1.2 e 7.1.3 sono semi-automatici in questo script disponibile pubblicamente (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).

8. Configura Navigator

1. In SerialEM, aprite il nuovo file navigatore denominato _automaps.nav.
   NOTA: V_yyyy sono le mappe visualizza e P_yyyy sono le mappe di anteprima. Le mappe di anteprima sono impostate come punti di acquisizione.
2. Nella finestra di SerialEM Navigator, deselezionate tutti i punti A, selezionate il primo V_yyyy mappa, selezionate Comprimi, fate clic su A due volte e deselezionate Comprimi.
3. Seleziona la prima posizione V_yyyy, premi Maiusc + T, quindi seleziona l'ultima posizione V_yyyy e premi di nuovo Maiusc + T.
4. Scegliete Immagini a fotogramma singolo nelle proprietà del file da aprire nella finestra di dialogo.
5. Nella finestra di dialogo Proprietà file successiva, selezionare i parametri desiderati in base alle esigenze di imaging e alla configurazione dello strumento.
6. Quando richiesto, fornire un nome con un numero (ad esempio, TS_001.mrc) e fare clic su Salva.
   NOTA: SerialEM numererà automaticamente i nomi dei file per tutte le serie tilt.
7. Impostare il controller della serie tilt per la prima posizione TS. Al termine, fare clic su OK per impostare questi parametri per tutte le serie di inclinazione dopo questo elemento di acquisizione. Tutte le mappe di anteprima sono ora selezionate come TS (Tilt Series) con nome file numerato TS_xxx.mrc.
   NOTA: È possibile modificare i parametri manualmente in un secondo momento utilizzando la funzione Navigator TSparams; le modifiche verranno applicate per tutti gli elementi verso il basso nell'elenco. L'utente ha la possibilità di eseguire uno script personalizzato anziché la serie tilt.

9. Imposta le posizioni di messa a fuoco / traccia

1. Impostare la distanza di messa a fuoco/traccia per ciascun bersaglio, se necessario (assicurarsi che SerialEM Low Dose sia attivato).
2. Fare doppio clic sulla mappa di visualizzazione per caricarla.
3. Selezionare Anteprima mappa nell'elenco Navigatore.
4. Selezionare Modifica stato attivo nella finestra Navigatore.
5. Nel pannello Controllo a basso dosaggio, deselezionate Ruota asse interarea per posizionare Prova e Messa a fuoco lungo l'asse di inclinazione dello stadio.
6. Fare clic sulla regione desiderata nella mappa di visualizzazione caricata per impostare la posizione di messa a fuoco/prova per questa serie di inclinazioni.
7. Assicurarsi che l'elemento Navigatore disponga ora di TSP impostato; ripetere la procedura per tutti gli elementi.
   NOTA: le posizioni di messa a fuoco/traccia vengono copiate automaticamente verso il basso nel Navigatore. Pertanto, se la posizione di messa a fuoco/traccia per l'elemento precedente si trova sul lato corretto e sulla distanza corretta, non è necessario modificarla per l'elemento corrente.

10. Impostare script aggiuntivi

1. Due script gestiscono la gamma Focus: pretomo e duringtomo. Lo script pretomo viene eseguito prima di ogni serie di inclinazioni e lo script duringtomo durante ogni inclinazione.
2. Modificare l'intervallo di messa a fuoco nello script pretomo.
3. Nel menu SerialEM Tilt Series, selezionare Esegui script in TS e selezionare il numero di script dello script duringtomo.

11. Esegui

1. Controllare il livello del serbatoio dell'azoto.
2. Verificare se il turbo del caricatore automatico è selezionato.
3. Controlla lo spazio libero di archiviazione dei dati.
4. Nel menu File serialEM, deselezionate Salvataggio continuo per il file di registro e chiudete qualsiasi file di registro attualmente aperto. Ogni serie di inclinazione otterrà il proprio file di registro.
5. Nel menu Navigatore, fare clic su Acquisisci in Elementi.
6. Eseguire lo script PreTomo.
7. Selezionare Attività principale Acquisisci serie di inclinazione.
8. Selezionare Esegui script dopo PostTomo.
9. Selezionare Chiudi valvole a colonna all'estremità.
10. Seleziona Invia e-mail alla fine.
11. Fare clic su GO.
    NOTA: SerialEM invierà un'e-mail per serie tilt, riuscita o errata; l'errore può, tuttavia, anche significare che l'intervallo di inclinazione completo non è stato raggiunto.

Results

Questa procedura è stata utilizzata per acquisire la serie di inclinazioni Sars-Cov-2 descritta in Turonova et al. 2020²⁰; l'intero set di dati è stato prodotto utilizzando tre griglie distinte in tre sessioni di microscopia presso l'EMBL di Heidelberg. L'attuale studio si concentrerà e descriverà la prima sessione di 3 giorni (~ 72 ore) eseguita con la prima griglia.

