Rilevamento e analisi automatizzati dell'esocitosi

Sommario

Abbiamo sviluppato un software automatizzato di visione artificiale per rilevare eventi esocitici contrassegnati da sonde fluorescenti sensibili al pH. Qui, dimostriamo l'uso di un'interfaccia utente grafica e RStudio per rilevare eventi di fusione, analizzare e visualizzare i parametri spaziotemporali di fusione e classificare gli eventi in modalità di fusione distinte.

Abstract

La microscopia TIRF timelapse di GFP pH-sensibile (pHluorin) attaccata alle proteine SNARE delle vescicole è un metodo efficace per visualizzare gli eventi esocitici delle singole vescicole in coltura cellulare. Per eseguire un'identificazione e un'analisi imparziali ed efficienti di tali eventi, è stato sviluppato e implementato in MATLAB un approccio basato sulla visione artificiale. La pipeline di analisi è costituita da una segmentazione cellulare e da un algoritmo di identificazione degli eventi esocitici. L'approccio di visione artificiale include strumenti per lo studio di più parametri di singoli eventi, tra cui l'emivita del decadimento di fluorescenza e il picco ΔF / F, nonché l'analisi a cellule intere della frequenza dell'esocitosi. Questi e altri parametri di fusione sono utilizzati in un approccio di classificazione per distinguere modalità di fusione distinte. Qui una GUI di nuova costruzione esegue la pipeline di analisi dall'inizio alla fine. Un ulteriore adattamento della funzione K di Ripley in R Studio viene utilizzato per distinguere tra evento di fusione raggruppato, disperso o casuale sia nello spazio che nel tempo.

Introduzione

I costrutti VAMP-pHluorin o i costrutti del recettore della transferrina (TfR)-pHuji sono eccellenti marcatori di eventi esocitici, poiché questi fluorofori sensibili al pH vengono spenti all'interno del lume della vescicola acida e fluoresceno immediatamente dopo l'apertura del poro di fusione tra la vescicola e la membrana plasmatica¹. Dopo l'apertura dei pori di fusione, la fluorescenza decade in modo esponenziale, con una certa eterogeneità che rivela informazioni sull'evento di fusione. Qui viene descritta un'applicazione di interfaccia utente grafica (GUI) che rileva e analizza automaticamente gli eventi esocitici. Questa applicazione con....

Protocollo

1. Scegli set di dati e directory

1. Per selezionare i set di dati da eseguire per l'analisi, fare clic sul pulsante Trova set di dati (Figura 2A, casella rossa 1) per passare alla cartella in cui sono depositati i dati (ad esempio, cartella RawData). I file di dati popoleranno automaticamente i file di dati come elenco. Nella cartella possono essere presenti più set di dati.
2. Fare clic sul pulsante Scegli directory e selezionare la directory (ad esempio, Test) in cui verranno depositati i file analizzati (Figura 2A, casella rossa 2

Risultati

Qui la GUI (Figura 2A) è stata utilizzata per analizzare gli eventi esocitici di tre neuroni che esprimono VAMP2-pHluorina a 3 DIV utilizzando la microscopia TIRF (total internal reflection fluorescence). I neuroni corticali E15.5 sono stati isolati, seguiti da trasfezione con VAMP2-pHluorin e placcatura utilizzando i protocolli come delineato in Winkle et al., 2016 e Viesselmann et al., 2011^11,12. La metodologia dei parametri di ima.......

Discussione

Quando si utilizza il software di rilevamento e analisi esocitica, si prega di considerare che il programma accetta solo la compressione senza perdita di dati .tif file come input. I file di immagine .tif possono essere immagini in scala di grigi (canale singolo) a 8 bit, 16 bit o a 32 bit. Altri formati di immagine devono essere convertiti in uno di questi tipi prima dell'input. Per riferimento, gli esempi utilizzati qui sono immagini in scala di grigi a 16 bit.

Inerenti al processo di rileva.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
il team		di	R
Rstudio	Rstudio, PBC		https://rstudio.com/

principale R https://www.r-project.org/