Dopo che l'intera griglia è stata mappata a basso ingrandimento (~10 min, vedi passaggio 2), sono stati selezionati 71 quadrati adatti sulla mappa della griglia e sono state acquisite mappe a medio ingrandimento(mappe quadrate)con impostazioni (ingrandimento, esposizione, sfocatura) che consentono la visualizzazione diretta e l'identificazione del campione di interesse, coronavirus in questo caso (vedi passaggio 4) (Figura 1A). Il tempo di acquisizione è stato di ~ 3 minuti per quadrato, 3 ore e 45 minuti in totale.

Non appena è stata creata la prima mappa quadrata, un'istanza SerialEM fittizia (senza alcun controllo sulla fotocamera o sul microscopio) è stata aperta su un computer separato per visualizzare la mappa quadrata e aggiungere punti su bersagli adatti all'acquisizione di serie di inclinazione (vedere il passaggio 5) (Figura 1B). Le mappe quadrate appena acquisite sono state recuperate unendo l'attuale navigatore SerialEM fittizio con il navigatore dall'istanza SerialEM acquisita. Dopo ~ 2 ore di acquisizione e selezione del quadrato della griglia, è stato possibile identificare 50 obiettivi iniziali.

Al termine delle acquisizioni delle mappe quadrate, SerialEM a basso dosaggio è stato impostato e le immagini di riferimento View e Preview sono state prese e salvate come mappe (vedere il passaggio 3). Queste ultime mappe potrebbero quindi essere utilizzate immediatamente sull'istanza SerialEM fittizia per generare, dalle corrispondenti immagini di mappe quadrate, le mappe Virtual View (Figura 1C)e Virtual Preview (Figura 1D)dei 50 target selezionati con la suite software PyEM, per un tempo di elaborazione di ~ 30 min (vedi passaggio 6). Questo tempo di elaborazione nella sessione SerialEM fittizia è stato utilizzato per eseguire i preparativi finali del microscopio per l'acquisizione: sintonizzazione del filtro energetico, acquisizione di immagini di riferimento per il guadagno della nuova fotocamera, allineamento senza astigmatismo e coma dell'obiettivo.

Una volta completata la messa a punto del microscopio e generate le mappe virtuali dai 50 obiettivi iniziali, è stato impostato il navigatore SerialEM effettivo da utilizzare per l'acquisizione (vedere il passaggio 8), sono state impostate le posizioni di messa a fuoco e traccia (passaggio 9) e l'acquisizione della serie di inclinazione potrebbe essere avviata (vedere i passaggi 10 e 11). Le mappe Virtual View (Figura 1C) sono state utilizzate per un centraggio iniziale del target (Figura 1E) seguito da un centraggio finale eseguito all'ingrandimento effettivo dell'acquisizione della serie di inclinazione (Figura 1F) utilizzando la mappa Virtual Preview (Figura 1D).

A partire dalla mappatura della griglia alle 9:30 del mattino, l'acquisizione della serie di inclinazione per i 50 obiettivi iniziali è iniziata alle 15:00circa. Con le impostazioni utilizzate per l'acquisizione tomografica (vedi il riferimento per i dettagli), una serie di inclinazione ha richiesto ~ 20 minuti per acquisire, con abbastanza bersagli da eseguire per tutta la notte. Mentre l'acquisizione era in corso, il resto delle mappe quadrate poteva essere ispezionato e altri obiettivi aggiunti, ancora off-line tramite l'istanza SerialEM fittizia. Altri 121 target sono stati selezionati tra le restanti mappe quadrate e aggiunti al navigatore SerialEM di acquisizione dopo che erano state create mappe virtuali per questi nuovi obiettivi, sufficienti per funzionare fino al completamento della sessione di 72 ore.

Questa procedura (riassunta in Figura 2)ha permesso, in un solo giorno lavorativo, la definizione di 171 target per acquisizioni tomografiche automatizzate per una sessione al microscopio di 72 ore (3 giorni).

Figura 1: Esempio di mappa quadrata con mappe virtuali rappresentative e corrispondenti acquisizioni dopo la centrata. (A) Mappa quadrata rappresentativa di una griglia crioEM Sars-Cov-2 utilizzata in Turonova et al.²⁰. Quattro regioni di interesse sono contrassegnate da una croce rossa. L'ingrandimento del microscopio è 2.250x. (B) Ritaglia la mappa quadrata evidenziando le aree utilizzate per generare le mappe Di visualizzazione virtuale (arancione) e Anteprima virtuale (gialla) per il target selezionato (croce rossa) (C) Mappa di visualizzazione virtuale. (D) Mappa di anteprima virtuale. (E) Acquisizione effettiva della vista dopo la centrata utilizzando la mappa di visualizzazione virtuale come riferimento. L'ingrandimento del microscopio è 11.500x. (F) Acquisizione dell'inclinazione di 0° dalla serie di inclinazione dopo la centrata utilizzando la mappa di anteprima virtuale come riferimento. L'ingrandimento del microscopio è 64.000x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Flusso di lavoro della sessione CryoET utilizzando SerialEM con gli strumenti PyEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Da tecnica di nicchia, la cryoET è ormai maturata in un metodo diffuso per eseguire studi strutturali a livello cellulare e molecolare con risoluzione raggiungibile senza precedenti^21,22. La domanda sempre crescente di imaging crioEM ha messo a dura prova le limitate risorse disponibili per accedere a questa tecnologia. Nonostante l'apertura di una serie di strutture crioEM nazionali e gli sforzi degli istituti scientifici per aumentare la loro capacità TEM di supportare le esigenze della comunità in tutto il mondo, l'accesso agli strumenti crioEM è ancora limitato e il tempo disponibile per la raccolta dei dati deve quindi essere utilizzato in modo efficiente dagli utenti per massimizzare la resa di ogni sessione di microscopia. La necessità di acquisire centinaia di serie di inclinazioni combinata con il tempo limitato disponibile per la raccolta dei dati ha richiesto nuove routine di acquisizione delle immagini per ottenere un throughput migliore senza compromettere la qualità dei dati. I recenti sviluppi nei flussi di lavoro hardware e di imaging hanno notevolmente aumentato la velocità di acquisizione della serie tilt^18,19, determinando così un drammatico spostamento del rapporto tra il tempo impiegato per impostare un punto di acquisizione e il tempo necessario per l'acquisizione della serie di inclinazione effettiva. Complessivamente, la procedura per la creazione di punti di acquisizione sta diventando uno dei principali colli di bottiglia per il throughput raggiungibile delle sessioni cryoET.

Il protocollo ottimizzato qui presentato ci ha permesso di impostare, in modalità off-line, 171 posizioni per l'acquisizione tomografica automatizzata entro il primo giorno di una sessione crioET mentre il microscopio era attivamente impegnato in altre operazioni (ad esempio, mappatura quadrata, messa a punto e acquisizione automatica di serie di inclinazioni), senza quindi influire sul tempo del microscopio disponibile per la raccolta dei dati. Oltre a massimizzare il throughput di una sessione cryoET, questa pipeline riduce drasticamente la quantità di tempo investito dall'utente nella fase preparatoria di una sessione di raccolta dati automatizzata. Nel protocollo descritto, all'utente viene chiesto di sfogliare i quadrati della griglia mappati per identificare le regioni di interesse adatte e aggiungerle al Serial EM Navigator come punti di acquisizione. Tutti i target verranno poi elaborati automaticamente in batch all'interno di SerialEM dallo strumento PyEM per la produzione delle mappe virtuali^16. L'approccio computazionale presentato è quindi notevolmente più veloce rispetto all'acquisizione di mappe di ancoraggio reali eliminando i periodi di attesa associati al movimento del palco, all'acquisizione dell'immagine, al cambiamento delle condizioni di imaging tra View e Preview e all'eventuale reiterazione di questi passaggi mentre si centra ad alto ingrandimento. Inoltre, poiché ogni immagine acquisita porta all'accumulo di dose di elettroni sull'oggetto di interesse^23,l'uso di mappe virtuali per il riallineamento preciso dei bersagli riduce il danno da radiazione introdotto nella fase preparatoria di una sessione crioET prima dell'acquisizione della serie di inclinazione effettiva. Il protocollo qui descritto fa uso di mappe virtuali a ingrandimento sia intermedio che alto (anteprima e vista, rispettivamente) per il riallineamento del target prima dell'acquisizione della serie tilt. Questa procedura può essere facilmente modificata per utilizzare l'ingrandimento intermedio Visualizza immagine quando la precisione di allineamento è di minore importanza, ad esempio, nel caso di strutture di grandi dimensioni in cui la precisione del target finale è di minore preoccupazione¹⁰ o per campioni di analisi di singole particelle che sono scarsamente distribuiti sulla crio-griglia che richiedono la selezione manuale dell'utente di ciascun punto di acquisizione^{24, 25}. Infine, un approccio basato sull'utilizzo off-line di un'istanza SerialEM fittizia facilita anche la configurazione dei punti di acquisizione tramite connessione remota riducendo al minimo la necessità della presenza fisica dell'utente al microscopio, consentendo così una maggiore flessibilità in termini di organizzazione operativa della struttura.

I recenti progressi nella tecnologia e nei metodi per la crioET hanno drasticamente migliorato la velocità e l'affidabilità delle sessioni automatizzate di raccolta dei dati. Tuttavia, sono necessari ulteriori sviluppi per affrontare le restanti fasi di limitazione della velocità di questo metodo. In particolare, la fase iniziale della mappatura della griglia e del quadrato sta diventando uno dei principali colli di bottiglia della configurazione della sessione, generando così la necessità di miglioramenti hardware volti ad aumentare la velocità dei movimenti dello stadio del microscopio e dell'acquisizione di immagini da parte dei rivelatori di elettroni diretti. Inoltre, lo sviluppo di approcci di apprendimento automatico per automatizzare completamente il processo di identificazione del target sarà cruciale per eliminare la necessità dell'ispezione visiva degli utenti per la selezione delle regioni di interesse, una procedura che richiede tempo e si basa sull'esperienza degli utenti.

Materials

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Microscopio			Il nostro protocollo si basa esclusivamente su flussi di lavoro computazionali. L'utente avrà bisogno solo di accedere a un TEM di qualsiasi tipo